專利名稱：粒子轟擊轉化蕓苔屬植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過粒子轟擊轉化蕓苔屬植物的方法和材料。
背景信息
蕓苔屬植物包括許多農業上重要的作物，它們被人類用作蔬菜、食用油和調味品。實際上，蕓苔屬植物的油產量占全世界食用油的12％以上。為了改善農業上重要作物地質量，傳統上栽培者是依靠常規的育種方法。然而，隨著當代植物分子生物學和遺傳學的進展，現在栽培者能通過導入外源DNA來改善植物質量。
已有人用幾種不同的方法來轉化植物。一種常用方法涉及用感興趣的DNA包覆著的微粒以轟擊植物細胞。實際上，粒子轟擊方法已經廣泛地用來轉化玉米、大豆、小麥和稻谷。然而，用粒子轟擊轉化蕓苔屬植物的嘗試還沒有成功。實際上，唯一成功的蕓苔屬植物轉化需要對蕓苔屬植物胚胎進行大量操作。因此，目前的研究者依靠其它方法(例如土壤桿菌介導的方法)來轉化蕓苔屬植物。
概述
本發明涉及用粒子轟擊方法轉化蕓苔屬植物種類。具體地說，本發明根據的是發現了一種迅速而方便的組織制備技術，該技術使蕓苔屬植物細胞能被培養，能通過粒子轟擊轉化并再生成植物。另外，本發明提供了轉化的細胞，以及生長至成熟并結籽的再生植物。這些再生的植物及其后代穩定地表達轉移入的核酸分子。本文所述的發明方法的簡單性使蕓苔屬植物中的粒子轟擊轉化方法不僅可以實現，而且在經濟上可行。
本發明一方面提供一種產生轉化的蕓苔屬植物細胞的方法，該方法涉及用核酸包覆的微粒轟擊從非胚胎蕓苔屬植物組織制得的細胞，以及鑒定經該核酸轉化的細胞。經核酸轉化的細胞可以這樣來鑒定將經轟擊的細胞置于浮選裝置上，使其與液體選擇性培養基接觸，然后選擇存活細胞。該方法還可涉及從轉化細胞再生出蕓苔屬植物。例如，可將經鑒定的細胞置于與液體再生培養基接觸的浮選裝置上。從非胚胎蕓苔屬植物組織制得的細胞可以是二倍體。另外，非胚胎蕓苔屬植物組織可以來自幼苗，例如4-6日齡的不育性幼苗。通過將組織切成片，并使該片與誘導培養基接觸，就可從非胚胎蕓苔屬植物組織制得細胞。例如，可用以下方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得細胞，即將幼苗下胚軸切成多片，再將這些片縱向切開，使縱向切片的表皮側接觸誘導培養基。細胞也可通過將組織浸軟成細胞漿的方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得。例如，可以這樣從非胚胎蕓苔屬植物組織制得細胞，即除去幼苗下胚軸的下部，將其余的含有芽尖、子葉和10-50％下胚軸的上部與誘導培養基合并，然后將該組合物浸軟成細胞漿。另外，還可富集細胞漿中其大小為46-230微米的細胞物質。用來轉化蕓苔屬植物細胞的核酸能調節某多肽的表達或編碼某多肽。例如，核酸能編碼反義分子，如核酶或反義寡核苷酸。另外，蕓苔屬植物組織可以來自蕓苔屬植物種類，如蔓菁(Brassica napus)，黃芥子(Brassica juncea)，Brassicacarinata，黑芥(Brassica nigra)，甘藍(Brassica oleracea)和油菜(Brassica campestris)(也稱為“rapa”)。
本發明另一方面提供了通過以下方法產生的蕓苔屬植物細胞及其后代，該方法是用核酸包覆的微粒轟擊從非胚胎蕓苔屬植物組織制得的細胞，并鑒定轉化了該核酸的細胞。
本發明另一方面提供了一種培養蕓苔屬植物組織的方法，該方法包括將蕓苔屬植物組織置于與液體培養基接觸的浮選裝置上。該液體培養基可以是選擇培養基。將蕓苔屬植物組織培養在選擇培養基上，就能鑒定出已用該核酸轉化的蕓苔屬植物組織。另外，該液體培養基可以是再生培養基。將蕓苔屬植物組織培養在再生培養基上，就能使蕓苔屬植物組織再生出蕓苔屬植物。
除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語均具有本發明所屬領域普通技術人員通常了解的相同意義。雖然在實施或測試本發明時可以采用與本文所述的相似或等價的方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻均全部納入本文作參考。在有矛盾時，將以本文的說明書(包括定義)為主。另外，本文中的材料、方法和實施例只是描述性的，并不意味著有局限性。
從下列詳細描述以及權利要求能明顯得出本發明的其它特征和優點。
附圖描述


圖1是用于本文描繪的實驗的pIMC38構建物的示意圖。
詳細描述
本發明提供了用粒子轟擊轉化蕓苔屬植物所涉及的方法和材料。具體地說，本發明提供了制備非胚胎蕓苔屬植物組織的方法，從而使蕓苔屬植物細胞能被培養、能被粒子轟擊轉化，并能再生成植物。本發明還提供了穩定轉化的蕓苔屬植物細胞及其后代。轉化的植物在本文中也稱為轉基因植物。
組織制備物
細胞或組織制備物定義為以適合粒子轟擊的方式排列的一組細胞或組織。為了確保轉化成功，細胞或組織制備物提供了相當大數目的暴露在表面上的細胞(較佳的是正迅速分裂的細胞)，因而它們能接受核酸包覆的粒子。另外，受體細胞必須能繼續生長并再生出植物。許多非胚胎蕓苔屬植物細胞或組織來源可用來制備滿足這些標準的細胞或組織制備物。例如，從蕓苔屬植物衍生獲得的葉原生質體、分離的小孢子培養物、莖組織、以及下胚軸組織可用作蕓苔屬植物細胞來源。用非胚胎組織來源能極大程度地簡化轉化程序。典型地，采用的是從不育條件下生長的幼苗制得的下胚軸組織。在這種情況下，可將下胚軸切成縱向的切片。或者，可將幼苗的上部研磨成細胞漿。這樣的上部可包括兩個子葉、芽尖、以及下胚軸的頂部。
