專利名稱：一種小鼠原發性肝癌模型的建立方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種以研究肝癌發生發展機制及抗腫瘤藥物開發為目的的小鼠原發性肝癌模型的建立方法。
二.
背景技術：
原發性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，其死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中居第三位。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數的45％，肝癌的治療亟待進步。理想的肝癌動物模型是抗腫瘤藥物開發、肝癌發生發展機制及診斷治療研究必不可少的實驗工具。故成功地制作肝癌實驗動物模型，對于肝癌相關實驗研究的開展起著至關重要的作用。
原位肝癌動物模型的建立方法大致分為四類，即自發性肝癌模型、誘發性肝癌模型、移植性肝癌模型和轉基因動物肝癌模型，模型動物最常見為鼠。自發性肝癌模型在發生學上與人類肝癌相似，但發生率低且不穩定，發生時間較難預測且參差不齊，荷瘤動物在動物個體(性別、體重、腫瘤發生時間等)和腫瘤(大小、數目、部位等)兩方面差異較大；誘發性肝癌模型最為常用，多采用化學藥物誘發，但誘導周期長(3～5月，甚至1～2年)，操作煩瑣，死亡率高，肝癌出現的時間、部位、病灶數等在個體之間表現不均一，而且這些化學藥物多易揮發，有難聞的氣味，除致癌作用外還有化學毒性，會對試驗動物和實驗操作者自身造成傷害；轉基因動物肝癌模型制作技術要求極高，價格昂貴，國內開展的尚較少。原位移植性肝癌模型周期短、成功率高，是一種較好的動物腫瘤模型。目前移植性肝癌模型根據植入物可分為瘤組織塊肝原位移植和細胞懸液肝原位移植。韓克起等人用H22細胞株接種于ICR小鼠皮下形成實體瘤，再將瘤組織接種于小鼠肝內形成肝原位移植瘤模型。在韓等的實驗中，制作程序繁瑣，成功率較低，且該模型需先在小鼠皮下種植形成實體瘤，故每次實驗內移植的瘤組織塊不能來自于同一鼠體，切割的組織塊大小不易一致，內容物不均一，且含有其他非癌組織，這會嚴重影響實驗的重復性和可靠性，并不能完全真實反映抗肝癌藥物的作用效果。李琦等和邵成偉等采用Walker-256細胞肝內注射建立了大鼠移植型肝癌模型，模型采用的Walker-256細胞株在植入肝內后，雖能較好地模擬人肝癌的膨脹性和浸潤性生長方式，但該細胞株來源于Wistar大鼠乳腺自發的癌肉瘤，而非肝癌組織，故該模型不能很好的模擬肝癌的發生發展過程，更不能滿足抗肝癌藥物研發篩選、肝癌分子生物學研究的需要。加之大鼠價格較貴且需要較大的飼養空間，不易大批制作。現有的人-裸小鼠異種移植性肝癌模型雖有較高的移植成功率，但裸小鼠免疫系統缺陷，不能反映正常生物體的真實情況，無法研究免疫系統在肝癌發生中的作用以及對肝癌后續發展的影響，不能模擬藥物在機體中的正常代謝。另外裸鼠-人肝癌移植模型技術要求高，裸鼠術后成活率低，且無菌要求高、飼養困難、價格昂貴，因此這種模型的實用性受到了很大的限制。已存在的各種肝癌動物模型都有一定的缺陷，無法滿足目前生物醫藥領域的需求。
三.

