專利名稱：一種^99mTc腫瘤顯像藥物腦靶向脂質體制劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種99mTc腫瘤顯像藥物腦靶向脂質體制劑及其在人體和動物器官顯 像中的應用，尤其是在腦瘤早期診斷中的應用，屬于放射性藥物學和藥物制劑學技術領域。
背景技術：
流行病學研究顯示，我國腫瘤患者死亡率呈明顯上升趨勢。早期診斷和治療會 給腫瘤患者帶來更多治愈的機會和更好的效果。臨床上常用的非特異性腫瘤顯像劑有 99mTc-甲氧基異丁基異腈(99mTc-MIBI) ,99mTc(V)-二巰基丁二酸鈉(DMSA) ,67Ga-枸櫞酸鹽 (citrate) ,201TlCl 等。目前，85%的核醫學臨床診斷藥物是99mTc-放射性藥物。但是，迄今為止，尚未 有一種99mTc標記的腦瘤顯像劑能夠適用于臨床顯像研究。由于血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的存在，腦瘤的早期診斷一直是診斷界的難題。基于BBB的結構功能特點， 藥物跨越BBB的途徑有以下四種開放BBB上微血管內皮細胞間的緊密連接增加藥物的通 透性；修飾藥物制成前體藥物通過脂溶性實現融膜擴散；利用MDR逆轉運對抗ρ-糖蛋白 (p-gp)外排作用；特異受體介導的吞飲。眾所周知，發現一個容易跨越BBB的脂溶性分子 量小于500道爾頓的新藥并非一件易事，而一個給藥系統的研究成功將會給已知的CNS藥 物帶來新的應用前景。脂質體作為一種新型藥物載體(脂質體為磷脂在水中分散而得，其 在結構上為單層或多層泡囊。而且脂質體具有生物相容性和生物可降解性)，將藥物載于趨 腦性脂質體中，通過脂質體與細胞的融合、內吞等相互作用是增加藥物腦攝入的一種方法。 緩激肽類似物RMP-7已被報道是靶向BBB的良好導向化合物，但由于它開放BBB的時效性， RMP-7在向FDA申報臨床III期中被停滯。本發明發現用DSPE-PEG-NHS鍵合RMP-7后，制 備的主動靶向脂質體將大大降低其毒性，更有利于RMP-7的應用，經文獻檢索，未發現關于 RMP-7毒性改善的相關報道。為實現99mTc顯像藥物在腦瘤診斷中的應用，本發明采用脂質體和主動靶向脂質體 包載99mTc藥物。以99mTcN-NOET(99mTc-氮-(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸鹽))為示例 藥物，研制99mTcN-NOET藥物脂質體制備工藝及處方優選；經動物實驗研究發現99mTcN-NOET 脂質體血管給藥后在小鼠腦組織的分布以及SPECT顯像效果均好于游離的99mTcN-N0ET。說 明99mTc顯像藥物脂質體制劑在腦瘤臨床診斷上較游離99mTc藥物具有更廣闊的應用前景。 經文獻檢索，目前沒有99mTc顯像藥物脂質體制劑在腦部腫瘤中應用的研究報道。

發明內容
1.本發明的創新點之一在于發現以緩激肽類似物RMP-7作為導向分子制備的主 動靶向脂質體可明顯降低RMP-7無效開放BBB的可能性，此種給藥系統更有利于載藥。緩激肽類似物RMP-7能夠和BBB上微血管內皮細胞上的B2受體相互作用增加血管 通透性。其暫時性無效開放BBB會造成腦脊液蛋白或其他有毒物質流入腦組織，因此RMP-7 在向FDA申請臨床III期實驗時被停滯。本發明通過將RMP-7與DSPE-PEG-NHS鍵合后形成的DSPE-PEG-RMP-7插入脂質體膜，制備主動靶向脂質體，大鼠靜脈給藥后，死亡率為0%。 細胞活性實驗發現RMP-7接在脂質體上其活性未發生改變。