細胞漿是含有能活細胞的不溶性細胞物質的液體懸浮液。可用搗碎機將蕓苔屬植物組織研磨成細胞漿。另外，可以根據不溶性細胞物質的大小對細胞漿分組。例如，可將細胞漿分選通過一系列篩網，從而使特定大小的不溶性細胞物質富集。任何大小的細胞漿均可用于粒子轟擊，只要該細胞漿含有能活細胞即可。例如，可對細胞漿中大小約35微米至約500微米、或大小約46微米至約230微米的細胞物質富集，并用于粒子轟擊。
蕓苔屬植物組織制備物可含有二倍體或單倍體細胞。當采用二倍體細胞時，知道在每個整合部位的所得轉化細胞最有可能是雜合的。換句話說，一個拷貝的導入的核酸整合到兩個染色體相同位置上的可能性很小。然而，在采用單倍體細胞時，可用秋水仙堿處理所得的轉化的單倍體細胞，以誘導染色體復制。這樣，得到的細胞在每個整合部位極有可能是純合的。另外，單倍體植物可以從所得轉化的單倍體細胞再生。然后，可將這些單倍體植物與其它植物雜交，以產生特定整合部位為雜合或純合的植物。進而，基因組中整合入導入核酸序列的細胞稱為穩定轉化的細胞。穩定轉化的細胞通常隨每次細胞分裂而保留導入的核酸序列。含有未整合入基因組的導入核酸序列的細胞稱為瞬時轉化的細胞。瞬時轉化細胞通常隨每次細胞分裂而喪失一部分導入的核酸序列。這樣，轉化細胞可以是瞬時轉化的和／或穩定轉化的。
在轟擊前，非胚胎蕓苔屬植物組織制備物可以培養在誘導培養基，如固體誘導培養基中。該固體培養基通常通過在液體培養基中加入瓊脂來制得。誘導培養基通常含有Murashige和Skoog(MS)培養基，以及相對較高濃度的植物生長素(如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))，以及相對較低濃度的細胞分裂素(例如激動素)。例如，可在MS培養基中加入1毫克／升2，4-D和0．3毫克／升激動素，并使用。另外，在轟擊前1-3天，組織制備物通常培養在誘導培養基中。
出于本發明的目的，可以采用固體和／或液體組織培養技術。例如，誘導、選擇和再生培養基可以呈固體或液體形式。在采用固體培養基時，可以將蕓苔屬植物組織直接置于培養基上，或可將其置于一濾膜上，然后放置該濾膜與培養基接觸。在采用液體培養基時，可將蕓苔屬植物組織置于和液體培養基接觸的浮選裝置上。浮選裝置通常是如其它文獻(美國專利No．5，324，657)所述的多孔膜。從生產商如LifeTechnologies(Rockville，MD)和Osmotek Ltd．(Kiryat Weizmann Rehovot 76210，Israel)很容易獲得浮選裝置的實例、浮選裝置的使用方法以及有助于液體培養技術的輔助設備。通常，將生長較快的組織培養在液體培養基中。例如，可用液體選擇培養基和液體再生培養基來培養黃芥子組織。
核酸分子
可用環形或線形核酸分子來包覆顆粒，進而用該顆粒轉化蕓苔屬植物。另外，這些核酸分子可以是RNA或DNA，包括cDNA、基因組DNA以及合成的(例如化學合成的)DNA，它可以是雙鏈或單鏈的。當其為單鏈時，該核酸可以是有義鏈或反義鏈的。這些分子的片段也在本發明的范圍內，它們可用聚合酶鏈反應(PCR)來制得，或通過用一種或多種限制性內切核酸酶處理來產生。RNA分子可通過例如體外轉錄來產生。
本發明的核酸分子通常編碼某多肽，或調節某多肽的表達。例如，可以采用編碼一種酶的cDNA或防止該酶合成的反義分子。術語“反義分子”包括任何核酸分子，其含有的序列與天然存在的多肽的編碼鏈互補。反義分子還可包括側接的序列，例如調控序列或內含子。利用互補的反義序列來特異性靶向和切割RNA的酶促性核酸分子(如核酶以及反義寡核苷酸)，被認為是本發明范圍內的反義分子。這些核酶可具有任何通常的結構(包括但不局限于發夾、錘頭或斧頭狀結構)，只要該分子能切割RNA。
通常，本發明的核酸分子是質粒形式，其含有的序列編碼某多肽并促進該多肽在蕓苔屬植物細胞中的表達。促進多肽表達的序列通常是接在多肽編碼序列兩側的調控序列。多肽可以是任何用合成方法工程改造的或用生物學方法衍生獲得的多肽。此外，該多肽可以天然存在于蕓苔屬植物中或與蕓苔屬植物異源。這樣，蕓苔屬植物多肽、植物多肽、非植物多肽、修飾過的多肽、合成的多肽、以及多肽的一部分均在本發明的范圍內。
用來成功轉化植物的核酸分子的組成及其構建方法均是本領域技術人員所熟知的。例如，其它地方(Weising，等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))描述了合適的核酸組件(如啟動子、聚腺苷酸化序列、可選擇的標記序列、報道物序列、增強子、內含子等)的應用以及提供那些組件具體組成的文獻。另外，其它文獻(Sambrook J．等人，《分子克隆實驗手冊》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中描述了合適的構建方法。重要的是應注意，這里可以采用相同或相似的組成和方法來產生能用來轉化蕓苔屬植物的核酸分子，因為用來轉化蕓苔屬植物的核酸分子的具體組成對于本發明并不重要，本發明并不取決于具體采用的轉化核酸分子的組成。
