專利名稱：旋轉式細胞培養系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種用于動物細胞大規模培養的旋轉式細胞培養系統。
背景技術：
迄今為止，動物細胞培養可分為靜態的二維培養和動態的三維培養兩種方式。前者主要適用于實驗室小規模研究使用，而大規模培養動物細胞必須依靠三維條件下的生物技術。傳統的細胞培養系統主要包括氣升式、攪拌式等，這些種類的培養系統主要問題在于，細胞在反應器內所受到的流體剪切力較大，使得對剪切力很敏感的細胞極易受到損壞，特別是各種干細胞更是如此。因此，干細胞等對剪切力極為敏感的細胞就難以在這些傳統的細胞培養系統內得以大規模培養和擴增。
1991年美國的Schwarz等人首次發明了旋轉式細胞培養技術。該技術是使反應器的外筒不斷轉動而使被培養的動物細胞懸浮于兩個同心套筒之間，細胞代謝所需要的氧氣由附加了硅膠膜的內筒提供。由于該技術不使用攪拌器械或直接通入氣泡，因而可以大大減小反應器內流體的剪切力。但近十年來，這種細胞培養系統主要是用于微重力條件下動物細胞培養方法的研究，而用于地面上細胞培養的旋轉式生物反應器一般均只有外筒而無內筒，因而反應器內的流體剪切力不均勻且難以調整。
1999年美國Leonid Margolis等人以及2002年K，Nakamura等人都發明了內外筒均具備且均可旋轉的、放在CO2培養箱內操作的生物反應器，2002年Vellinger也公開了類似的技術。至此，目前已有的旋轉式細胞培養系統可分為間歇式和連續式換液兩種類型。但他們所采用的間歇式換液是每隔一定時間將細胞與培養基分離開，置換新的培養基，因此存在操作污染且細胞生長環境不穩定等缺點，不利于細胞的生長；即使是連續式換液裝置也仍須放在CO2培養箱內操作，這也難以實現細胞的大規模培養。

發明內容
本發明的目的是提供一種全功能的旋轉式細胞培養系統。它主要包括旋轉式生物反應器、培養基充氧器、培養基外循環系統及電控制系統，具有滲透供氧及反應器內外兩個轉筒均可單獨連續調速、可同向或反向旋轉，可連續或間歇換液，可在CO2培養箱外操作等優點。降低了細胞生長環境的剪切力，提高了物質傳遞效率，有效地克服了現有生物反應器內細胞所受剪切力大、細胞生長環境不穩定及反應器須放在CO2培養箱內操作等技術的不足。實現了在普通實驗室內就可進行三維細胞組織的大規模培養，并提高了細胞培養的效果。
實現本發明的技術方案為(1)細胞生長所需要的CO2濃度為5％、溫度為37℃的氣體由CO2培養箱引出，進入培養基充氧器，由美國Cole-Parmer公司生產的Platinum-CuredReinforced Silicone透氧管滲透到培養基中。
(2)旋轉式生物反應器培養室的內外轉筒均由可調速電動機經齒輪傳動來帶動，由電控制系統隨時調控其轉速及方向。
(3)反應器只有培養室的外筒采用透明且耐高溫的聚碳酸酯材料，其余部分采用不銹鋼材料。
(4)培養室外筒壁上開有一個φ2mm的排氣孔；外筒的法蘭上有一個與培養室相通的、且與外筒壁上的排氣孔呈180°的φ2mm的培養物進樣孔。
(5)內筒的中間處不連通，在這不連通處的兩側，內筒壁上開有有呈對稱分布的8個φ1.5mm的孔，孔的表面覆蓋一層親水微濾膜。
(6)反應器的密封系統采用硅橡膠O型環和軸承為動密封。
(7)在反應器出料口與蠕動泵入口之間依次設有一個廢液出口三通和一個新鮮培養基入口三通。
(8)培養基充氧器、旋轉式生物反應器、新鮮培養基罐、廢液罐及部分管線置于保溫罩內，由電控制系統將保溫罩內的溫度控制在37℃。
本發明的效果和優點是(1)反應器的內外筒均可旋轉，顯著降低了細胞生長環境的剪切力，對剪切力極為敏感的動物細胞的培養非常適用，同時細胞始終處于三維條件下生長，提高了細胞的培養效果；(2)可隨時觀察到培養室內培養物的生長情況，并可隨時將培養基中出現的氣泡由排氣孔排出，避免因氣泡及氣泡破碎對細胞造成損傷；(3)內筒不完全連通及內筒壁上的親水微濾膜既可防止氣泡進入，又可保證培養基養分通入及細胞代謝廢物排出，同時還可保證細胞不被培養基帶走，而始終停留在培養室中增殖生長；(4)培養室的細胞培養空間相當于約800-1000個培養瓶的培養能力，實現了大規模培養。(5)整個系統可置于CO2培養箱外操作，方便易行。
利用本發明的旋轉式細胞培養系統，對成骨細胞及造血干細胞進行了三維培養。結果表明，這三種細胞在此系統內均可以良好生長，十天后的擴增倍數分別可達到二十三倍和四十九倍。


附圖1是本發明所述的旋轉式細胞培養系統的工藝流程圖。
