包含突變indehiscent等位基因的蕓苔屬植物的制作方法

文(wen)檔(dang)序號(hao)：571401閱讀(du)：542來源：國(guo)知局

專利名稱：包含突變indehiscent等位基因的蕓苔屬植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及農業產品，尤其是作物植物領域，特別是十字花科(Brassicaceae)，特別是蕓苔屬的物種，其中，果實開裂性質被調節。更具體地，本發明涉及改進的方法和手段，用于在植物例如十字花科植物，特別是種植來用于種子生產的十字花科植物中，降低落籽(seed shattering)或延遲落籽到收獲之后，同時保持莢果的農藝相關的可脫粒性 (treshability)。本發明提供了編碼蕓苔屬INDEHISCENT蛋白質(IND)的野生型和突變核酸分子以及此類的蛋白質。本發明還提供了包含至少兩種IND基因的蕓苔屬植物，特別是歐洲油菜(Brassica napus)植物，及其細胞、部分、種子和后代，其特征在于，它們在其基因組中包含三個完全敲除型突變ind等位基因，由此果實開裂性質被顯著改變。此外，本發明提供了產生下述蕓苔屬植物的方法，其中落籽被降低，或者其中，落籽被延遲到收獲之后，同時優選保持莢果的農藝相關的可脫粒性，還提供了可從此類植物獲得的種莢果和種子。本發明還提供了檢測工具(試劑盒)和方法，用于檢測生物樣品中一個或多個突變ind和/ 或野生型IND等位基因的存在，以及將一個或多個突變ind和/或野生型IND等位基因轉移至其它植物的方法，和在植物中組合不同ind和/或IND等位基因的方法。特別地，組合合適數量的突變ind等位基因(編碼無功能IND蛋白質或者不編碼IND蛋白質和/或編碼具有顯著降低的體內活性的IND蛋白質)的方法，所述組合的方式使得顯著降低落籽，或者延遲落籽到收獲之后，同時保持莢果的農藝相關的可脫粒性。除此之外，本發明還提供了植物或其部分和/或其后代、種子和種子油以及方法和/或試劑盒的用途。本發明還提供了增加產量，特別是谷粒產量和種子產量的方法和手段。產量增加表型可與降低或延遲的落籽表型分離開。
背景技術：
來自蕓苔屬植物的長角果或莢果在被稱為果實開裂的過程中釋放其種子。長角果由邊緣相連的兩片心皮構成。邊緣之間的縫線形成厚的棱，被稱為假隔膜(r印Ium)。隨著莢果接近成熟，兩片裂另(valve)沿著莢果中脆弱的指定線，從假隔膜逐漸分離，最終導致與假隔膜相連結種子的落粒(shattering)。開裂區界定了裂另解離的精確位置。在作物收獲之前或期間，成熟莢果的種子脫落(shedding)(也被稱為“落籽”或 “莢果掉果”)是發育出干的開裂果實的作物的普遍現象。未成熟的落籽導致降低的種子回收，這對于主要為了種子而種植的作物(例如產油的蕓苔屬植物，特別是油菜)而言是個問題。與未成熟落籽相關的另一問題是下一作物年中的自生生長(volunteer growth)的增加。在油菜中，莢果掉果相關的產量損失為平均20% (Child等人，1998，J Exp Bot 49: 829-838)，但是能夠達到50%，這取決于氣候條件(MacLeod, 1981,Harvesting in Oilseed Rape,pp.107-120 Cambridge Agricultural Publishing, Cambridge)。目前的商業油菜品種對落粒極其易感。在歐洲油菜(B.napus)的現有育種程序中，對落粒的抵抗性鮮有變化，但是在歐洲油菜的二倍體親本(甘藍(B. oleraceae) 和蕪青(B.rapa)以及蕓苔屬的其它成員中(明顯地芥菜(B. jimcea)、埃塞俄比亞芥 (B. carinata)和黑芥(B. nigra))已發現了抗性品系。Kadkol 等人(1986,Aust. J. Botany34(5) 595-601)報道稱，在蕓苔(B. campestris)的某些登記種中，對落粒的抗性增加，這與長角果裂另與假隔膜的連結區域中不存在分離層相關。Prakash和Chopra(1988，Plant breeding 101 :167_168)描述了歐洲油菜中通過非同源重組來自芥菜(Brassica juncea) 的落粒抗性的漸滲現象。Spence等人(1996，J of Microscopy 181 195-203)描述了芥菜的一些品系顯示出較之歐洲油菜品系降低的落粒傾向。Morgan等人，1998 (Fields Crop Research58,153-165)描述了從合成的歐洲油菜發展而來的油菜品系間莢果掉果抗性的遺傳變化，并且推斷，需要很大能量開啟其莢果的品系看起來在開裂區具有增加的維管化，并且在開裂區內具有降低的細胞壁降解。