特別適用于轉化蕓苔屬植物的核酸分子包括為所得轉化蕓苔屬植物的有益特征而提供的或增強該特征的DNA分子。例如DNA能編碼促使食物營養價值增加、產量提高、抗害蟲、抗疾病等的多肽或反義分子。具體的例子包括，但不局限于，改變脂肪酸組成的異源脂肪酸去飽和酶或脂肪酸延伸酶(elongase)、賦予抗昆蟲性的Bt內毒素基因或蛋白酶抑制劑；賦予耐受草甘磷除草劑的細菌ESPS合成酶基因；以及賦予殺真菌性能的殼多糖酶或葡聚糖內切-1,3-B-糖苷酶基因。另外，可將核酸分子導入蕓苔屬植物中作為遺傳工具，以產生突變株和／或有助于蕓苔屬植物DNA片段的鑒定、基因標記或分離。能提供有益特征或用作遺傳工具的其它核酸分子是本領域技術人員通常所知的，這些均在本發明的范圍內。
導入蕓苔屬植物的核酸分子還可含有編碼可選擇標記、報道物或兩者的核酸序列。這些序列在蕓苔屬植物中的表達能幫助鑒定和選擇穩定轉化的細胞、瞬時轉化的細胞或兩者。另外，可選擇標記能載于用共轉化程序導入的各別的核酸分子上。編碼這些可選擇標記和報道物的序列能側接有助于蕓苔屬植物中表達的合適的調控序列。有用的可選擇標記是本領域技術人員所熟知的，它們例如包括抗生素以及除草劑的抗性基因。這些基因的具體例子公開在其它處(Weising，等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))。一種典型的可選擇標記基因是轉座子Tn5(AphII)的氨基糖苷磷酸轉移酶基因，它編碼的多肽賦予了對抗生素卡那霉素、新霉素和G418(遺傳霉素)的抗性。本領域已知的其它可選擇標記包括能從大腸桿菌衍生獲得的潮霉素B磷酸轉移酶(HPT)編碼序列以及編碼賦予對草甘磷、氨甲喋呤、膦絲菌素、咪唑啉酮、磺酰脲、溴苯腈、茅草枯等抗性或耐受性的多肽的那些基因。賦予轉化蕓苔屬植物除草劑抗性或耐受性的可選擇標記基因的表達在商業上是有用的。
編碼能容易測得的標記多肽的報道基因是本領域所熟知的。通常，報道基因是不存在于受體生物或組織中或被受體生物或組織表達的基因，其編碼多肽的表達可通過一些能容易檢測的性質(如表型變化或酶促活性)來表現。其它文獻(Weising等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))提供了這些報道物的例子。典型的報道物包括來自生物發光的水母Aequorea victoria的綠色熒光蛋白(GFP)基因、GFP的變體、來自大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉移酶基因、大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸酶基因、以及來自螢火蟲Photinus pyralis的螢光素酶基因。含有GFP以及GFP變體的核酸序列的載體可購自Clontech Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)。GFP ApplicationNotes(應用注意)(Living ColorsTM；PT2040-l；Clontech Laboratories，Inc．)描述了GFP以及GFP變體。
可用于本文的調控序列包括任何組成型的、可誘導的、組織或器官特異性的、或發育階段特異性的、在植物細胞中起作用的啟動子。其它文獻公開了這些合適的啟動子(Weising等人，Ann．Rev．Genetics 22421-478(1988))。下面是適用于本文的啟動子的部分代表清單來自根癌農桿菌的T-DNA的調控序列，包括甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶和章魚氨酸合成酶；來自玉米的醇脫氫酶啟動子；來自各植物種類的光可誘導啟動子，如二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因；主要的葉綠素a／b結合蛋白基因啟動子；花椰菜花葉病毒的35S和19S啟動子；發育性調節的啟動子，如油質蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、蕪菁蛋白(napin)和菜豆蛋白的啟動子；以及可誘導的或組成型的合成啟動子或其它天然啟動子，包括表現出器官特異性表達或在植物的特定發育階段表達的那些啟動子。
特別值得推薦的啟動子是允許種子特異性表達的那些啟動子。這些啟動子有用是因為種子是植物油的主要來源，而且還因為種子特異性表達會避免非種子組織中任何潛在的有害作用。種子特異性啟動子的例子包括，但不局限于，種子貯藏蛋白的啟動子，該蛋白在許多植物中可占種子總蛋白直到90％。種子貯藏蛋白受到嚴格的調控，它以高度組織特異性和階段特異性的方式在種子中幾乎專有地表達(Higgins等人，Ann．Rev．Plant Physiol．35191-221(1984)；Goldberg等人，Cell 56149-160(1989))。另外，在種子發育的不同階段可能表達不同的種子貯藏蛋白。
人們已經詳細研究了種子特異性的基因表達(綜述見Goldberg等人，Cell Sb149-160(1989)和Higgins等人，Ann．Rev．Plant Physiol．35191-221(1984))。目前有許多關于種子貯藏蛋白基因在轉基因雙子葉植物中種子特異性表達的例子。
