專利名稱：選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑及其制備方法。該制劑包括納米級的活性炭載體和抗胃癌藥，屬于一種用于胃癌治療的新的靶向制劑。
背景技術：
目前胃癌的根治療法為手術切除。預防術后復發和轉移的主要措施為化療。但手術療法不能徹底解決胃癌的轉移和復發，術中所造成的癌細胞種植轉移也屢見不鮮。化療是不能手術的晚期胃癌及預防胃癌根治術后復發和轉移的主要輔助手段。對于化療，目前并非是因為抗癌藥物不能殺死癌細胞，而是因為化療藥物缺乏對癌細胞的選擇性，在殺死癌細胞的同時也殺死正常細胞，尤其是骨髓造血系統對循環中的抗癌藥物最為敏感。造成化療失敗的原因，往往是機體不能耐受藥物毒性而不得不停藥。因此，找到選擇性殺滅癌細胞的藥物或使藥物能選擇性地作用于癌組織或癌細胞，減少進入體循環的藥物的量，減少其對正常組織和細胞的損傷作用，將能對癌癥進行有效的治療，避免或減少術后復發和轉移，提高患者的無瘤生存期或使癌癥得到徹底治療。
用活性炭作為載體吸附抗癌藥進行腹腔化療和淋巴化療是近些年興起的針對于胃癌轉移和復發而采取的一種高選擇性、高濃度、超強化的化療手段。其基本原理在于活性炭的淋巴組織趨向性及對吸附抗癌藥的緩釋特性。活性炭吸附抗癌藥改變了抗癌藥的劑型，與常規抗癌藥水溶液相比，具有5個突出的特點(1)高吸附性和功能緩釋性；(2)淋巴組織趨向性；(3)局部滯留性；(4)腫瘤表面的附著性；(5)毒副作用小。由于活性炭的高吸附性，因而可以吸附大量的抗癌藥。活性炭微粒的粒徑較大，可以進入淋巴管而不能被血管吸收。在被注射于腹腔、腫瘤局部區域或其引流淋巴結后，就只能沿淋巴系統移行，并在淋巴結內聚集，因而具有很高的淋巴組織趨向性，并在淋巴系統內長期存留。由于其吸附的抗癌藥量大，又具有功能緩釋性，因而能夠使其周圍抗癌藥長期維持于高濃度，殺滅淋巴系統內的轉移癌灶及游離癌細胞，起到殺滅手術不能清除的微小癌灶及癌細胞(臨床稱之為化學清除)的作用，因此能有效地防止癌的復發。同時由于其長期存在于癌轉移的必經之路上，因此能有效地阻斷癌的轉移。長期存在于癌區淋巴組織內的吸附抗癌藥的活性炭，還可以對癌組織發揮直接的殺傷作用。由于活性炭可附著于癌細胞表面，在癌細胞的表面釋放抗癌藥，因而更利于抗癌藥物作用的發揮。由于活性炭不能通過血管吸收進入血液循環，因而抗癌藥也很少或者不能進入血液循環，因此不會或很少對血液系統、骨髓等其它正常或敏感組織造成損害，有效地減少抗癌藥的毒、副作用。
在述及活性炭吸附抗癌藥對胃癌進行腹腔化療和淋巴化療的諸多優越性時，臨床實踐中還注意到活性炭在用于腹腔化療時還存在著一些問題，限制腹腔化療和淋巴化療的應用。一是目前所用的活性炭的粒徑較大，為微米級，如進入血液循環，有造成栓塞的危險；二是目前所用的活性炭微粒形態不規則，容易刺激局部組織，引起炎癥，造成腹腔粘連；三是目前沒有用于胃癌腹腔化療和淋巴化療的專用制劑，往往是臨床醫生自己在手術時將活性炭與抗癌藥混合后使用。因此不僅使用不便，而且制備過程不標準，吸附量不規則，且容易造成感染。以上內容參見Jansen M等，Effects of intraperitonealmitomycin C adsorbed on activated carbon on adhesion formationand mesothelial cells in vitro，Eur.J.Surg.，2000，166，572-6。
發明簡述本發明人通過研究發現，將活性炭制成納米級活性炭顆粒，然后將所得到的納米級活性炭顆粒與已知的抗癌藥組合制成納米級制劑，可以使抗癌藥選擇性靶向胃癌組織和淋巴系統，同時不會造成栓塞和腹腔粘連，從而解決了現有技術中的上述缺陷。
因此，本發明的一個方面提供了一種選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑，該制劑包括納米級活性炭和抗癌藥。