他們還進一步發現了莢果喙(pod beak)長度和導致莢果掉果所需的力之間顯著的負相關。Child和Huttly (1999，Proc IOth Int. Rapeseed Congress)描述了在放射誘導的突變歐洲油菜及其親本栽培種Jet Neuf的種群中莢果成熟的變化，其中，最具抗性的野生型和突變植物顯示出遍布開裂區的細胞群體的高度木質化，并且其中，定位于接近突變體開裂區內邊的維管導管(vascular traces)被描述為有助于保護裂另。Child等人(2003，J Exp Botany54(389) 1919-1930)還描述了在再合成的歐洲油菜品系的莢果中增加的莢果掉果抗性和維管結構改變之間的關聯。但是，傳統育種方法未能在不干擾其它想要性狀(例如早開花、成熟和黑腿病(blackleg)抗性)的同時向歐洲油菜(rape)栽培種中成功引入落粒抗性(Prakash和Chopra，1990，Genetical Research 56 1-2)。已通過突變體分析在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中鑒定出了促進或抑制莢果開裂的若干基因在SHATTERPROOF 1 (SHP1 ；最初被稱為AGL1)和SHATTERPR00F2 (SHP2 ；最初被稱為AGL5) 二者中的組合突變體導致不開裂的長角果(即，在擬南芥中成熟時保持閉合的長角果)(Liljegren等人，2000，Nature 404，766-770)。類似地，在擬南芥中的 INDEHISCENT 基因(被稱為 INDl) (Lil jegren 等人，2004，Cell 116 :843_853 ；PCT 公開 WO 01/79517)中以及 ALCATRAZ(被稱為 ALC ；Raiani 等人 2001，Current Biology 11,1914-1922)中的突變干擾了莢果開裂，導致莢果掉果抗性。SHP和IND的阻遏子 FRUITFUL (FUL)在擬南芥中的組成型表達也導致不開裂的長角果(Ferrandiz等人，2000， Science, 289，436-438)。這些轉錄因子被認為會形成非線性轉錄網絡，控制裂另邊緣同一性和莢果掉果。Liljegren等人(2004, Cell 116:843-853)還描述稱，在擬南芥中，非典型的堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)基因IND指導裂另邊緣分化成分離層和木質化層。與分離層相鄰的木質化細胞沿著內果皮b層的層(每片裂另中的單木質化細胞層)在干燥果實內產生了彈簧樣的張力，作用于其開口。裂另內果皮b層的木質化需要IND、SHP、ALC和FUL (在裂爿中到處表達的MADS結構域轉錄因子)的活性(Liljegren等人，2004，見上；Mandel和 Yanofsky, 1995, Plant Cell 7，1763-1771)。已發現，FUL 和 REPLUMLESS (RPL)(在假隔膜中表達的同源異型域轉錄因子)(Roeder等人，2003，Curr Biol 13，1630-1635)設置了賦予裂另邊緣同一性的基因的邊界(Gu等人，1998，Development 125，1509-1517 ；Ferrandiz 等人，2000，Science, 289,436-438 ；上文的 Roeder 等人，2003)。最后，FILAMENTOUS
FLOWER(FIL)和 YABBY3 (YAB3)-兩個 YABBY家族的轉錄因子(Sawa等人，1999, Genes Dev
13，1079-1088 ；Siegfried 等人，1999，Development 126,4117-4128)和 JAGGED (FAG)-
C2H2 鋅指轉錄因子(Dinneny 等人，2004，Development 131，1101-1110 ;0hno 等人，2004， Development 131,1111-1122)被鑒定為通過促進FUL和SHP以區域特異性方式的表達，冗余性地作用于正確的裂另和裂另邊緣發育(Dirmeny等人，2005，Development 132， 4687-4696)。還已鑒定出了針對大量水解酶(例如內多聚半乳糖醛酸酶，其在來自蕓苔屬植物的莢果中開裂區的程序化損壞中，在莢果開裂期間，具有重要作用)的基因(見例如WO 97/13865 ；Petersen 等人，Plant. Mol. Biol.，1996，31 :517_527)Liljegren等人(2004，Cell 116 :843_853)描述了擬南芥屬IND的五種突變等位基因。