種子特異性啟動子的其它例子來自在早期胚胎發育和油的生物合成期間表達的基因。例如，脂肪酸去飽和酶基因的天然調控序列(包括天然的啟動子)可由本領域技術人員分離后采用。可采用參與種子油生物合成的其它基因的異源啟動子，這些基因例如蔓菁異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合成酶的基因(Comai等人，Plant Cell 1293-300(1989))；紅花(Thompson等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 882578-2582(1991))和蓖麻(Shanklin等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 882510-2514(1991))的δ-9去飽和酶的基因；擬南芥菜屬(Post-Beittenmiller等人，Nucl．Acids Res．(1989)171777)、蔓菁(Safford等人，Eur．J．Biochem．174287-295(1988))和油菜(Rose等人，Nucl．Acids Res．157197(1987))的酰基載體蛋白(ACP)的基因；大麥的β-酮脂酰基-ACP合成酶(Siggaard-Andersen等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 884114-4118(1991))；以及Zeamays(Lee等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 886181-6185(1991))、大豆(Genbank登錄號X60773)和蔓菁(Lee等人，Plant Physiol．961395-1397(1991))的油質蛋白的基因。
核酸分子還可含有其它元件，如內含子、增強子、聚腺苷酸化序列等。這些元件可能是核酸分子起作用所必需的或非必需的，盡管它們能通過影響轉錄、mRNA的穩定性等使核酸分子更好地表達或發揮功能。這些元件可包括在所需的核酸分子中，以使核酸轉化入植物的性能最優。然而，沒有內含子通常也能獲得足夠的表達，使可選擇標記滿意地表現。
為了確定特定的核酸組件組合是否如所需的那樣發揮功能，可通過用含有該特定組合以及一種報道物的核酸分子構建物以粒子轟擊來穩定或瞬時轉化蕓苔屬植物受體細胞。在轉化后的適當時間，可進行測定該報道物表達的試驗。例如，有一個試驗需要鑒定大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬時表達(Jefferson等人，EMBO J．63901-3907(1987))。在該情況下，進行該試驗的合適時間為轟擊后大約1-3天。當所用核酸分子含有的組件以前未被證實或確認與所希望的蕓苔屬植物受體細胞相容時，采用瞬時試驗是特別重要的。
粒子轟擊
用粒子轟擊方法將本文描述的核酸分子導入非胚胎蕓苔屬植物組織制備物中。其它文獻中提供了關于合適的粒子轟擊儀器以及粒子轟擊方法的一般性描述(Sanford等人，J．Part．Sci．Technol．527-37(1987)；Heiser W．，″用氦驅動的PDS-1000／He系統優化Biolistic_轉化″，US／EG Bulletin 1688，BIO-RAD；和Dunder等人，″不同Biolistic_裝置的工作性能比較″US／EG Bulletin 1689，BIO-RAD)。簡言之，粒子轟擊方法(也稱為biolistic方法)利用非常小的粒子將所需核酸分子輸送到細胞內，該粒子由生物學惰性材料制成，其上已經包覆了核酸分子。當該惰性粒子被核酸分子包覆并被加速至適當速度時，一個或多個粒子將進入一個或多個細胞，核酸分子從粒子上釋放下來并在細胞中表達。盡管一些細胞可能被轟擊方法致死性破壞，但其它細胞卻是存活的。存活的一些受體細胞穩定地保留了導入的核酸分子并表達該核酸分子。
粒子(稱為微粒)通常是高密度的材料，如鎢或金。它們被感興趣的核酸分子包覆。包覆程序在其它文獻中已有詳細描述(Stanford等人，Methods Enzymol．217483-509(1993)和Heiser W．，″用氦驅動的PDS-1000／He系統優化Biolistic_轉化″，US／EGBulletin 1688，BIO-RAD)。然后將微粒置于大轟擊粒子的表面上，該大轟擊粒子的作用是將來自合適能量來源的動力轉移給微粒。在大轟擊粒子和微粒被加速至適當速度后，它們接觸一個阻擋裝置，該裝置阻止大粒子繼續沿向前的路徑移動，但卻允許包覆了核酸分子的微粒繼續運動并沖擊蕓苔屬植物受體細胞。合適的儀器能利用各種動力，如高壓氦罐、火藥和來自電弧放電的沖擊波(Sanford，等人，J．Part．Sci．Technol．527-37(1987)和Sanford等人，Technique 33-16(1988))。
Klein T等人提供了一種利用火藥裝置的方法(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 854305-4309(1988)和Bio／Technology 6599-563(1988))，該方法包括兩個主要步驟。首先，使鎢微粒在水溶液中以指定次序與核酸分子、氯化鈣和不含亞精胺的堿(base)混合，對其進行包覆。各組分的濃度可以變化。例如，可以采用任何濃度的核酸分子，只要蕓苔屬植物受體細胞表達該轉移的核酸分子。其次，在實際轟擊時，設定受體細胞距炮管末端的距離以及樣品室內的真空度。這些設定在其它文獻中也有描述(Klein等人，Bio／Technology 6599-563(1988))并可改變。
