一種經盲腸系膜三角建立的小鼠結腸癌原位種植模型及其方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種接種于盲腸系膜三角的小鼠結腸癌原位荷瘤模型及其建立方法。
【背景技術】
[0002]結腸癌是一種嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤。遠處轉移和浸潤性生長是人類結腸癌致死的主要原因，現代研宄通過對患結腸癌死亡的患者進行尸檢證實，其中約60% -70%的患者存在肝臟轉移。因此，建立一種易于觀察、生物學行為更為接近于臨床表現的結腸癌肝轉移動物模型，對于了解結腸癌生長、演進、轉移的過程及正確評價各種治療方案的療效等都具有重要意義。
[0003]目前，常用于建立小鼠結腸癌模型的方法包括自發及原位誘發小鼠結腸癌模型和移植性小鼠結腸癌模型，后者根據移植物分為細胞移植和組織移植，根據部位的不同，又可分為皮下移植、肝臟移植和原位移植。現有技術的結腸癌小鼠模型要么制備周期長、成瘤均一度差；要么未能完全模擬自然轉移過程、并發癥多；要么制備操作復雜、成功率較低、模型不穩定。由于小鼠腸壁菲薄纖細，注射針極易刺穿腸壁，致使結腸壁原位注射手術難度較大，或者因為刺穿腸壁，導致腫瘤接種失敗，或者由于漏液造成腸外腹腔多處種植。即使成功致瘤，也易于出現因接種部位腫瘤組織呈團塊狀生長過大，造成腸腔梗阻，導致小鼠死亡。
[0004]因此，有必要繼續改進小鼠結腸癌小鼠模型的制備方法。為了解決上述問題，本發明由此而來。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題針對現有結腸癌建立模型周期長、不穩定的缺陷，提供一種高轉移、高浸潤、穩定的小鼠結腸癌原位種植模型的制備方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明的第一方面提供一種經盲腸系膜三角建立小鼠結腸癌原位種植模型的方法，包括以下步驟:
[0007](I)制備、培養結腸癌細胞懸液，
[0008](2)將小鼠麻醉后，無創固定在手術臺上，手術切開腹部曝露盲腸，在盲腸體部順盲腸軸位進針至盲腸系膜三角，回抽無血后，緩慢注射結腸癌細胞懸液，退針后輕輕按壓注射部位，確定無注射液滲出，
[0009](3)縫合小鼠腹膜和腹壁肌肉層，最后縫合皮膚，令其自然生長并觀察。
[0010]本發明的優選技術方案中，所述步驟(I)中的結腸癌細胞懸液的濃度為(2.5±0.5) X 17個/ml，每只小鼠注射20?50 μ I。
[0011]本發明的優選技術方案中，所述步驟(2)中所用的注射針頭規格為不大于0.4Χ 13mm0
[0012]本發明的優選技術方案中，所述步驟(2)中的注射部位為盲腸系膜三角，注射后，結腸癌細胞懸液分布于盲腸系膜附著處，部分液體可擴散至盲腸系膜附著處兩側的漿膜下。
[0013]本發明的優選技術方案中，所述小鼠形成結腸癌腫塊后，位于盲腸系膜一側，腫塊沿盲腸軸位分布，短期內不易發生腸腔梗阻導致小鼠死亡。
[0014]本發明的優選技術方案中，所述小鼠形成結腸癌腫塊后，位于盲腸系膜一側，易于侵犯腸系膜血管和淋巴管，遠處轉移發生率高。
[0015]本發明的優選技術方案中，所述小鼠不必進行禁食禁水腸道準備。
[0016]本發明的第二方面，提供一種前述方法得到的經盲腸系膜三角建立的小鼠結腸癌原位種植模型。
[0017]在人體解剖學概念中，血管、淋巴管和神經進出腸壁的部位稱為系膜緣，系膜緣處的腸壁與兩層腹膜圍成腸系膜三角，此處腸壁無漿膜覆蓋。對應于人體解剖學概念的“系膜緣”，在小鼠解剖學上稱為“腸系膜附著處”，小鼠解剖學上沒有“系膜三角”的概念，為表述方便，本文將小鼠盲腸系膜附著處的腸壁與兩層腹膜圍成的三角形區域定義為“盲腸系膜三角”，此處腸壁無漿膜覆蓋，有血管、淋巴管和神經在此處進出(圖1)。盲腸系膜三角橫截面呈三角形，組織間隙相對寬松，在此處進行注射操作，進針方便，易于掌握。本研宄即嘗試在“盲腸系膜三角”注射腫瘤細胞懸液用于制備小鼠結腸癌原位種植及肝轉移模型。