在包含這些突變等位基因的植物中存在或不存在開裂區中的木質化細胞，這取決于突變的嚴重程度(嚴重的ind突變體在對應于野生型植物中裂另邊緣的內部部分的區域中不含木質化細胞)，但是在所有情況下，長角果都是不開裂的。Wu等人(2006) ,Planta 224， 971-979)描述了第六種擬南芥屬IND突變等位基因。包含該突變等位基因的植物顯示出在裂爿邊緣和假隔膜的連接處沒有木質化細胞，在七層細胞的區域中含有較少細胞(其看起來包括野生型植物中公知的開裂區和假隔膜邊緣)，并且展示出該層中不完全的胞質分裂。US 2005/0120417和US 2007/0006336描述了從歐洲油菜中鑒定和分離兩種INDl 直向同源物。W099/00503、W001/79517和W00159122描述了使用基因沉默技術(例如反義遏制或共遏制)和誘變對擬南芥屬ALC、IND, AGLl和AGL5基因及其直向同源物表達的下調。Vancanneyt 等人，2002(XIII International Conference on Arabidopsis Research, Sevilla, Spain June 28-July 2 ；2002)報道，在油菜中在 CaMV 35S 啟動子的控制下表達來自擬南芥的FUL，導致產生多種莢果掉果抗性轉化體。此類莢果掉果抗性品系的莢果沒有開裂區，莢果的開口僅能通過應用相當大的壓力隨機破裂裂另來實現。Vancanneyt 等 A 2002 (XIII International Conference on ArabidopsisResearch, Sevilla, Spain June 28-July 2 ；2002)還報道，使用所謂的 dsRNA 沉默技術在擬南芥中沉默IND基因，導致幾乎完全的莢果掉果抗性。98%的轉基因擬南芥屬品系發展出不沿著裂另縫線開口的長角果，其僅能通過向裂另應用相當大的壓力而開重要的是要認識到，盡管落籽在油菜培養中是重要問題，其可通過開發莢果掉果抗性品系來解決，最終仍需要將種子與莢果分離。在正常農業實踐中，這是通過組合收割機對莢果脫粒來實現的。通過組合收割機對莢果脫粒必須進行完全，并且應當對由此釋放的種子僅造成最小限度的損傷。但是，隨著莢果強度的增加，對其脫粒所需的更強的動作導致對種子的損傷水平不可接受。莢果掉果抗性十字花科植物的莢果由此不應強到使其無法在組合收割機中被脫粒的程度(Bruce等人2001，J. Agric. Engng Res. 80，343-350)。WO 2004/113542描述了對十字花科植物中涉及莢果開裂區和裂另邊緣發育的基因的中等dsRNA基因沉默允許分離出具有增加的莢果掉果抗性和降低的落籽的轉基因品系，但是通過施加有限的物理力，其莢果仍可沿著開裂區開口。盡管本領域中可獲得特定IND基因的序列及其突變序列，特別是擬南芥屬和歐洲油菜IND基因序列和突變擬南芥屬IND基因序列，但是人們仍需要更多IND基因序列，例如，在植物(例如歐洲油菜植物)中實現特別想要的對落籽的修飾。在經濟重要的十字花科植物(例如油菜)中對對應于ind的突變等位基因的分離是費時費力的任務。此外，油菜中雙二倍性以及相應基因隨之的功能冗余使得此類分離復雜化。如發明內容、附圖、發明詳述、實施例和權利要求中描述的多種實施方式所指出的，通過本發明實現了這些和其它目的。

發明內容
本發明的發明人發現，可通過控制在種子莢果中“功能性表達(即導致產生功能性(生物活性)IND蛋白質)”的IND基因/等位基因的數量，來控制蕓苔屬植物中的果實開裂性質。通過組合多種完全敲除型突變IND等位基因(“ind等位基因”)，同時保持最小數量的野生型IND等位基因，產生最小水平的功能性IND蛋白質，可對種子莢果的開裂性質加以修飾，更具體地，可增加莢果掉果抗性，可降低落籽，或者可將落籽延遲到收獲之后，同時保持莢果的農藝相關的可脫粒性，使得通過應用有限的物理力，莢果仍可沿著開裂區開口。我們認為，需要最小數量的野生型IND等位基因，以使得種子仍能與莢果分離，特別是通過組合收割機對莢果進行脫粒，使得對莢果的脫粒進行完全，并且對由此釋放的種子的損傷最小。因此，在一個方面，本發明提供了包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物，特別是歐洲油菜植物(及其部分，例如種子莢果和種子)，其特征在于，其在其基因組中包含3個完全敲除型突變IND等位基因，特別是IND-Al和/或IND-Cl基因的，并且，其中，植物的莢果掉果抗性較之不包含突變IND等位基因的植物的莢果掉果抗性而言顯著增加，但是其中，植物優選保持莢果的農藝相關的可脫粒性。在另一方面，本發明提供了編碼野生型和/或突變IND蛋白質的(經分離的)核酸序列及其片段，以及使用這些核酸序列修飾植物的果實開裂性質的方法。