用高壓氦罐裝置(Biolistic_PDS-1000／He粒子輸送系統)的方法由生產商(BIO-RAD，Hercules CA)提供。具體條件(如用來包覆微粒的核酸分子的濃度、用來加速微粒的氦氣壓以及阻擋篩網距樣品的距離)均可改變。典型地，受體組織通常置于阻擋板托盤下方6-9厘米處。
本文描述的具體的蕓苔屬植物組織制備物可置于培養皿或其它表面上，以基本上任何方式排列，考慮到(Ⅰ)平皿中央區域可能接受濃度最高的核酸分子包覆粒子，因此位于該區域的組織可能在轟擊期間遭受破壞，(Ⅱ)到達細胞的粒子數可能隨細胞距沖擊波區域中心距離的增加而減少，從而使遠離平皿中央的細胞可能未受到轟擊和轉化。Biolistic_PDS-1000／He粒子輸送系統(BIO-RAD，Hercules CA)能向受體細胞輸送更均勻分布的微粒。篩網(較佳的是金屬篩網)可以任選地置于平皿上，以防組織飛濺或噴出。組織可用核酸分子包覆的粒子轟擊一次或多次。另外，可用包覆了一種核酸分子或多種不同核酸分子的粒子轟擊細胞。同樣，可用一批粒子轟擊組織制備物，其中該批粒子含有不同的套，每一套用不同的核酸分子包覆。
鑒定轉化的蕓苔屬植物
在用包覆粒子轟擊蕓苔屬植物組織制備物且核酸分子已經進入一些細胞之后，就需要鑒定含有核酸分子并保留有足夠再生性能的細胞。許多方法均可用來鑒定轉化的植物細胞，這些方法是本領域技術人員所知道的。簡言之，這里描述兩種有用的通用方法。第一種方法是，可以通過各種標準方法篩選轉化的蕓苔屬植物細胞或從該細胞再生的植物中是否存在該核酸分子，這些標準方法包括，但不局限于，測定核酸分子內所含報道物的表達，以及評價該核酸分子的表達引起的對表型的影響(如果有的話)。第二種方法是，可將一種可選擇標記序列與核酸分子一起、或作為核酸分子的一部分來傳送。在這種情況下，可利用選擇性試劑檢測可選擇標記的表達，鑒定轉化細胞。
選擇條件的選擇必須允許轉化細胞生長并積累，同時還要抑制未轉化細胞的生長。由于群體中個別細胞的活力通常高度依賴于其鄰近細胞的活力，因此這種情況會變得復雜。另外，選擇條件還必須不能嚴格得使轉化細胞沒有植物再生性能以及所得植物沒有生育力。因此，應評價選擇試劑對于細胞生活力以及形態的影響。該評價可預先進行，通過實驗產生針對給定選擇試劑和組織的生長抑制曲線，從而制定不抑制生長的濃度范圍。
在采用可選擇標記時，可使受轟擊的蕓苔屬植物組織在非選擇性培養基上從轟擊恢復，或直接轉移到含有選擇試劑的培養基中。
選擇程序通常涉及使受轟擊的組織接觸一種毒性試劑。組織可以經歷試劑濃度的依次變化以及多輪選擇。特定濃度和周期長度通常根據所用的特定試劑而異。另外，選擇程序可包括在初始選擇回合采用濃度較低的毒性劑，然后是在以后的回合中采用較高的濃度。這能使選擇試劑在較長時間內緩慢發揮其毒性作用。開始時，試劑的濃度可以是使大約5-40％的生長受抑制(從生長抑制曲線確定)。目標是使轉化細胞優先生長并分裂，同時抑制未轉化的細胞，但是并不達到抑制轉化細胞生長的程度。一旦有一些個別的轉化細胞充足生長，就將組織轉移到含有較高濃度毒性劑的培養基中，以殺死基本上所有的未轉化細胞。向較高濃度的轉移還減少了未轉化細胞適應該試劑的可能性。較高的濃度可以是抑制約30-100％生長的濃度。第一個選擇周期的長度可以是大約1至4周，通常約為2周。以后的選擇周期可以為大約1至約12周，通常為大約2至10周。通常可將在不增殖細胞背景中的增殖的組織部分或細胞確定為推定的蕓苔屬植物轉化子。經過轟擊的蕓苔屬植物組織還可在整個選擇過程期間的不同時間培養在非選擇性培養基上。
一旦確定了為推定轉化子的部分，就可通過表型和／或基因型分析確認轉化。如果采用一種選擇試劑，則表型分析的一個例子可以包括測定推定轉化子新重與選擇性試劑的各種水平對比上的增加。可采用的其它分析將取決于轉移的核酸分子的功能。例如，如果核酸分子編碼的是酶或其它多肽，則可采用對該特定酶或多肽有特異性的酶促試驗或免疫學試驗。適合檢測轉移核酸分子表達的特異性生物鑒定和化學試驗技術是本領域技術人員熟知的，在這里不作重復。還可通過常規方法如Southern印漬、Northern印漬或PCR分析等來確認核酸本身的存在。
蕓苔屬植物的再生
轉化的蕓苔屬植物細胞可以再生成植物，并可測定所得植物的生育力。簡言之，將經測試呈轉化陽性的細胞置于促進組織分化和植物再生的培養基上。再生培養基的一個例子包括，但不局限于，含有較低濃度的植物生長素(如吲哚-3-乙酸(IAA))和較高濃度的細胞分裂素(如玉米素)的MS培養基。具體的再生方法可根據本領域熟知的標準程序來進行。通常，這些方法需要減低植物生長素的水平。再生培養基還可含有用于選擇培養基中的相同選擇試劑。再生的植物可以在生長室或溫室中生長至成熟，并能發生適當的有性雜交和自交。
重要的是應注意到，植物的再生盡管對于本發明很重要，卻可用任何常規方法來進行。例如，如果已經將可選擇標記導入細胞內，那么可將選擇試劑摻入再生培養基，以進一步確認再生的小植株是轉化的。由于再生技術是眾所周知的，對于本發明并不關鍵，因此可以采用任何技術來實現再生并產生能育的植物。
后代的分析
從轉化的蕓苔屬植物再生獲得的植物稱為R0代或R0植物。R0代植物發生各種有性雜交產生的種子稱為R1子代或R1代。當R1種子發芽后，所得的植物也稱為R1代。