圖中1.CO2培養箱；2.控制臺；3.蠕動泵；4.空氣泵；5.培養基充氧器；6.進液三通閥；7.排液三通閥；8.過濾器；9.新鮮培養基罐；10.廢液罐；11.反應器支架；12.反應器；13.加熱器；14.齒輪；15.可調速電動機；16.底座；17、保溫罩。
附圖2是本發明所述的旋轉式細胞培養系統的反應器結構示意圖。
圖中14.齒輪；18.培養基進料口；19.填料箱A；20.O型環；21.聚四氟乙烯密封壓蓋；22.填料壓蓋；23.空心軸A；24.軸承座A；25.O型環；26.軸承A；27.軸承B；28.軸承座B；29.填料箱B；30.O型環；31.墊片；32.螺栓；33.外筒；34.排氣孔；35.內筒；36.填料箱C；37.空心軸B；38.培養基出料口；39.培養物進樣孔。
附圖3是本發明所述的旋轉式細胞培養系統內筒結構示意圖。
圖中40.O型圈；41.φ1.5mm孔；42.親水微濾膜。
A-A、B-B分別為內筒壁上φ1.5mm孔在不同方向的截面示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖，詳細敘述本發明的具體實施方式
和最佳實施例。
本系統工作前，先將反應器12拆卸下來，用洗滌劑及軟刷將各部件清洗干凈，再用超純水沖洗15-20min。然后用超純水浸泡12hr，撈出并晾干，用70-75％的乙醇溶液浸泡24 hr后晾干并安裝好(各個部件之間安裝得不要太緊以備高溫滅菌)，與相應的連接硅橡膠管線及其它附件分別用不同的高溫滅菌布包好后，一起放入高溫滅菌器中，在121℃下滅菌20min。取出上述三個布包，放入干燥箱60℃下干燥。待其完全干燥并冷卻后，在超凈工作臺上將反應器上架，將各部件緊密連接好，然后按流程安裝該旋轉式細胞培養系統。安裝完畢后，用PBS無菌溶液充滿整個回路并循環2-3hr。之后排出PBS無菌溶液，注入培養基。細胞由培養物進樣孔39注入培養室內。待整個回路充滿培養基后，蓋好保溫罩17，打開控制臺2中控制風扇、加熱器13以及可調速電動機15的電源開關，同時開啟蠕動泵3和空氣泵4，并通過調節旋鈕使反應器內外筒均以適當的轉速旋轉起來(約10rpm左右)，此時整個系統開始工作。
工作時，培養基經蠕動泵3進入培養基充氧器5進行充氧，而后到達培養基進料口18，進入反應器12。在反應器12中，培養基經過左側的空心軸A23，進入培養室內筒35不連通處的左側，透過這一側的小孔41及親水微濾膜42進入培養室外筒33，然后經內筒35右側的親水微濾膜42和小孔41進入到內筒不連通處的右側，再經右側的空心軸B37由培養基出料口38進入蠕動泵。然后再進入培養基充氧器5進行充氧，開始下一輪循環。
在此過程中，對于細胞生長所需要的培養基，可以連續置換，也可間歇置換，具體情況視細胞的成活與生長情況而定。若換液太快，細胞會因生長環境不穩定而死亡或擴增不明顯；若換液間隔時間太長，細胞就會因得不到足夠的養分而死亡或擴增不明顯，最后都會導致細胞培養及擴增失敗。由此可見，在細胞的培養過程中，必須熟悉細胞的各種習性，熟練掌握該旋轉式細胞培養系統的工作原理及操作的關鍵，才能確保細胞的成活及實現大規模培養。
實施例1本實施例為成骨細胞在本系統內的微載體培養結果。
種子細胞的準備無菌條件下取新生3天的SD大鼠的顱蓋骨，放入盛有緩沖液的培養皿中，去除骨膜及結締組織，反復沖洗。將洗凈的顱蓋骨片置于培養皿中，加入0.25％的胰蛋白酶溶液，在37℃條件下恒溫消化15-20min。再用1mg/ml II型膠原酶溶液在37℃條件下消化顱蓋骨片90min。使細胞從骨基質中解離出來。將消化液移至離心管中并離心10min(1000rpm)以沉淀細胞。棄去上清夜，用RPMI1640培養液將沉淀物洗滌兩次。再吹打骨塊，以獲得更多的成骨細胞。重復離心過程，沉淀細胞，制成細胞懸液。將細胞接種于培養瓶，差速粘附2次以純化細胞。將接種好細胞的培養瓶放入CO2培養箱內培養。
微載體的選取與準備微載體的視密度應盡可能接近培養基的密度，以使其更好地懸浮于反應器內。采用的微載體為內心塑料外層玻璃的Bioglass型和Cytodex系列，其密度為1030kg/m3，粒徑在100-200微米。在對原代成骨細胞做第一次傳代時，先將滅菌處理的10μg微載體注入培養瓶，再將細胞接種在微載體的表面，制成細胞/微載體/培養液均勻混合而成的工作液。