本發明還提供了蛋白質本身及其用途。本發明還涉及植物及其細胞、部分、種子和后代，其中包含至少一個完全敲除型突變IND等位基因，以及由此導致的較之包含編碼相應功能性IND蛋白質的IND等位基因的植物及其細胞、部分、種子和后代而言降低的量的功能性IND蛋白質。此類植物及其細胞、部分、種子和后代可用于獲得具有經修飾的果實開裂性質的植物，特別用于獲得具有顯著降低的落籽并且保持莢果的農藝相關的可脫粒性的蕓苔屬植物。在本文中使用時，“植物部分”包括源于本發明植物的任何物體，包括植物部分，例如，細胞、組織、器官、種子、種子莢果、種子粗粉(seed meal)、種子餅(seed cake)、種子脂肪或油。在另一方面，本發明涉及具有經修飾的落粒抗性的種子莢果，其可從根據本發明的植物獲得，本發明還涉及所述種子莢果的用途，例如用于栽種和種植來自植物的后代。在本發明的又一方面，提供了產生和選擇含有至少一個完全敲除型ind等位基因的植物及其細胞、部分、種子和后代的方法。特別地，提供了下述方法，用于產生和選擇包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物(特別是歐洲油菜植物)及其細胞、部分、種子和后代，其中含有存在于基因組中至少兩個不同IND基因座中至少一個處的至少一個完全敲除型突變ind等位基因，例如位于蕓苔屬IND-Al和IND-Cl基因的兩個不同基因座中至少一個處，以及用于區分突變ind等位基因和野生型IND等位基因在植物或植物部分中的存在。因此，提供了用于產生和/或鑒定ind等位基因或包含此類等位基因的植物或植物部分，以及用于將合適數量的ind等位基因和/或不同類型的ind等位基因組合于單株植物中由此顯著修飾該植物的果實開裂性質的方法(例如誘變和/或標記輔助選擇)。在本發明的另一實施方式中，用本發明的突變IND等位基因增加從蕓苔屬植物收獲的種子或谷粒的產量。增加的產量可以是降低或延遲落籽的結果，但其也可獨立于降低或延遲的落籽。特別地，提供了包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物或其細胞、部分、種子或后代，其特征在于這些植物在其基因組中包含如本文所述的兩個突變純合IND等位基因。圖例

圖1 編碼來自歐洲油菜的野生型IND-Al蛋白質的IND-Al基因的圖示(SEQ ID NO 5)圖2 編碼來自歐洲油菜的野生型IND-Cl蛋白質的IND-Cl基因的圖示(SEQ ID NO 7)圖1和圖2中，實施例中描述的突變的位置(根據實施例中描述的其各自的 “ind-xl-EMSxx”名稱為“EMSxx”)以垂直線示出；IND特異性探針的長度和位置(根據其各自的SEQ ID N0:XX稱為“ID xx”)通過IND基因圖示下的水平線示出；IND特異性引物的位置(根據其各自的SEQ IDN0:xx稱為“ID xx”)以箭頭示出。一般性定義“增加莢果掉果(pod shatter)抗性”和“降低莢果掉果”在本文中使用時指蕓苔屬植物的減少的落籽趨勢和/或落籽時機的延遲，特別是延遲到收獲之后，所述植物的果實正常情況下不同步成熟，而是順序成熟，因此一些莢果爆裂開，在收獲之前或期間脫離其種子。對莢果掉果的抗性水平與“張力分離測試”中破壞莢果所需的力(Davies和Bruce， 1997，J Mat Sci 32 :5895_5899 ;Morgan等人，1998，Fields Crop Research 58，153-165)， “隨機沖擊測試(random impact test)，，中例如20秒(“IP20” ；上文所述Morgan等人， 1998)、9. 7 或 17 秒(Bruce 等人，2002，Biosystems Eng 81(2) 179-184)之后剩下的完整莢果的數量，隨機沖擊測試中莢果樣品的半壽期(“LD50”，即，在測試的莢果樣品中使得 50%的莢果開口所需的處理時間)和“落粒的田間計分”(上文所述Morgan等人，1998)正相關，并可通過例如測定它們來測量所述水平。隨機沖擊測試(RITs)和在此類RITs中界定莢果樣品半壽期的算法已被描述于Bruce等人，2002 (上文)、Morgan等人，1998 (上文) 和下文實施例中。兩份公開文件都通過引用并入本文。簡言之，將完整成熟莢果的樣品放在有鋼球的封閉鼓室中，然后劇烈振蕩鼓室，振蕩時間逐漸增加(例如10秒、20秒、40秒、 80秒)。每段時間后，開啟鼓室，對被破壞和損傷的莢果的數量加以計數。通過將線性χ線性曲線擬合至所有可獲得的數據，估計樣品中一半的莢果被破壞所需的時間(“莢果半壽期”或“LD50”)，來計算每種品系的落粒抗性水平的最為精確的估計。