應分析R1代，以確認轉移的核酸分子的成功傳送和遺傳。該分析可用本文描述的鑒定轉化子的任何方法來進行，并可考慮采用植物的任何部分。另外，還可分析任何R1或以后(例如R2、R3、R4等)的植物以及F1或以后(例如F2、F3、F4等)的植物。
從上可以明顯看出，術語“后代(子代)”包括特定細胞、細胞系、植物或植物系的后代，例如在植物上發育的種子以及從這些種子衍生獲得的植物。植物的后代包括在R0、R1、R2以及隨后代植物上的形成的種子，在F1、F2、F3以及隨后代植物上形成的種子、或在BC1、BC2、BC3以及隨后代植物上形成的種子。因此，自交的后代不僅包括最初自花傳粉的R1后代，還包括R2、R3以及隨后代。
培育轉基因蕓苔屬植物
通常，如果能將核酸分子插入許多不同種類中，則本文產生的轉化的蕓苔屬植物的商用價值最高。農場主通常根據成熟性、耐受性和其它農藝學性狀的不同來種植數種植物。另外，農場主必須根據地理位置來選擇品種，因為適應特定生長環境的品種通常不適應另一環境，因為它們在諸如成熟性、抗病性和抗蟲害性等性狀方面有差異。因此，可以有利地將核酸分子插入大量親本蕓苔屬植物株系中，從而能產生許多含有所需核酸分子的品種。這可通過育種程序來方便地實現，其中進行一個變換過程(回交)，將最初能育的轉基因植物與正常的原種純系雜交，然后使子代與正常親本回交。該雜交的后代將發生分離，一些植物將攜帶核酸分子，而另一些則不攜帶核酸分子。然后使確實攜帶核酸分子的植物再次與正常植物雜交，導致后代再次分離。重復該雜交，直至最初的正常親本變換成含有該核酸分子并且具有最初親本中所有其它重要品質的基因工程改造系。對于有待轉變成基因工程改造的原種系的每個原種系均可采用分離的回交程序。這可能是兩個親本使該核酸分子純合所必需的。蕓苔屬植物育種以及將基因從一個系或品種轉移至另一系或品種內所需的技術對于本領域技術人員來說是眾所周知的。
轉基因蕓苔屬植物的應用
如本文所述那樣產生的轉基因植物可用于各種商業和研究目的。可創造轉基因植物用于傳統農業，以具有有利于種植者的性狀(例如農藝學性狀如抗害蟲性或提高產量)、有利于植物收獲產物的消費者的性狀(例如人食物或動物飼料中的營養物含量提高)、或有利于食品加工者的性狀(例如改善的加工性狀)。蕓苔屬植物的化學組成部分如油和淀粉可被抽提出用于食品或工業用途，而且可創造轉基因植物以增加或改善這些組分的水平。植物還可用于為了各種目的的種子生產。
轉基因植物還可用于商業生產其中所含核酸分子編碼的多肽或其它分子，其中將感興趣的表達的分子從植物部分、種子等中抽提或純化出來。另外，來自轉基因植物的細胞或組織可體外培養、生長，或發酵生產所需的分子或用于其它目的(如研究)。
轉基因植物還可用于商業育種程序，或可雜交或培育成相關作物種類的植物。核酸分子編碼的改進可以通過例如原生質體融合從一個蕓苔屬植物種類轉移到另一個蕓苔屬植物種類中。
轉基因植物在研究或育種中有許多用途，包括通過插入誘變產生新的突變型植物，以便確定以后可通過傳統突變和選擇創造的有益的突變株。本發明的方法還可用來產生具有獨特的“特征序列”或其它標記序列的植物，這些序列可用來鑒定獨有的系和品種。
在以下實施例中發明將進一步被描述。這些實例不局限于本發明中權利要求的范圍。
實施例
用特定的組織制備程序通過粒子轟擊產生轉化的蕓苔屬植物。
實施例1-采用剪切組織制備方法的蕓苔屬植物轉化
使蔓菁Westar品種的不育化種子在含有瓊脂和30毫摩爾氯化鈣的MS培養基上于暗處發芽5-6天。此階段具有芽尖的幼苗的高度為3-6厘米。用不育性幼苗作為組織來源的優點是維持供體材料所需的設備、時間和精力最少。收獲這些幼苗的下胚軸，并切成長度為2-3厘米的片。將每片下胚軸片縱向切成兩半，然后置于誘導培養基中，使表皮側與培養基接觸，那就是使新切開的表面大致朝上。誘導培養基是含有0．5-1．0毫克／升2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和0．2-0．3毫克／升激動素的MS培養基。使縱向切片緊密排列，每個平皿約20片。在誘導培養基上培養1-2天后，用核酸包覆的金顆粒轟擊縱向切片。
用來包覆轟擊粒子并轉化非胚胎蕓苔屬植物細胞的核酸分子是pIMC38(圖1)。該構建物含有兩個基因新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。兩個基因均由CaMV 35S啟動子推動，終止于胭脂氨酸合成酶(NOS)基因終止子。35S-NPTII-NOS和35S-GUS-NOS單元以相反方向排列。NPTII基因作為一個選擇標記，如果它合適地表達，它將賦予培養物中轉移細胞以卡那霉素抗性，并使轉化的種子發芽期間有遺傳霉素抗性。
用來轟擊非胚胎蕓苔屬植物細胞或組織制備物的裝置是Biolistic_PDS-1000／He系統(Dupont)。粒子轟擊的步驟按照BioRadUS／EG Bulletin 1688和1689中的方法進行。具體采用的金屬粒子是0．6μ或1．0μ的金粒子。
轟擊后，使縱向切片在誘導培養基中培養3天。然后將培養物轉移到選擇培養基中。選擇培養基與誘導培養基相同，只是加入選擇試劑卡那霉素至最終濃度為25毫克／升。2-3周后，將培養物轉移到再生培養基中，該培養基含有2毫克／升玉米素、0．1毫克／升IAA以及25毫克／升卡那霉素。此后每隔大約兩周，將這些細胞傳代培養到再生培養基上，直至出現綠芽。