因此將RMP-7作為導向分子接 在脂質體上不僅能繼續發揮其靶向BBB的作用，而且毒性明顯降低。2.該發明的創新點之二是提出用腦靶向脂質體包載99mTc顯像藥物。首次提出了用腦靶向脂質體包載99mTc顯像藥物的理念，以99mTcN-NOET (99m 锝-氮-N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸鹽))為示例藥物(其為脂溶性心肌灌注顯像 劑和腫瘤顯像劑)，采用脂質體包載99mTc藥物可以解決其水溶解度問題，方便給藥。此外腦 靶向脂質體包載99mTc藥物能改變其在體內的組織分布，使其在腦部腫瘤處濃集。99mTc藥物 用脂質體包載的特征為脂質體由磷脂在水中分散而得，其在結構上為單層或多層微囊。脂 溶性99mTc藥物插在雙分子脂膜上(見附圖1)。脂質體與由表面活性劑構成的膠團不同，其 在體液中被稀釋時，不會因濃度降低而破裂，具有較好的包載99mTc藥物能力。磷脂是生物 膜的組成成分，具有生物降解性和生物相容性，因此脂質體是99mTc藥物一個良好藥物載體。3.該發明的創新點之三在于99mTc顯像藥物脂質體的制備工藝。制備脂質體的材料主要是磷脂和膽固醇。磷脂可以采用天然大豆磷脂(主要成分 為磷脂酰膽堿)，蛋黃卵磷脂以及二硬脂酰磷脂酰膽堿，棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，磷脂酰 絲氨酸，磷脂酸，氫化卵磷脂等。這里優選天然大豆卵磷脂(純度> 95% )。制備99mTc藥物脂質體的方法有薄膜分散法、逆向蒸發法，復乳法，凍融法，鈣誘導 融合法，注入法等。優選薄膜分散法。取適量大豆卵磷脂SPC，膽固醇CHol和適量99mTc藥物， 用合適的油相溶解后，25 30°C下旋轉減壓蒸發成膜。然后補充一定量的生理鹽水使其水 化，超聲5min后分散成均勻的脂質體混懸液。此法得到的99mTc藥物普通脂質體特征為透 明液體，具有藍色乳光，包封率為99%，平均粒徑小于30nm。若在普通脂質體中加入適量二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-RMP-7 (DSPE-PEG-RMP-7)孵育Ihour后得到99mTcN-NOET 腦靶向脂質體，其特征亦為透明液體，具有藍色乳光，包封率為99%，平均粒徑小于30nm。99mTc藥物脂質體制備工藝中旋轉蒸發成膜和超聲時間不超過5min，孵育時間不超 過1小時，有利于保持99mTc藥物的放射性活度。上述脂質體制備工藝用于99mTc藥物未見 報道。在脂質體制備工藝中，由于99mTc藥物放射性活度高，而化學質量很小，因此脂材SPC 和CHol使用量小，整個制備工藝屬于微量操作，脂質體濃度低于0. 2mg/ml，有別于常規脂 質體制劑。微量法的制備工藝以及快速操作得到小粒徑半衰期短的99mTc顯像藥物制劑屬 于方法創新。4.該發明的創新點之四在于發現99mTc藥物脂質體制劑在診斷腦瘤中具有更好的 優勢。由于血腦屏障的存在，長期以來限制了顯像藥物在中樞神經系統方面的應用。用 脂質體包載99mTcN-NOET后，靜脈給藥，能明顯增加99mTcN-NOET在小鼠腦組織的藥物濃度， 主動靶向脂質體效果更佳。經給荷C6腦膠質瘤模型大鼠的SPECT顯像后發現，99mTcN-NOET 主動腦靶向脂質體組的腫瘤顯像明顯，99mTc藥物腦靶向脂質體靜脈給藥有望在腦瘤的診斷 中發揮作用。
具體實施例方式實施例1以緩激肽類似物RMP-7為導向分子的主動靶向脂質體制備工藝和毒性