但是重要的是，莢果主要沿著開裂區開口，并不如不開裂的莢果可能發生的那樣簡單地粉碎。“莢果掉果抗性的農藝相關的增加”在本文中使用時指植物中莢果掉果抗性的增力口，導致田間(收獲前)莢果掉果相關產量損失低于針對該植物在田間通常觀察到的那樣。對于油菜而言，田間莢果掉果相關的產量損失被報道為對于具有平均良好生長條件的季節而言，大約11% ；以及對于具有平均不良生長條件的季節而言，大約25%。如Bruce等人，2002(BiOSyStemS Eng 81(2) 179-184)所描述的，在隨機沖擊測試中，在這些種子損失水平和分別9. 7秒及17秒的處理時間時的種子損失水平之間存在正相關。或者，為確定植物中莢果掉果抗性水平是否是農藝相關的，可將植物的莢果樣品半壽期(“LD50”，見上文) 與已知具有平均莢果掉果抗性水平的植物(例如對油菜而言，所有目前可商業獲得的油菜品種)的莢果樣品半壽期加以比較。
在本文中使用時，“莢果掉果(pod shattering)或落籽(seed shattering) ”或 “果實或莢果開裂”指在種子成熟之后發生于果實中的過程，其中，裂另從中隔膜(septum) 分開，釋出種子。破壞的區域(即“開裂區”)沿著裂另和假隔膜(外隔膜)之間的果實全長延伸。成熟時，“開裂區”實質上(essentially)是裂另和假隔膜中的木質化細胞區域之間的非木質化的層。由于開裂區的細胞壁松弛和長角果中干燥細胞的差異性機械性質建立的張力的組合，導致開裂發生。在本文中使用時，蕓苔屬“果實”指蕓苔屬植物的從融合的心皮構成的雌蕊群發育來的器官，其在受精后生長成為含有發育中的種子的“(種子)莢果”或“長角果”。蕓苔屬“(種子)莢果”或“長角果”由果實的壁(心皮)構成，其包括由隔膜分開的兩個子囊腔 (Iocule)0 “開裂區”在與隔膜相鄰的心皮邊緣發育，并沿著長角果的長度延伸。開裂區的細胞最終開始降解，這削弱了心皮壁或裂另與隔膜之間的聯系。細胞黏著的損失限于開裂區的細胞，其是中層損壞導致的(Meakin和Roberts，1990，J Exp Bot 41，995-1011)。“開裂區”在本文中使用時指植物(特別是蕓苔屬植物)的雙裂另莢果兩側上的縫線中含有的簡單的薄壁組織細胞層。開裂區位于莢果的裂另邊和中心假隔膜之間(含有通向柄(stalk)或花梗的主維管束)。開裂區中細胞的脫離在莢果衰老期間發生，其在莢果達到完全成熟的時候完成(上文的Meakin和Roberts，1990)。然后可發生裂另分離。開裂區含有維管導管，其從莢果壁延伸到花梗(柄)和假隔膜。莢果掉果的過程僅在外力破碎易損的維管細導管(vascular thread)之后發生，令裂另分離，種子落到地面。這在株冠(canopy)干擾期間發生，例如通過將收獲期間的接觸和聯合收割。維管組織含有增厚的木質化細胞，其形成厚角細胞群，它們被發現與傳導細胞相鄰(上文的Meakin和Roberts， 1990)。這向組織提供了剛性，并且假定地，對破碎的一定抗性。在本文中使用時，“農藝相關的可脫粒性”指莢果，特別是油菜的莢果在允許莢果完全開口的物理力施加時對沿著莢果的開裂區開口同時伴隨種子釋放的抗性，同時防止對種子的損傷，例如當它們用于聯合收割機中時。已經在隨機沖擊測試中的莢果樣品半壽期 (“LD50”)與其可脫粒性之間發現了正相關。油菜莢果樣品半壽期(按照實施例所述進行的RIT中測定的)(其對應于農藝相關可脫粒性)應當不超過80秒。對于商業可獲得的油菜品種的控制品系而言，典型的樣品半壽期值為大約10秒。因此，具有顯著增加的莢果掉果抗性的具有農藝相關可脫粒性的品系在RIT中具有大約10至大約80秒之間，大約10至大約60秒之間，大約10至大約50秒之間，大約20至大約60秒之間，大約20至大約50秒之間，大約40至大約60秒之間，大約57秒的莢果樣品半壽期。“作物植物”指作為作物栽培的植物物種，例如歐洲油菜(AACC，2n = 38)、芥菜 (AABB，2n = 36)、埃塞俄比亞芥(Brassica carinata) (BBCC, 2n = 34)、蕪青(Brassica rapa)(同義詞，蕓苔)(AA，2n = 20)、甘藍(Brassica oleracea) (CC，2n = 18)或黑芥 (Brassica nigra) (BB,2n = 16)。該定義并不包括雜草，例如擬南芥。術語“核酸序列(或核酸分子)”指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，特別是編碼根據本發明的蛋白質或蛋白質片段的DNA。“內源核酸序列”指植物細胞內的核酸序列，例如存在于蕓苔屬細胞的核基因組中的IND基因的內源等位基因。“經分離的核酸序列”用于表示不再處于其天然環境中的核酸序列，例如，體外或在重組細菌或植物宿主細胞中。