選出一株再生植物(命名為“Peter”)，分析NPTII核酸的存在。具體地說，收集″Peter″的葉組織，從那些細胞中抽提出DNA，用NPTII特異性引物進行PCR分析。該分析揭示來自＂Peter＂的細胞含有NPTII核酸(表Ⅰ)。
使再生植物在溫室中生長至性成熟。在“Peter”和無轉基因的商用蔓菁Quantum品種之間進行人工授粉。另使“Peter”自花傳粉。
收獲“Peter”的R1種子，收獲Quantum與“Peter”雜交的F1種子，測試遺傳霉素抗性。將不育化的種子置于含有1．2克／升Bacto-agar和50毫克／升或100毫克／升遺傳霉素(Gibco-LifeSciences，II811-023)的測試培養基中。將種子推入培養基中約0．1-0．4厘米深，隨后每周測定發芽狀態，三周后記錄最后的評分。用下列描述來對種子的發芽狀態評分。通常，當在50毫克／升遺傳霉素測試培養基中生長時，非轉基因的種子生長直至高度為1．5厘米，具有的子葉呈綠色，有黃色至棕色的邊緣，但是根的長度不會超過0．5厘米。另外，非轉基因的種子在50毫克／升遺傳霉素測試培養基中放兩周后不會長成活的幼苗。因此，將在50毫克／升遺傳霉素測試培養基中的這樣的種子確定為NPTII陽性該種子發芽長出幼苗，幼苗綠色子葉的高度超過2厘米，根的長度超過1厘米。另外，將在50毫克／升遺傳霉素培養基中象無遺傳霉素培養基中生長的非轉基因種子一樣迅速正常發芽的種子標記為“++”。
表Ⅰ．再生植物“Peter”、自交后代(R1和R2)以及雜交后代(F1和F2)的分析
++=正常活力、正常的小植物形態；+=中等活力、正常的小植物形態；N／A=不適用；F1=Quantum×Peter；Quantum是非轉基因的商用蔓菁品種。
來自再生植物＂Peter＂(R0)的一些R1種子在含有遺傳霉素培養基上生長時正常發芽，這表明蕓苔屬植物發生轉化(表Ⅰ)。將在遺傳霉素選擇中存活的一些R1幼苗轉移到土壤中，自花傳粉，然后收獲R2種子。這些R2種子有大多數發芽，并在含有遺傳霉素的培養基中正常地強壯地生長。F1(Quantum×Peter)種子在含有遺傳霉素的培養基中正常發芽，但是不象有遺傳霉素抗性的R1或R2那樣強壯生長。因此，NPTII核酸拷貝數以及整合的NPTII核酸的純合特征看來影響NPTII表達水平。將在遺傳霉素選擇中存活的一些F1幼苗轉移到土壤中自花傳粉，收獲并測試Quantum×Peter的F2種子。這些F2種子中約有一半能在含有遺傳霉素的培養基中正常地、強壯地發芽。對R2植物的NPTII特異性PCR分析揭示了一個陽性信號，從而確認NPTII核酸被整合到“Peter”中。然而，“Peter”的所有代中的GUS染色均為陰性。
實施例2-采用研磨組織制備方法的蕓苔屬植物轉化
收獲蕓苔屬植物Westar品種的4-6天齡不育幼苗，棄去下胚軸下部、種皮和根。幼苗的剩余上部含有10-50％的下胚軸、兩個子葉以及一個芽尖。用搗碎機將該上部和液體誘導培養基一起研磨成細胞漿。具體地說，使大約200株幼苗的上部與30毫升誘導培養基混合。使該混合物在搗碎機(33BL79型搗碎機，Warning Products Division，Dynamics Corporation of America)中室溫下浸軟。使所得漿料通過一系列篩網，分成組織大小范圍不同的組。收集組織大小為46-230微米的組，在置于固體誘導培養基上的12個濾膜(直徑為4厘米)上高密度培養。培養3天后，如實施例1所述的那樣，用核酸分子包覆的金粒子轟擊含有研磨組織的濾膜，在誘導培養基上再培育3天。然后將培養物轉移到選擇培養基中培養2-3周，然后在再生培養基上培養直至再生出芽苗。
如實施例1所述的那樣分析再生植物中NPTII核酸的存在。另外，分析這些植物部分的GUS表達。簡言之，表達GUS的細胞在GUS染色試驗后呈藍色。采用的GUS染色試驗由Anne-Marie Stopm在Sean R．Gallagher編輯的《GUS方法用GUS基因作為基因表達的報道物》，103-113頁，Academic Press，San Diego，California，1992中有詳細描述。一些再生的芽苗和葉在GUS染色后顯示出強烈的藍色，這表明轉移的外源GUS核酸序列有表達。
將再生的植物轉移到土壤中并長至成熟。用實施例1所述的種子發芽試驗測試10個R1種子的遺傳霉素抗性。6個種子不能發芽。其余4個種子中的兩個有遺傳霉素抗性，獲得的小植物在這些條件下顯示出中等活力(表Ⅱ)。另外，如上所述，使17個R1種子在遺傳霉素不存在的情況下發芽，對每個幼苗的葉片進行GUS染色。其中11個表現出強烈的藍色(表Ⅱ)。R2植物的GUS染色和NPTII特異性PCR分析揭示了陽性信號。這些結果綜合起來表明，NPTII基因和GUS基因均整合到基因組中，并成功地傳遞給后代。
表Ⅱ．對用研磨方法產生的再生植物的分析
+=中等的活力、正常的小植物形態；N／A=不適用
實施例3-黃芥子的轉化