取適量DSPE-PEG-NHS和RMP-7分別用0. lmol/L的HEPES緩沖液溶液溶解；然后 在4°C冰柜中將DSPE-PEG-NHS緩慢滴加到RMP-7的溶液中，緩慢攪拌，4°C下反應12小時后 加入過量的0. lmol/L甘氨酸終止反應。反應液于_40°C，0. 22mbar下冷凍干燥24小時即 得到DSPE-PEG-RMP-7，RMP-7完全反應，無殘留。將DSPE-PEG-RMP-7用生理鹽水溶解后緩 慢滴加到脂質體中，緩慢攪拌，DSPE-PEG-RMP-7的疏水端靠疏水相互作用自動插入到脂質 體的脂膜上形成主動靶向脂質體。SD大鼠靜脈注射RMP-7，每日一次，注射14日，大鼠死亡率為33 % ；同樣注射主動 靶向脂質體14日，大鼠死亡率為0%。RMP-7為導向分子制備的主動靶向脂質體明顯降低 其無效開放BBB引起的毒性。實施例299mTc藥物(以99mTcN-NOET為示例)脂質體制備工藝按優化處方取適量大豆卵磷脂SPC，膽固醇CHol和適量99mTc藥物，用合適的油相 溶解后，25 30°C下旋轉減壓蒸發成膜。然后補充一定量的生理鹽水使其水化，超聲5min 后分散成均勻的脂質體混懸液。此法得到的99mTc藥物普通脂質體特征為透明液體，具有藍 色乳光，包封率為99%，平均粒徑小于30nm。若在普通脂質體中加入適量DSPE-PEG-RMP-7 和DSPE-PEG孵育Ihour后得到99mTcN-NOET腦靶向脂質體，其特征亦為透明液體，具有藍色 乳光，包封率為99%，平均粒徑小于30nm。其優化處方磷脂與膽固醇的比例為6 1 2 1(重量比)，磷脂與RMP-7比例為15 1 50 1 (重量比)，磷脂與DSPE-PEG比例為8 1 3 1 (重量比)實施例399mTc藥物(以99mTcN-NOET為示例)脂質體靜脈給藥用于腦瘤診斷1.99mTcN-NOET脂質體靜脈給藥的小鼠腦組織分布一、實驗方法ICR雄性小鼠90只(體重20g)，分為3組，依次為游離99mTcN_N0ET，99mTcN-NOET脂 質體(99mTcN-NOET-L)和 99mTcN-NOET 主動靶向脂質體(99mTcN-NOET-SSL-T)組。用 15%烏 拉坦麻醉后尾靜脈給藥0. Iml0分別于給藥5、15、30、60和120min后進行眼部后靜脈叢取 血。然后蠕動泵心臟灌流生理鹽水，流速為2mL/min，隨即剪開右心耳放血，以此消除腦毛細 血管中殘留的藥物對腦組織分布的影響，準確評價藥物跨越血腦屏障進入腦組織的能力。動物處死后，取腦、心、肝、脾、肺、腎、尾等組織，精確稱重后Y計數。給藥劑量0. ImL藥物100倍稀釋后，取0. Iml γ計數，計算動物分布％ ID/g值，計
算公式如下％ID/g =，·+。
μ臟器 ,1%二、實驗結果游離 99mTcN-NOET,99mTcN-NOET 脂質體(99mTcN-NOET-L)禾Π 99mTcN-NOET 主動靶向脂 質體(99mTcN-NOET-SSL-T)組給藥后，各時間點腦組織藥物分布％ ID/g見附圖2。由圖可以 看出，99mTcN-NOET-SSLT, 99mTcN-NOET-L 相對于 99mTcN-NOET 有很大的提高。經 WinNonLin 軟 件計算其藥動學參數，如表1所示。表1.各組藥物在ICR小鼠中血和腦組織的藥動學參數(η = 5 6)