術語“基因”指細胞中的下述DNA序列，其中包含有被轉錄為RNA分子(例如前mRNA，包含內含子序列，其再被剪接為成熟的mRNA，或者直接轉錄為沒有內含子序列的 mRNA)的區域(被轉錄的區域)，其與調控區域(例如啟動子)有效相連。因此，基因可以包含一些有效的連接的序列，例如啟動子、包含例如翻譯起始涉及的序列的5’前導序列，(蛋白質)編碼區(cDNA或基因組DNA)和包含例如轉錄終止位點的3’非翻譯序列。“內源基因”用于與“外來基因”、“轉基因”或“嵌合基因”區分，指來自某植物屬、物種或品種的植物的基因，不是通過轉化引入植物的(即，不是“轉基因”)，而是通常存在于所述植物屬、物種或品種的植物中的，或者是從其通常存在的另一種植物屬、物種或品種的植物中，通過普通的育種技術或通過體細胞雜交(例如，通過原生質體融合)，引入到植物中的。相似的，基因的“內源等位基因”不是通過植物轉化引入到植物或植物組織中的，而是例如通過植物誘變和/或選擇產生的，或通過篩選天然的植物群體獲得的。 “表達基因”或“基因表達”指這樣的過程，其中與合適的調控區(特別是啟動子) 有效連接的DNA區域，轉錄成RNA分子。然后，RNA分子在細胞內被進一步加工(通過轉錄后過程)，例如，通過RNA剪接和翻譯起始，翻譯成氨基酸鏈(多肽)，并且通過翻譯終止密碼子結束翻譯。術語“功能性表達”在本文中用于表示生產了功能性蛋白質，術語“非功能性表達”表示生產的蛋白質具有顯著降低的或沒有功能(生物學活性)，或者未生產蛋白質 (也參見下文)。術語“蛋白質”或“多肽”可互換使用，其表示由氨基酸的鏈構成的分子，無關特定作用模式、大小、3維結構或來源。IND蛋白質的“片段”或“部分”因此仍可被稱作“蛋白質”。“經分離的蛋白質”用于表示不再處于其天然環境中的蛋白質，例如體外或在重組細菌或植物宿主細胞中。術語“轉錄因子”用于表示由至少兩個不同結構域——DNA結合結構域和活化或阻遏結構域構成的蛋白質，它們一共運作，以調節從靶基因啟動子轉錄起始的速率(Ptashne，1988,Nature 335,683-689)。術語“堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)結構域轉錄因子”用于表示這樣的轉錄因子，其除了包含bHLH DNA結合結構域(Heim等人，2003，Mol Biol Evol 20,735-747 ;Toledo-0rtiz 等人，2003，Plant Cell 15,1749-1770)之外，還包含已知對于調控基因表達來說重要的結構域，其在氨基酸水平上在來自不同物種的相關蛋白質中可能是保守的(Quong等人，1993，Mol Cell Biol 13，792-800)。包含bHLH結構域的轉錄調控子通過堿性區域中的殘基結合DNA，同時螺旋-環-螺旋結構域促進二聚化，允許家族成員形成異源或同源二聚體(Murre等人，1989，Cell 56，777-783)。術語“ IND基因”在本文中表示編碼INDEHISCENT (IND)蛋白質(其是種子散布所需的bHLH結構域轉錄因子)的核酸序列(Liljegren等人，2004，Cell 116:843-853)。在本文中使用時，術語“等位基因”表示在特定基因座上的基因的一種或多種備選形式。在生物的二倍體(或雙二倍體)細胞中，給定基因的等位基因位于染色體上的特定位置或基因座上。同源染色體對的每條染色體上存在一個等位基因。如本文中使用的，術語“同源染色體”意指這樣的染色體，所述染色體含有相同生物學特征的信息，在相同基因座上含有相同的基因，但可能是這些基因的不同等位基因。同源染色體是在減數分裂過程中成對的染色體。“非同源染色體”代表了生物體的所有生物學特征，形成一組，而細胞內的組數被稱為倍性。二倍體生物含有兩組非同源染色體，其中每組同源染色體繼承自不同的親本。在雙二倍體物種中，實質上存在兩組二倍體基因組，從而將兩組基因組的染色體稱為部分同源染色體(相似的，兩組基因組的基因座或基因被稱為部分同源基因座或基因)。二倍體或雙二倍體的植物品種在特定的基因座可以包含大量的不同等位基因在本文中使用時，“雜合”表示這樣的遺傳條件，此時在特定基因座上存在兩種不同的等位基因，它們各自位于細胞中同源染色體的相應的對上。相反，在本文中使用時，術語“純合”表示這樣的遺傳條件，此時在特定基因座上存在兩個相同的等位基因，它們各自位于細胞中同源染色體的相應的對上。在本文中使用時術語“基因座”表示染色體上發現了例如基因或遺傳標記的特定位置或位點。例如，“IND-A1基因座”表示A基因組的染色體上可發現IND-Al基因(兩種 IND-Al等位基因)的位置，“ IND-Cl基因座”表示C基因組的染色體上可發現IND-Cl基因 (兩種IND-Cl等位基因)的位置。