黃芥子DZJ-01系是一專有的系，它具有的組織培養和再生特征與黃芥子其它系的那些特征相當。用實施例2所述的研磨組織制備方法成功地轉化了DZJ-01系。由于DZJ-01組織在培養物中的生長比蔓菁組織迅速，因此改變一些培養條件。具體地說，如實施例2所述那樣制備DZJ-01組織并進行轟擊。轟擊后，使組織在固體誘導培養基上生長6天。然后將培養物轉移到浮筏(floating raft)系統中，在液體選擇培養基中培養8天，此時將培養基換成液體再生培養基。這兩種液體培養基與實施例2中的對應培養基有相同的組成，只是省略了瓊脂。該浮筏系統包括LifeRaft膜筏(LifeTechnologies，目錄號10518-017)、LifeRaft浮動單元(Life Technologies，目錄號No．10521-011)、具有LifeGuard膜排氣蓋的Magenta容器(Life Technologies，目錄號10678-019)，并如生產商所述的那樣使用。
每周更新再生培養基，直至發育長出綠色芽尖。在形成芽后，將它們轉移到固體再生培養基中，然后轉移到固體無激素MS培養基中。
一株再生的植物(命名為“J．J．”)在上述GUS染色試驗中顯示出強烈的藍色。另外，用GUS特異性引物的PCR分析揭示了強的陽性信號，表明存在GUS特異性序列(表Ⅲ)。這些結果綜合起來提示導入的DNA被整合到R0植物的基因組中。在性成熟時，使“J．J．”自花傳粉，收獲R1種子。為了驗證整合，使R1種子發芽，測試得到的小植物的GUS表達。一些R1幼苗在GUS染色后表現出強烈的藍色，這表明GUS基因整合到黃芥子基因組中。另外，R2植物的GUS染色和NPTII特異性PCR分析揭示了陽性信號，這進一步確認GUS和NPTII基因整合到黃芥子基因組中。
表Ⅲ．再生的黃芥子植物的分析
其它實施例
應理解，盡管本發明已經結合詳細說明對本發明作了描述，但是前述內容的目的是為了描述，并不限制由所附權利要求范圍確定的本發明范圍。其它方面、優點和改進均在下列權利要求的范圍內。
權利要求
1．一種產生轉化的蕓苔屬植物細胞的方法，所述方法包括下列步驟
(a)用核酸包覆的微粒轟擊從非胚胎蕓苔屬植物組織制得的細胞，形成經轟擊的細胞制備物；和
(b)鑒定出已用所述核酸轉化了所述經轟擊制備物的細胞。
2．根據權利要求1所述的方法，其中從非胚胎蕓苔屬植物組織制得的所述細胞是二倍體。
3．根據權利要求1所述的方法，其中所述非胚胎蕓苔屬植物組織來自蕓苔屬植物的幼苗。
4．根據權利要求3所述的方法，其中所述幼苗是4至6天齡的不育的幼苗。
5．根據權利要求1所述的方法，其中通過將所述組織切成至少一片并使所述至少一片與誘導培養基接觸的方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得所述受轟擊細胞。
6．根據權利要求1所述的方法，其中通過以下方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得所述受轟擊細胞，該方法是在大致橫向上切開幼苗的下胚軸，形成至少一片下胚軸片，縱向切開所述至少一片下胚軸片，使所述縱向切片中的至少一片與誘導培養基接觸。
7．根據權利要求1所述的方法，其中通過將所述組織浸軟成細胞漿的方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得所述受轟擊細胞。
8．根據權利要求1所述的方法，其中通過在誘導培養基中將幼苗上部浸軟形成細胞漿的方法從非胚胎蕓苔屬植物組織制得所述受轟擊的細胞，所述上部包括芽尖、子葉和10-50％的下胚軸。
9．根據權利要求7所述的方法，其中富集所述細胞漿中大小為46微米至230微米的細胞物質。
10．根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸編碼多肽或調節多肽的表達。
11．根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸包括反義分子。
12．根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸包括核酶。
13．根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸包括反義寡核苷酸。
14．根據權利要求1所述的方法，其中所述蕓苔屬植物組織來自選自蔓菁、黃芥子、Brassica carinata、黑芥、甘藍和油菜的蕓苔屬植物種類。
15．根據權利要求1所述的方法，其中所述鑒定包括將所述受轟擊的細胞培養在浮選裝置上與液體選擇培養基接觸，選出在所述選擇培養基存在下存活的那些細胞。
16．根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括從所述經鑒定的細胞再生出蕓苔屬植物的步驟。
17．根據權利要求16所述的方法，其中所述再生步驟包括將所述經鑒定的細胞培養在浮選裝置上與液體再生培養基接觸。
18．用權利要求1所述的方法產生的蕓苔屬植物細胞及其后代。
19．一種培養蕓苔屬植物組織的方法，所述方法包括在液體選擇培養基或液體再生培養基存在下在浮選裝置上培養所述組織。
全文摘要
本發明涉及用粒子轟擊方法轉化蕓苔屬植物的方法和材料。具體地說,本發明提供了制備非胚胎蕓苔屬植物組織的方法,從而使蕓苔屬植物細胞能被培養,通過粒子轟擊轉化并再生成植物。另外,本發明提供了穩定轉化的蕓苔屬植物細胞及其后代。本發明還提供了用液體培養基培育蕓苔屬植物組織的方法,從而使轉化的蕓苔屬植物細胞被鑒定出并再生成轉化的蕓苔屬植物。
文檔編號C12N15/82GK1291860SQ9980340
公開日2001年4月18日 申請日期1999年2月25日 優先權日1998年2月26日
發明者陳之征, J·塞利奧 申請人:嘉吉有限公司