[0018]本發明結腸癌原位荷瘤模型的制備方法的優點:
[0019](I)在盲腸系膜三角，作為腫瘤建立區域，該局部有盲腸系膜動脈，血供豐富，腫瘤易于生長；
[0020](2)盲腸系膜三角處腸壁無漿膜覆蓋，使結腸癌細胞易于種植生長，接種的腫瘤細胞直接接觸盲腸壁，是真正的結腸原位成瘤；
[0021](3)本發明的方法接種于盲腸部位，該處腸腔寬大，注射后形成的水泡沿盲腸系膜附著處呈條帶狀分布，張力小，不易發生滲漏，最終形成的腫瘤位于盲腸系膜一側，沿盲腸軸位分布，加之盲腸腸腔寬大，短期內不易發生因腸腔梗阻導致的小鼠死亡；
[0022](4)本發明的方法通過注射腫瘤細胞懸液建立模型，易于控制腫瘤細胞注射劑量，腫瘤形成均一度好，有利于后繼實驗的開展；
[0023](5)盲腸系膜動、靜脈和淋巴管在盲腸系膜三角進出腸壁，血供豐富，血液回流于門靜脈系統，該部位腫瘤較易于侵犯腸系膜血管和淋巴管，使結腸癌易于發生遠處轉移，尤其是肝轉移發生率高，其轉移路徑符合人結腸癌轉移特點，能完全模擬結腸癌自然轉移發生過程；
[0024](6)本發明的方法，實驗小鼠不必進行禁食禁水等腸道準備，手術時程短，手術風險小，對小鼠的創傷小，不易損傷結腸壁，手術操作簡單，穿刺注射容易，整套技術易于掌握，建模成功率高，實用性強；
[0025](7)本發明的方法所建立的小鼠結腸癌原位種植模型將在結腸癌的發生、發展及轉移機制研宄，抗結腸癌藥物的研發，結腸癌的預防等方面發揮一定的價值。
【附圖說明】
[0026]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
[0027]圖1A，IB為盲腸系膜三角結構示意圖，其中I為盲腸，2為盲腸系膜三角，為本發明的注射區域，3為漿膜，4為腸系膜血管；圖1B為IA的橫切面結構。
[0028]圖2為本發明的經小鼠盲腸系膜三角注射結腸癌腫瘤細胞懸液(含I %臺盼藍，起示蹤作用)的手術過程:
[0029]圖2A，小鼠經10%水合氯醛麻醉后，無創固定在手術臺上。紅色慮線示手術切口位置。
[0030]圖2B，曝露盲腸，可見內含大量腸內容物。藍色箭頭示盲腸系膜；
[0031 ] 圖2C，將結腸癌腫瘤細胞懸液(50 μ I)在盲腸體部順盲腸軸位注射至盲腸系膜三角(針頭規格:0.4X 13_)，黃色箭頭示進針位置；
[0032]圖2D，注射的結腸癌腫瘤細胞懸液分布于小鼠盲腸系膜附著處，部分液體擴散至盲腸系膜附著處兩側的漿膜下(白色箭頭示藍黑色區域)。
[0033]圖2E，縫合腹膜和腹壁肌肉層。
[0034]圖2F，縫合皮膚。
[0035]圖3為結腸癌原位腫瘤形成和器官轉移情況:
[0036]圖3A顯示結腸原位荷瘤小鼠腹腔內含大量暗紅色血性腹水；
[0037]圖3B顯不曝露腹腔，#:肓腸，*:腫瘤；
[0038]圖3C顯示結腸癌肝轉移灶(黃色箭頭示)，圖C為圖B的局部放大；
[0039]圖3D顯示結腸癌橫膈轉移灶(白色箭頭示)；
[0040]圖3E為離體的部分消化道和腫瘤，#:肓腸，*:腫瘤。
[0041]圖3F為小腸系膜淋巴結轉移(藍色箭頭示)；圖2F為圖2E的局部放大。
[0042]圖3G顯示脾臟腫大，出現結腸癌轉移灶。
[0043]圖4A，4B為本發明建立得到的小鼠結腸癌原位荷瘤模型一實施例的超聲檢查結果O
[0044]圖5A，5B，5C為本發明建立得到的小鼠結腸癌原位荷瘤模型MRI檢查結果圖。
[0045]圖6為本發明建立得到的小鼠結腸癌原位荷瘤模型一實施例的病理組織學檢查圖像。
【具體實施方式】
[0046]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