發明內容
本發明需要解決的問題是建立一種原發性肝癌小鼠模型的方法，該方法建立的模型能滿足研究原發性肝癌發生發展及轉移的機制、同時也適用于抗腫瘤藥物開發、肝癌的實驗性治療及診斷研究的需要。既能真實地模擬原發性肝癌的生物學特性又簡單、迅速、成功率高且價格低廉可以大批制作。
實現上述目的的技術解決方案如下小鼠原發性肝癌模型建立的方法為選用HepS細胞株，該細胞株是小鼠肝癌細胞株，在ICR小鼠腹腔內培養，制成HepS腹水癌小鼠，保種傳代簡單方便；選用ICR小鼠作為模型動物，該小鼠是我國常用的實驗動物品系，穩定性、一致性好，易于獲得、繁殖，所需飼養空間小，飼養、管理費用非常便宜；HepS腹水癌小鼠的腹水內有大量HepS細胞，可供多次大量制作動物模型，保證了動物模型的一致性，同時由于該細胞已經適應ICR小鼠體內環境，同種移植，增加了細胞肝內移植的成功率；抽取腹水離心棄上清后加入預冷的Hank’s液吹打沖洗1000rpm離心后棄上清，重復以上過程2-3次，再加入預冷的Hank’s液吹勻后500rpm離心，紅細胞留于上清，棄上清保留沉淀細胞，加入DMEM細胞培養基制成HepS細胞懸液，以此步驟除去腹水中HepS細胞以外的其他成分，減少未知成分對模型動物的影響；將ICR小鼠以戊巴比妥鈉麻醉，固定后于小鼠劍突下分層剪開皮膚和腹膜，將小鼠肝左葉按壓出切口，用微量注射器抽取1×107×5μL細胞懸液注射入小鼠肝臟；微量注射器拔出后立即以75％酒精棉簽按壓針孔至肝臟表面不再滲血，以此步驟殺死漏出的少量細胞，并可避免細胞懸液漏出肝臟；用α-氰基丙烯酸鹽乙酯粘合劑封閉針孔，以防止HepS細胞滲出流入腹腔后造成的腹腔內廣泛轉移灶而導致腫瘤種植失敗；以生理鹽水沖洗肝臟表面，既能防止穿刺孔漏出的HepS細胞進入腹腔導致模型失敗，又能濕潤暴露的肝臟減少對小鼠的損傷，提高術后存活率。
本發明的有益效果是，用此方法建立的肝癌模型具有以下特點(1)腫瘤位于肝臟，且以單發性為主；腫瘤生長與血供特征與人類原發性肝癌相似；出現血道轉移(肝內及肺轉移)和淋巴道轉移；(2)腫瘤為肝癌組織，生物學特性穩定而均一，其病理形態與人的肝癌結節相似；(3)腫瘤形成周期短、腫瘤生長快、病程發展快、患體生存期短，腫瘤可控性好且生長環境符合真實機體情況；(4)操作安全簡單，操作所致死亡率低，動物模型穩定性、重復性好、成功率高；(5)可大批制作且同步性好，適用于藥物篩選及較大規模的實驗性治療；(5)模型動物廉價，易于飼養。故該模型是一種可以用于研究原發性肝癌發生發展機制、同時也適用于抗腫瘤藥物開發、肝癌的實驗性治療及診斷研究的理想的原發性肝癌模型。
四.


下面結合附圖和實施例對本發明結果進一步說明。
圖1是模型小鼠手術后五十天斷頸處死后打開腹腔的全照，劍突下肝左葉注射部位可見白色腫瘤結節。
圖2是模型小鼠腹腔近照，結節大小約為1.3cm×1.1cm，腫瘤境界不清，附近有附生的小結節。
圖3是模型小鼠全肝(左)與注射DMEM培養基的對照組小鼠全肝(右)對照圖，可見模型小鼠肝臟明顯腫大，符合原發性肝癌的臨床表現。
圖4是模型小鼠肝左葉(左)與注射DMEM培養基的對照組小鼠肝左葉(右)對照圖。
圖5是模型小鼠肝全肝(左)、脾臟(左)與注射DMEM培養基的對照組小鼠全肝(右)、脾臟(右)對照圖。
圖6是模型小鼠肝脾臟(左)與注射DMEM培養基的對照組小鼠脾臟(右)對照圖，可見模型小鼠脾臟明顯腫大，符合原發性肝癌的臨床表現。
圖7是模型小鼠全肝近照。
圖8是模型小鼠肝左葉腫瘤結節近照。
圖9是腫瘤侵入遠離腫塊的門管區的病理照片(40×)。
圖10是門管區的腫瘤細胞的病理照片(200×)。
圖11是腫瘤組織內血管的病理照片(50×)。
圖12是腫瘤壞死區的病理照片(200×)。
圖13是肝癌轉移侵入顱骨的病理照片(100×)。
圖14是肝癌轉移侵入胸廓的病理照片(100×)。
圖15是肝癌轉移侵入胸膜下的病理照片(200×)。
圖16是肝癌轉移侵入胰腺的病理照片(100×)。
五.