根據本發明中無論何時提到“植物”，均應當理解，除非另有指明，此時還包括植物部分(細胞，組織或器官，種子莢果，種子，已分離的部分例如根、葉、花、花粉等等)，保留有親本的區別性特征(尤其是果實開裂性質)的植物后代，例如，通過自交或雜交獲得的種子，例如雜交體種子(通過將兩種近交親本品系雜交獲得的)，從其獲得的雜交體植物和植物部分。“分子測定(或測試)”在本文中表示這樣的測定，其指示(直接或間接)一種或多種特定IND等位基因是否存在于一個或兩個IND基因座(例如，一個或兩個IND-Al或 IND-Cl基因座)上。在一種實施方式中，其允許人們確定任何個體植物中的基因座上特定 (野生型或突變)等位基因是純合還是雜合的。“野生型”在本文中使用時表示植物或基因在自然界最常出現的典型形式。“野生型植物”指具有此類植物在天然種群中最常見表型的植物。“野生型等位基因”指產生野生型表型所需的基因等位基因。相反，“突變植物”指具有此類植物在天然種群中的不同的稀少表型的植物，或通過人類的干涉，例如通過誘變產生的植物，并且“突變等位基因”表示產生突變表型所需的基因等位基因。在本文中使用時，術語“野生型IND” (例如野生型IND-Al或IND-C1)表示在植物 (特別是十字花科植物，尤其是蕓苔屬植物)中發現的天然存在的IND等位基因，其編碼功能性IND蛋白質(例如，分別地，功能性IND-Al或IND-C1)。相反，術語“突變IND"(例如突變IND-Al或IND-C1)在本文中使用時表示不編碼功能性IND蛋白質的IND等位基因，艮口，編碼非功能性IND蛋白質(即，分別是非功能性的IND-Al或IND-C1)，或者根本不編碼 IND蛋白質的IND等位基因，非功能性IND蛋白質在本文中使用時指不具有生物活性或較之相應野生型功能性IND蛋白質而言具有顯著降低的生物活性的IND蛋白質。此類“突變 IND等位基因”(也被稱為“完全敲除型”或“無效”等位基因)是野生型IND等位基因，其在其核酸序列中包含一處或多處突變，其中所述突變優選在細胞中體內產生顯著降低(絕對或相對)的功能性IND蛋白質的量。在本文中使用時，“完全敲除型IND等位基因”是突變IND等位基因，其在植物(例如具有兩個完全敲除型IND-Al等位基因和兩個完全敲除型 IND-Cl等位基因的歐洲油菜植物)中每個IND基因座上以純合狀態的存在導致該植物中的莢果掉果抗性的增加，其高到不能仍然保持農藝相關。編碼IND蛋白質的核酸序列的突變等位基因在本文中被命名為“ind” (例如分別為ind-al或ind-cl)。突變等位基因可以是“天然突變”等位基因，這是在自然界發現的突變等位基因(例如沒有人應用誘變劑的情況下自發產生的)，或者“誘導的突變”等位基因，這是通過人干涉誘導的，例如通過誘變。 “顯著降低的功能性IND蛋白質的量”(例如功能性IND-Al或IND-Cl蛋白質)指包含突變IND等位基因的細胞生產的功能性IND蛋白質的量較之不包含突變IND等位基因的細胞生產的功能性IND蛋白質的量而言降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%或100% (即，細胞不生產功能性IND蛋白質)。該定義包括產生不具有體內生物活性的“非功能性” IND蛋白質(例如截短的IND蛋白質)，功能性IND蛋白質絕對量的降低(例如，由于IND基因的突變導致沒有功能性IND蛋白質被制造出來)和/或生產較之功能性野生型IND蛋白質的活性而言具有顯著降低的生物活性的IND蛋白質(例如下述 IND蛋白質，其中對于被編碼的IND蛋白質的生物活性而言關鍵的一個或多個氨基酸殘基 (如下文所例示)被另外的氨基酸殘基取代)。術語“突變IND蛋白質”在本文中使用時指突變IND核酸序列(“ind等位基因”)編碼的下述IND蛋白質，其中所述突變導致較之非突變野生型IND序列(“IND等位基因”)編碼的IND蛋白質的活性而言顯著降低和/或沒有的體內IND活性。“誘變”在本文中使用時指這樣的過程，其中對植物細胞(例如多個蕓苔屬種子或其它部分例如花粉等等)應用在細胞DNA中誘導突變的技術，例如將其與誘變劑接觸，例如與化學物質(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亞硝基脲(ENU)等等)或電離輻射(中子(例如在快中子誘變等等)、α射線、γ射線(例如通過鈷60源提供的)、Χ-射線、UV輻射等等) 或上述中兩種或多種的組合接觸。因此，對一個或多個IND等位基因的想要的誘變可通過使用化學手段(例如通過將一種或多種植物組織與甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亞硝基脲等接觸)或通過使用物理手段(例如χ射線等等或通過Y輻射，例如鈷60源提供的)來進行。