5 AUC -.area under the tissue concentration time curve ；Cmax :maximum concentration；CL :clearance rate. 通過藥動學參數的計算可以看出，99mTcN-NOET經脂質體包載后，5min時藥物在腦 組織濃度達峰，達峰時藥物濃度提高1.63倍，腦內藥物AUC較游離藥物組提高了 1.49倍， 腦組織藥物清除率明顯低于游離藥物組。此結果說明脂質體作為藥物載體，增加了藥物入 腦效果，延長了 99mTcN-NOET在腦組織的顯像時間。99mTcN-NOET經靶向脂質體脂質體包載后，5min時藥物在腦組織濃度達峰，達峰時 藥物濃度較脂質體組略有增加，腦靶向系數亦略有提高。分析其原因，與"mTcN-NOET在正 常小鼠腦內沒有受體可能有關。三、結論99mTcN-NOET用脂質體包載靜脈給藥，在小鼠腦組織的分布優于99mTcN-NOET,尤其 以腦靶向脂質體99mTcN-NOET-SSL-T分布最高，表明其是一個較有潛力的腦靶向顯像制劑。2.99mTcN-NOET脂質體靜脈給藥大鼠SPECT顯像和放射自顯影一、實驗方法取SD雄性大鼠2只(體重200g)，尾狀核接種C6膠質瘤細胞，接種7日后制作 的動物模型用于SPECT顯像評價。標記為A鼠與B鼠。用15%烏拉坦麻醉后尾靜脈分別 給予游離99mTcN-NOET和99mTcN-NOET主動靶向脂質體(99mTcN-NOET-SSL-T)，給藥量分別為 0. 5ml (200uCi)。2小時后用德國Siemens Ε. cam SPECT儀采集圖像。上述2只腫瘤大鼠2日后，交叉給藥，A鼠給予99mTcN-NOET-SSL-T, B鼠給予游離 99mTcN-N0ET。另取一只C6腦膠質瘤模型大鼠給予99mTcN-N0ET-L。2小時處死動物，解剖取 完整腦組織，于液氮中冷凍。冷凍切片，儲磷屏顯影。二、實驗結果1.荷C6膠質瘤大鼠模型SPECT顯像結果99mTcN-NOET與99mTcN-NOET-SSLT分別在2小時左右的SPECT成像照片見附圖3。 從照片光斑顯像結果可以看出A鼠給予99mTcN-NOET后，腦組織未見明顯腫瘤；而B鼠給予 99mTcN-NOET-SSL-T后，在右側腦組織中可見兩處明顯腫瘤。為進一步確定腫瘤存在，做腦組 織冷凍切片查看腫瘤情況并做自顯影。2.荷C6膠質瘤大鼠模型自顯影研究結果C6 膠質瘤模型大鼠交叉給予 99mTcN-NOET-SSL-T (A 鼠)、99mTcN-NOET (B 鼠)和 99mTcN-NOET-L, 2小時左右處死動物的自顯影印跡見附圖4。可以看出，A鼠冷凍切片的大腦 橫切面解剖照片顯示腦組織中有兩個腫瘤區域，其呈現茂盛的新生血管，邊界比較清楚，取該切面的腦組織于磷屏下曝光，得到顯影印跡圖，圖中可見明顯的兩個腫瘤區域。B鼠冷凍 切片的大腦橫切面解剖照片也顯示腦組織中有兩個腫瘤區域，其呈現茂盛的新生血管，上 側靠近尾狀核的腫瘤邊界不太清楚，下側出現的小腫瘤邊界清楚，為其轉移瘤。99mTcN-NOET 給藥后的自顯影印跡可看到上側腫瘤周邊有一圈明顯的濃集，但下側新生瘤沒有印跡。比 較SPECT顯像和自顯影結果，可以明顯看出游離99mTcN-NOET在腫瘤后期可以顯像，但對于 腫瘤的早期診斷作用欠佳。C鼠冷凍切片的大腦橫切面解剖照片顯示其腦組織中明顯可見茂盛的新生血管， 但腫瘤邊界不太清楚，C鼠為腫瘤后期模型。經分析給予99mTcN-NOET-L自顯影印跡可以看 出，印跡不如主動腦靶向制劑99mTcN-NOET-SSLT清楚，僅在腫瘤邊界出現濃集。三、結論99mTcN-NOET經主動靶向脂質體包載后，其對于腦部腫瘤的早期診斷優于游離藥物 組和普通脂質體組。以RMP-7作為導向分子的主動靶向脂質體是一種良好的99mTc顯像藥 物的給藥系統，其有望于為腦部腫瘤的早期診斷提供靈敏的分子探針。