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明做進一步說明。
用注射器從HepS腹水癌小鼠的腹腔內抽取腹水2mL，置于離心管內，1000rpm離心，棄上清。加入5mL預冷的Hank’s液重懸、吹洗，再1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預冷的Hank’s溶液以同樣方法重復洗一遍。在沉淀內加入5mL預冷的Hank’s溶液吹散細胞，500rpm離心3分鐘。用精密移液器將上清和沉淀上層的紅細胞取出，保留下層白色細胞沉淀。用1mLDMEM培養基重懸細胞，計數，再加入適量DMEM培養基稀釋成1×107個/mL的細胞懸液備用。將ICR小鼠以50mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后固定。在上腹部備皮，再以碘伏消毒、75％酒精脫碘。在小鼠劍突下沿腹白線剪開1cm切口，用止血鉗將皮膚與腹膜鈍性分離，以生理鹽水濕潤。在腹膜上沿腹白線切開0.8cm切口。輕壓小鼠腹腔兩側使小鼠肝左葉突出腹腔，用微量注射器抽取1×107×5μL細胞懸液以30度注射入肝葉，出針后立即用75％酒精棉簽按壓至肝臟表面無滲血(約30秒)后，用少量α-氰基丙烯酸鹽乙酯粘合劑涂抹于針孔，待干后用生理鹽水沖洗暴露的肝葉。將肝葉輕輕送回腹腔，連續縫合腹膜，間斷縫合皮膚。以75％酒精擦拭切口后，涂抹一層金霉素眼藥膏。待小鼠蘇醒后送回動物房，保證食水供應。兩周后將小鼠斷頸處死，切開皮膚腹膜，可見在小鼠肝臟和脾臟明顯腫大，肝左葉注射部位有明顯的單發白色結節，約0.3cm×0.4cm。取肝和肺在福爾馬林溶液中固定保存后做病理切片檢查。經東南大學基礎醫學院病理教研室病理檢查結論為原位移植瘤形態相對規則，成圓形或橢圓型，腫瘤有包膜或包膜不完整，表面呈大小不等結節狀改變，以浸潤性生長為主，外周有明顯增粗血管；肝內有大量腫瘤組織生長，種植瘤細胞形成腫塊，腫塊內瘤細胞異型性明顯，大小、形態不一，核大、深染、核分裂相易見。腫瘤內有血管浸潤豐富。腫瘤細胞排列緊密，與周圍的肝組織分界較為明顯，但有的部位瘤細胞已形成小團塊浸潤于遠離腫瘤的門管區和正常肝小葉內。腫瘤組織壞死明顯，呈大片凝固性壞死，少數區域有少量出血，出血區或腫瘤與正常肝組織交界處有少量單核細胞及中性粒細胞浸潤。在顱骨、胸廓、胸膜、胰腺發現轉移灶。此方法建立的模型小鼠肝癌發生率為100％，自然消退率為零，可以模擬出人類肝癌病程中常見的臨床癥狀，如原發性肝癌的消瘦、水腫、肝脾腫大、腹水、黃疸、癌灶轉移、消化道出血、肝癌腫塊破裂出血等。尤其重要的是該方法很好的解決了注入的細胞懸液沿針道返流入腹腔后造成模型小鼠因形成腹水癌衰竭致死而導致腫瘤種植失敗的技術瓶頸，為進一步建立其他臟器的原發或繼發性癌癥移植模型奠定了基礎。以此方法建立的原發性肝癌小鼠模型的效果大大優于目前已有的原發性肝癌動物模型，具有更加真實性和實用性。
權利要求
1.一種小鼠原發性肝癌模型的建立方法，其特征在于選用HepS細胞株，選用的ICR小鼠是我國常用的實驗動物品系，將HepS細胞保種培養在ICR小鼠腹腔中，抽取腹水，分離細胞并制成細胞懸液，用微量注射器抽取細胞懸液注射入小鼠肝臟，用75％酒精棉簽按壓針孔至肝臟表面不再滲血，用α-氰基丙烯酸鹽乙酯粘合劑封閉針孔，以生理鹽水沖洗肝臟表面。
2.根據權利要求1所述小鼠原發性肝癌模型的建立方法，其特征在于細胞懸液的制備方法抽取腹水，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入預冷的Hank’s溶液吹打洗滌沉淀，1000rpm離心5分鐘后棄上清，重復洗滌過程2-3次，再加入預冷的Hank’s溶液吹勻后500rpm離心3分鐘，紅細胞留于上清，棄上清保留沉淀細胞，加入DMEM細胞培養基制成HepS細胞懸液。
3.根據權利要求1所述，其特征在于小鼠原發性肝癌模型的建立方法將ICR小鼠以戊巴比妥鈉麻醉，固定后于小鼠劍突下分層剪開皮膚和腹膜，將小鼠肝左葉按壓出切口，用微量注射器抽取1×107×5μL細胞懸液注射入小鼠肝臟。
4.根據權利要求1所述方法建立的原發性肝癌小鼠模型在研究肝癌發生發展機制中的應用。
5.根據權利要求1所述方法建立的原發性肝癌小鼠模型在制備治療腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種以研究肝癌發生發展機制及抗腫瘤藥物開發為目的的小鼠原發性肝癌模型的建立方法。從HepS腹水癌小鼠腹腔內抽取腹水，分離細胞并制成細胞懸液，打開小鼠腹腔，用微量注射器抽取細胞懸液注射入小鼠肝臟，用75％酒精棉簽按壓針孔至肝臟表面不再滲血，用α－氰基丙烯酸鹽乙酯粘合劑封閉針孔，再以生理鹽水沖洗肝臟表面，分層關腹。結果顯示模型小鼠肝癌發生率為100％，自然消退率為零。該模型是一種可以用于研究原發性肝癌發生發展的機制、同時也適用于抗腫瘤藥物開發、肝癌的實驗性治療及診斷研究的理想的原發性肝癌模型。
文檔編號A61P35/00GK1966087SQ200610146648
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月10日 優先權日2006年7月25日
發明者張煜, 徐涵文, 沈萍萍 申請人:南京大學