本發明的另一個方面提供了一種制備選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑的方法，該方法包括以下步驟將抗癌藥制成水溶液；將納米級活性炭置于抗癌藥水溶液中，在一定條件下進行吸附；吸附完畢后，除去水分，得到納米級活性炭-抗癌藥；將納米級活性炭-抗癌藥進行分裝、密封、滅菌、避光保存。
發明詳述如上所述，本發明的一個方面提供了一種選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑，該制劑包括納米級活性炭和抗癌藥。
在本發明的納米級制劑中，納米級活性炭可通過使用球磨機球磨市售活性炭或市售醫用活性炭制備。在所得的納米級活性炭中，優選粒徑為10-800nm的活性炭粒子占粒子總數的95％以上，并且優選其平均粒徑為299±150nm。
在本發明的納米級制劑中，抗癌藥可以是常用的抗胃癌藥，例如絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶等，優選絲裂霉素C。
在本發明的納米級制劑中，納米級活性炭與抗癌藥，如絲裂霉素C的重量比可以為4∶1-18∶1，優選為8.5∶1。
本發明的納米級制劑還可以包括其它藥學上可接受的分散穩定劑，例如吐溫-80、右旋糖苷、豆磷脂、去氧膽酸鈉等。
本發明的另一個方面提供了一種制備選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑的方法，該方法包括以下步驟將抗癌藥制成水溶液；
將納米級活性炭置于抗癌藥水溶液中，在一定條件下進行吸附；吸附完畢后，除去水分，得到納米級活性炭-抗癌藥；將納米級活性炭-抗癌藥進行分裝、密封、滅菌、避光保存。
在上述制備方法的一個優選實施方案中，納米級活性炭與抗癌藥，如絲裂霉素C的重量比可以為4∶1-18∶1，優選為8.5∶1。
在上述制備方法的另一個優選實施方案中，可以使用蒸餾水將抗癌藥制成水溶液。其中，蒸餾水與抗癌藥，如絲裂霉素C的重量可以為6∶1-25∶1，優選為12.5∶1。
在上述制備方法的另一個優選實施方案中，可以在超聲振蕩條件下進行吸附操作。其中吸附時間可以為20-60分鐘，優選為30分鐘。
在上述制備方法的另一個優選實施方案中，可以使用常規的方法除去水分，優選使用冷凍減壓干燥法除去水分。
在上述制備方法的另一個優選實施方案中，可以使用玻璃安瓶進行分裝。分裝后每個玻璃安瓶(10ml)中納米級活性炭的含量可以為0.85-3.4g，優選為1.7g；而每個玻璃安瓶(10ml)中抗胃癌藥的含量可以為0.1-0.4g，優選為0.2g。
本發明的納米級制劑主要用于胃癌腹腔化療和淋巴化療，以防止胃癌的復發和轉移；也可用于根治術前或術中標記淋巴結并殺滅其中的微小轉移癌灶，同時起到指導手術清除和化學清除的作用，以預防胃癌的復發和轉移；還可用于胃癌性腹膜炎及胃癌性腹水的治療。
使用時，用生理鹽水稀釋作胃漿膜下、淋巴結、癌區、癌組織注射或腹腔注射，用于胃癌腹腔化療和淋巴化療、胃癌引起的癌性腹膜炎和癌性腹水；也可用于癌手術時標記淋巴結，指導手術清除或轉移淋巴結的“化學清除”。
本發明的選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑具有如下新的特點1、由于載體粒子粒徑為納米級，遠小于毛細血管直徑，因此即使本發明的納米級制劑進入循環，也不會造成栓塞；2、由于在制備本發明的納米級活性炭時，球磨機對活性炭進行長時間的研磨，使其在形態成為近球形，且表面變得平滑，因此本發明的納米級制劑在腹腔注射后對腹膜的刺激性減小，因此較少引起炎癥，因而也很少或不引起腹膜粘連；3、由于本發明的納米級制劑的制備過程統一，吸附時間恒定，活性炭與抗癌藥的比例規則，因此使劑量的使用更為規則，因而可收到更好的療效；4、特殊制備的本發明的納米級制劑，可經常規滅菌處理，避免了臨床應用時臨時配制，由于未經滅菌過程而很容易造成感染的弊病；5、制備出本發明的納米級制劑，省去了臨時吸附制備的麻煩，方便應用。