成骨細胞在培養室內的接種及培養操作將反應器滅好菌并按流程將系統連接好后，用PBS無菌溶液充滿整個系統并循環1-2hr，排出PBS無菌溶液。然后將細胞/微載體/培養液均勻混合而成的工作液用注射器慢慢注入培養室，再將培養室中剩余的空間用培養液灌滿。培養室內，細胞的初始接種密度為2×104cells/ml。注意，在該過程中，培養室內不能有氣泡，如有氣泡，應及時去除，否則會對細胞造成損傷。之后開啟控溫、通氣和內外筒轉速的控制按鈕，并調整內外筒的轉速使培養室內微載體均勻懸浮。初始轉速為10rpm，培養后期由于微載體上附著了更多的細胞使其尺寸變大，需要將轉速加大到13-15rpm。培養液更換采用間歇式換液，自種入細胞24小時后，每48小時更換約1/3體積的培養液。
培養結果成骨細胞在本旋轉式細胞培養系統內連續培養10天后，細胞從初始的1.8×106cells/ml擴增到4.2×107cells/ml。細胞經堿性磷酸酶ALP檢驗均為正常成骨細胞。
實施例2本實施例為造血干細胞在本系統內的培養結果。
臍血造血干細胞的制備臍血標本取自正常分娩足月兒的胎盤組織，以采血針從臍靜脈取血約60-80ml，注入肝素抗凝的離心管中。然后將臍血用等體積的IMDM培養基稀釋均勻，離心沉降棄去含脂肪的混濁液，再以IMDM稀釋。然后吸取細胞懸液，沿管壁小心加入到等體積的淋巴細胞分離液液面上，以1500rpm離心20min后，收集白細胞層，再加入IMDM液反復洗滌，再以1000rpm離心10min。之后應用免疫磁株法分離純化臍血CD34+造血干細胞。
使用IMDM培養基在24孔板中進行培養，添加20％胎牛血清和細胞因子，每孔1ml，接種密度5×105cells/ml，放入CO2培養箱中培養，每48小時換半量培養基。
造血干細胞在培養室內的接種及培養操作將反應器滅好菌并按流程將系統連接好后，用PBS無菌溶液充滿整個系統并循環1-2hr，排出PBS無菌溶液。然后CD34+細胞以1.1×105cells/ml的密度接種于本生物反應器的培養室內。培養基為IMDM，添加的細胞因子包括干細胞因子SCF，白細胞介素IL-3，IL-6，粒-巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF，促紅細胞生成素EPO及flt-3配體FL。反應器內、外筒轉速均為10rpm，培養液更換采用間歇式換液，自種入細胞24小時后，每48小時更換約1/2體積的培養液。
培養結果CD34+細胞在本旋轉式細胞培養系統內懸浮培養15天后，CD34+細胞擴增到5.4×106cells/ml，擴增倍數達到49倍。
權利要求
1.旋轉式細胞培養系統，主要包括旋轉式生物反應器12、培養基充氧器5、培養基外循環系統及電控制系統2，其特征在于(1)細胞生長所需要的CO2濃度為5％、溫度為37℃的氣體由CO2培養箱1引出，進入培養基充氧器5，透氧管滲透到培養基中；(2)旋轉式生物反應器培養室的內筒35、外筒33均由可調速電動機14經齒輪傳動來帶動，由電控制系統2隨時調控其轉速及方向；(3)在反應器12的出料口38與蠕動泵3入口之間依次設有一個廢液出口三通7和一個新鮮培養基入口三通6；(4)培養基充氧器5、旋轉式生物反應器12、新鮮培養基罐9、廢液罐10及部分管線置于保溫罩17內，由電控制系統控制罩內溫度為37℃；(5)整個系統可放在CO2培養箱外操作，可連續換液，也可間歇換液。
2.根據權利要求1所述的旋轉式細胞培養系統，其特征還在于(1)旋轉式生物反應器12培養室的外筒壁上開有一個φ2mm的排氣孔；外筒33的法蘭上有一個與培養室相通的、且與外筒壁上的排氣孔39呈180°的φ2mm的培養物進樣孔34；(2)旋轉式生物反應器12培養室內筒35的中間處不連通，在這不連通處的兩側，內筒壁上開有呈對稱分布的8個φ1.5mm的孔41，孔的表面覆蓋一層親水微濾膜42；(3)反應器12采用硅橡膠O型環20、25及軸承26、27為動密封；(4)反應器12的進料口18與出料口38固定不動。
全文摘要
旋轉式細胞培養系統屬于生物技術領域，特別涉及一種用于動物細胞大規模培養系統。本發明的技術特征是包括旋轉式細胞培養反應器、培養基充氧器、培養基外循環系統及電控制系統，具有滲透供氧及反應器內外兩個轉筒均可單獨連續調速、可同向或反向旋轉，可連續或間歇換液，可在CO
文檔編號C12M3/00GK1542122SQ20031010505
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優先權日2003年11月7日
發明者孫相彧, 劉天慶, 李香琴, 孫相 申請人:大連理工大學