附圖1. 99mTcN藥物主動靶向脂質體的結構示意圖附圖2.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET脂質體在小鼠腦組織的藥時曲線附圖3.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET-SSL-T在荷C6膠質瘤大鼠模型的SPECT顯像附圖4.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET脂質體在荷C6膠質瘤大鼠模型的冰凍腦切片和 自顯影
權利要求
一種99mTc腫瘤顯像藥物的腦靶向脂質體制劑，其特征在于以緩激肽類似物RMP 7為導向分子制備的主動腦靶向脂質體。
2.根據權利要求1所述的99mTc顯像藥物為99mTcN-NOET("mTc-氮-N-乙基-N —乙氧基 二硫代氨基甲酸鹽))，"mTcN-NOET衍生物，99mTc-MIBI (甲氧基異丁基異腈)以及所有99mTc 標記的腫瘤顯像劑。
3.根據權利要求1所述的制劑，該制劑含有脂質體微囊和包裹于其中的99mTc顯像藥 物，所述脂質體濃度低于1. 5mg/ml，粒徑小于60nm的微囊，所述脂質體微囊含有磷脂，膽 固醇，以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇復合物以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二 醇-RMP-7導向化合物。
4.根據權利要求3所述的制劑，其中所述的聚乙二醇為聚乙二醇2000和聚乙二醇 3400。
5.根據權利要求3所述的制劑，其中所述的磷脂選自大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂，二硬脂 酰磷脂酰膽堿，棕櫚酰磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酸，氫化卵磷脂。
6.根據權利要求3所述的制劑，其中所述的磷脂為大豆卵磷脂。
7.權利要求1所述制劑的制備方法，其特征在于該方法為薄膜分散法，具體步驟如下 取大豆卵磷脂，膽固醇和適量99mTc藥物，用合適的油相溶解后，25 30°C下旋轉減壓蒸發 成膜。補充一定量的生理鹽水使其水化，超聲5min后加入適量二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚 乙二醇-RMP-7孵育Ihour后得到脂質體透明溶液。
8.權利要求1所述的99mTc腫瘤顯像藥物靶向脂質體的用途，在于腦部腫瘤的診斷和治療。
全文摘要
本發明名稱是一種99mTc腫瘤顯像藥物腦靶向脂質體制劑及其應用。本發明提出了用主動腦靶向脂質體包載99mTc腫瘤顯像藥物的理念，采用快速薄膜分散法制備了99mTc腫瘤顯像藥物腦靶向脂質體制劑，包封率大于99％，粒徑小于30nm，其結構見附圖1，磷脂在水中分散得單層或多層微囊，脂溶性99mTc藥物插在雙分子脂膜中，緩激肽類似物RMP-7作為主動腦靶向導向分子伸展在脂質體表面。小鼠組織分布實驗表明該制劑大大提高了99mTc藥物穿過BBB的能力，荷C6腦膠質瘤大鼠模型SPECT顯像和自顯影結果顯示該主動靶向脂質體制劑應用于99mTc腫瘤顯像藥物，可能實現腦瘤的早期診斷。屬于放射性藥物學和藥物制劑學技術領域。
文檔編號A61K103/10GK101920024SQ20091014197
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月12日 優先權日2009年6月12日
發明者周鶴翔, 謝英, 賈紅梅, 鄭婷婷 申請人:北京師范大學