這種納米級制劑不僅可在具有手術條件的高級醫院使用，也可以在沒有手術條件的鄉村使用；6、所用的納米級活性炭比目前所用的微米級活性炭具有更強的吸附抗癌藥的能力，經腹腔或淋巴結注射后可以使腹腔內或注射局部組織內的有效藥物濃度保持更長時間；7、納米級活性炭本身的毒性較微米級活性炭降低，使用時具有更好的安全系數；8、在實驗性腹腔化療中，納米級活性炭較微米級活性炭具有更好的療效，抑癌率可達85％以上；9、本發明的納米級制劑中的抗癌藥優選采用絲裂霉素C。絲裂霉素C的殺滅胃癌細胞的量效關系呈指數性，因此用此納米級制劑提高其在癌組織、腹腔及淋巴系統中的濃度后，明顯提高對胃癌的治療效果且能有效地減少復發和轉移。
具體實施例方式
以下結合實際應用，對本發明的選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑的制備方法及應用作進一步的說明。這些實例僅用于說明本發明，而不起限定作用。
實施例1納米級活性炭的制備取市售醫用活性炭(北京大力精細化工廠)約40g，裝入行星牌球磨機球磨60小時。然后取球磨后的活性炭3g加三次蒸餾后的水3000ml充分混勻，靜置72小時，待在容器底部可見明顯沉淀，其上層液體透明，沉淀與上清界限分明時，取上清置1000ml不銹鋼濾器中，通過0.22μm的微孔濾膜加壓濾去水分，在烘箱中于120℃烘烤2小時。最后再用三次蒸餾后的水稀釋，用原子力顯微鏡進行檢測并進行粒度分析。原料40g醫用活性炭可重復利用，除去損耗，最后所得納米級活性炭的產量為38g。
實施例2本發明納米級制劑的制備取按照實施例1的方法制備的納米級活性炭102g和日本協和制藥株式會社生產的抗癌藥絲裂霉素C12g；將絲裂霉素C溶于150ml無菌、無熱原蒸餾水中；將納米級活性炭置于絲裂霉素C溶液中，在超聲振蕩條件下吸附30分鐘；用冷凍減壓干燥法除去水分，得固體干燥物114g；將114g的納米級活性炭-絲裂霉素C分裝于60個10ml玻璃安瓶中，每瓶含納米級活性炭和絲裂霉素C各為1.7g和0.2g；也可以將114g納米級活性炭-絲裂霉素C分裝于120個10ml的玻璃安瓶中，每瓶含納米級活性炭0.85g，絲裂霉素C 0.1g；也可以將114g的納米級活性炭-絲裂霉素C分裝于30個10ml的玻璃安瓶中，每瓶含納米級活性炭-絲裂霉素C 3.8g，其中納米級活性炭和絲裂霉素C的含量各為3.4g和0.4g；將玻璃安瓶密封；高溫高壓滅菌120分鐘，避光保存。
通過以上制備方法，得到以下不同規格的納米級制劑1)納米級活性炭1.7g+絲裂霉素C 0.2g/10mL玻璃安瓶；2)納米級活性炭0.85g+絲裂霉素C 0.1g/10mL玻璃安瓶；3)納米級活性炭3.4g+絲裂霉素C 0.4g/10mL玻璃安瓶。
實施例3本發明納米級制劑的生物活性測試除了給藥時間不同之外，測試方法的其余部分參見梁寒等，活性炭吸附絲裂霉素C腹腔化療的臨床實驗研究，中國腫瘤臨床，2000，27，897-901；李義生等，淋巴化療對胃癌淋巴轉移灶的臨床治療研究，中國腫瘤臨床，2001，28，771-774。
取實施例2制備的納米級制劑對裸鼠人胃癌腹腔種植轉移模型進行了實驗性腹腔化療。結果表明這種納米級制劑對種植轉移的癌灶具有明顯的殺滅作用，療效明顯優于游離絲裂霉素C腹腔化療和用微米級活性炭吸附絲裂霉素C腹腔化療，結果見表1。
表1.本發明納米級制劑對人胃癌裸鼠腹腔種植膜型的腹腔化療作用

Mean±SD，n＝8。*p＜0.05，與生理鹽水組比較；#p＜0.05，與游離絲裂霉素C組比較。BALB/C-nu裸鼠，4周齡，體重12-15g，人胃癌裸鼠移植模型細胞懸液(1.3×10-6)腹腔接種后第十二天開始給藥，于給藥后第二十二天處死，解剖觀察腫瘤生長情況，取瘤在萬分之一天平上稱重，用SPSS11.0統計軟件進行數據處理，單因素方差分析檢測組間差異。
這種制劑及早給藥明顯減少腹腔種植胃癌的轉移范圍和轉移癌灶的數目，在部分裸鼠胃癌腹腔種植模型上，可完全避免胃癌的發生和轉移，結果見表2、表3。
表2.本發明納米級制劑對種植胃癌的抗轉移和抗復發作用

Mean±SD，n＝8。*p＜0.05，**p＜0.01與生理鹽水組比較；#p＜0.05，##p＜0.01與絲裂霉素C 6mg/kg組比較。BALB/C-nu裸鼠56只，6周齡，體重16g-20g，隨機分7組，每組8只，雌雄各半。腹腔接種人胃癌裸鼠移植模型細胞懸液(1.6×106)，接種1小時后給藥，給藥后第28天解剖觀察，取腫瘤稱重。
表3.本發明納米級制劑對腫瘤播散及生長情況的影響

應用SPSS10.0統計軟件包，列聯表資料分析(Crosstabs)，分層資料的χ2檢驗表明2、3、4、5、6、7組與1組(生理鹽水對照組)比，P均＜0.01，表明在瘤細胞腹腔接種后立即腹腔注射藥物，單純MMC、活性炭與MMC混勻后注射與本制劑均有明顯抑制腫瘤播散的效果。4、5、6組與2組比，P均＜0.01；6組與3組比，P＜0.05，表明由于吸附MMC活性炭具有功能性緩釋性，因此其抑瘤效果優于單純MMC。6組與4組比，P＞0.05，表明MMC劑量相同情況下，本制劑具有與文獻報道活性炭吸附MMC同樣優良的抑制腫瘤播散及腫瘤生長的效果。5組與4組相比p＜0.05，表明活性炭納米化后，可以進一步加大劑量，取得更為明顯的抗復發轉移效果。6組與5組比，P＞0.05；7組與5組比，P＜0.01；7組與6組比，P＞0.05，表明制劑的抗癌活性具有一定的量效關系。從表中還可以看到，第5組8只動物有四只沒有腫瘤發生，所有8只小鼠均沒有腸壁外部位的轉移癌灶，表現出良好的抗轉移效果。第一組生理鹽水對照；第二組絲裂霉素C6mg/kg ip；第三組絲裂霉素C0.36mg/kg ip；第四組絲裂霉素C-活性炭51mg(含絲裂霉素C6mg，納米級活性炭45mg)/kg ip；第五組絲裂霉素C-納米級活性炭153.9mg(含絲裂霉素C18mg，納米級活性炭135.9mg)/kg ip；第六組絲裂霉素C-納米級活性炭51.3mg(含絲裂霉素C 6mg，納米級活性炭45.3mg)/kgip；第八組絲裂霉素C-納米級活性炭17.1mg(含絲裂霉素C2mg，納米級活性炭15.1mg)/kg ip。BALB/C-nu裸鼠56只，6周齡，體重16g-20g，隨機分7組，每組8只，雌雄各半。腹腔接種人胃癌裸鼠移植模型細胞懸液(1.6×106)，接種1小時后給藥，給藥后第28天解剖觀察，取腫瘤稱重。
這種納米級制劑在發揮良好的抗胃癌轉移和復發的同時，可有效地減輕絲裂霉素C的毒副作用。在劑量為游離絲裂霉素C致死劑量的2.8倍的情況下，對裸鼠的骨髓造血功能仍無明顯影響，而只有此劑量的1/3的游離絲裂霉素C卻已明顯抑制了裸鼠骨髓的造血功能，結果見表4。
表4.本發明納米級制劑對骨髓造血功能的影響(血液學檢查)各組血紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)測定值

數據表示為x±s，行t檢驗。與1組(生理鹽水組)比較，*P＜0.05MMC的毒副作用主要是骨髓抑制，以血小板下降最顯著。給藥后4周血液學檢查，可見MMC高劑量組與對照組相比血小板顯著減少，提示有骨髓抑制。其他組與對照組相比無顯著區別。血液學檢查表明，活性炭的應用顯著降低了MMC的毒副作用，本制劑在大量應用(MMC效價18mg/kg，相當于單純MMC半數致死量的2倍)的情況下仍未見明顯毒副作用。腫瘤種植及分組同表3。
游離絲裂霉素C組裸鼠用藥1周后，毛無光澤，活動明顯減少，體重不增且有所降低。而納米級活性炭-絲裂霉素C組，在絲裂霉素C劑量達2.8倍致死量的情況下，動物仍無明顯異常表現，僅在用藥1周后，體重的增加稍有減緩，但4周后與對照組相比已無明顯差異，結果見表5。
表5.本發明納米級制劑對動物體重增長的影響

n＝8。與1組(生理鹽水組)比較，*P＜0.05，**P＜0.01應用SPSS10.0統計軟件包，根據數據分布特點，采用非參數檢驗Mann-Whitney方法分析，體重增長值用中位數(最小值，最大值)表示。2組(MMC高劑量組)動物給藥后明顯消瘦，給藥后1周稱量體重除1只體重增長外，其余7只體重低于用藥前，同時活動減少，毛無光澤；3組(MMC低劑量組)及5組(MMC-nCH高劑量組，MMC劑量18mg/kg)動物1周體重增長值低于1組(生理鹽水對照組)(P＜0.05)。給藥后4周，2組動物體重增長值雖低于對照組，但無統計學意義。其他組與對照組相比也無顯著差別。BALB/C-nu裸鼠56只，6周齡，體重16g-20g，隨機分7組，每組8只，雌雄各半。腹腔接種人胃癌裸鼠移植模型細胞懸液(1.6×106)，接種1小時后給藥。分組見表3。
結論這些結果表明，本發明的納米級制劑在發揮良好的抗胃癌轉移和復發作用的同時，還明顯降低了抗癌藥的毒副作用。
通過上述描述，已經全面公開了本發明，本領域熟練技術人員應該理解的是在不偏離本發明的實質和范圍的條件下，可以在所要求的寬參數范圍內實施本發明。
權利要求
1.一種選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑，包括納米級活性炭和抗癌藥。
2.權利要求1的納米級制劑，其中抗癌藥是絲裂霉素C。
3.權利要求1的納米級制劑，其中納米級活性炭粒徑為10-800nm的粒子占粒子總數的95％以上，平均粒徑為299±150nm。
4.權利要求1的納米級制劑，其中抗癌藥是5-氟尿嘧啶。
5.權利要求1的納米級制劑的制備方法，該方法包括以下步驟將抗癌藥制成水溶液；將納米級活性炭置于抗癌藥溶液中，在一定條件下進行吸附；吸附完畢后，除去水分，得到納米級活性炭-抗癌藥；和將納米級活性炭-抗癌藥進行分裝、密封、滅菌、避光保存。
6.權利要求5的方法，其中的抗癌藥是絲裂霉素C。
7.權利要求5或6的方法，其中納米級活性炭與抗癌藥的重量比是4-18∶1，優選8.5∶1。
8.權利要求5或6的方法，其中水與抗癌藥的重量比為6-25∶1，優選12.5∶1。
9.權利要求5或6的方法，其中進行吸附的時間為20-60分鐘，優選30分鐘。
10.權利要求5或6的方法，其中分裝后每10ml玻璃安瓶中含納米級活性炭0.85-3.4g，優選1.7g，而每10ml玻璃安瓶中含抗癌藥0.1-0.4g，優選0.2g。
全文摘要
本發明公開了一種選擇性靶向胃癌和淋巴系統的納米級制劑。該納米級制劑由納米級的活性炭和對胃癌有效的抗癌藥組成。這種納米級制劑用生理鹽水稀釋后注射于腹腔進行腹腔化療，注射于癌區漿膜下或直接注射于癌區的引流淋巴結進行淋巴化療。經內鏡注射于癌瘤內則對癌灶發揮直接的殺傷作用，同時可收到淋巴化療的效果。注射于癌區的這種納米級制劑，對轉移淋巴結也有直接殺傷作用，起到化學清掃轉移灶的作用。通過上述這些原理，這種納米級制劑是一種具有高度組織選擇性的高效的抗胃癌轉移和復發的新抗癌藥制劑。
文檔編號A61P35/00GK1657100SQ20041000548
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月19日 優先權日2004年2月19日
發明者張英鴿, 曲秋蓮, 孫嵐 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所