通過照射制造的突變通常是大的缺失或者其它明顯的損傷，例如易位或復雜重排，而通過化學誘變劑制造的突變通常是更離散的損傷，例如點突變。例如，EMS烷基化鳥嘌呤堿基，其導致堿基錯配烷基化的鳥嘌呤將與胸腺嘧啶堿基配對，主要導致G/C向A/T的轉變。誘變之后，使用已知技術從經處理的細胞再生蕓苔屬植物。例如，可根據傳統種植流程，栽種得到的蕓苔屬種子，自花授粉后，在植物上形成種子。或者，可選出雙單倍體小植株，立即形成純合植物，例如如 Coventry 等人(1988,Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci.Techn.Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)所述。通過此類自花授粉在這代或后續代中形成的其它種子可被收獲，并針對突變IND等位基因的存在對其加以篩選。已知若干技術可用于篩選特定的突變等位基因，例如 Deleteagene (Delete-a-gene ;Li 等人，2001，Plant J 27:235-242) 使用聚合酶鏈式反應(PCR)測定，來篩選通過快中子誘變產生的缺失突變，TILLING (基因組中靶向誘導局部損傷；McCallum等人，2000，Nat Biotechnol 18:455-457)鑒定EMS誘導的點突變，等等。針對特定突變IND等位基因的存在加以篩選的其它技術被描述于下文實施例中。在本文中使用時，提到植物使用時，術語“非天然存在”表示具有經過人工修飾的基因組的植物。轉基因植物，例如是含有外源核酸分子(例如包含轉錄區域的嵌合基因，當其轉錄時，產生能降低內源基因(例如根據本發明的IND基因)表達的生物活性RNA分子) 并且因此已經經人工遺傳修飾的非天然存在的植物。此外，在內源基因中含有突變(例如內源IND基因中的突變(例如在調控元件或在編碼序列中)，由于暴露給誘變試劑導致的) 的植物也被認為是非天然植物，因為其已經經人工遺傳修飾過。此外，下述特定物種(例如歐洲油菜)的植物也被認為是非天然存在的植物，所述植物在內源基因(例如內源IND基因)中含有天然不存在于該特定植物物種中的突變，這是用該植物相同或不同物種(例如芥菜或蕪青)的植物進行的例如定向育種過程，例如標記輔助育種和選擇，或者基因滲入的結果。相反，僅含自發或者天然存在的突變的植物，即，沒有經過人工遺傳修飾的植物，不是本文定義的“非天然存在的植物”并且因此不包括在本發明內。本領域技術人員理解，非天然存在的植物通常具有較之天然存在的植物而言經改變的核苷酸序列，但非天然存在的植物也可以是經過人工遺傳修飾但是不改變其核苷酸序列，例如通過修飾其甲基化模式來進行。
術語基因或蛋白質的“直向同源物”在本文中指在另一個物種中發現的同源基因或蛋白質，其具有與基因或蛋白質相同的功能，但(通常)從物種具有偏離的基因(即，通過物種形成從共同的祖先進化的基因)的時間點開始，其序列偏離。因此，可以基于序列比較(例如，基于整個序列或特定結構域的百分比序列同一性)和/或功能分析，在其它的植物物種(例如，芥菜等)中鑒定歐洲油菜IND基因的直向同源物。本文中使用的“品種”與UPOV規范一致，指在單個已知最低級別的植物分類單位中的植物分組，所述分組可以通過由給定基因型或基因型的組合所導致的特征的表達來定義，可以通過至少一種所述特征的表達來與任何其它植物分組進行區分，并且在關于它進行無變化(穩定)繁殖的適合性方面可認為是一個單位。術語“包含”理解為具體說明了所陳述部分、步驟或組分的存在，但不排除存在一種或多種其它的部分、步驟或組分。因此，包含一些性狀的植物可以包含其它的性狀。可以理解，當以單數形式(例如，植物或根)指代詞時，復數形式(例如，復數的植物，復數的根)也包括在內。因此，通過不定冠詞但屬性是(“a”或“an”)指代元件時，不排除存在一個以上的元件的可能性，除非上下文明確的要求有且僅有一個元件。因此，不定冠詞單數形式(“a”或“an”)通常意指“至少一個”。出于本發明的目的，兩個相關核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”表示為百分比，指兩條最優比對的序列中具有相同殘基的位置數(X 100)除以比較的位置數。將空位視為具有不相同殘基的位置，所述空位是比對中這樣的位置，所述位置上的殘基存在于一條序列中，而不存在于另一條序列中。根據European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice 等人，2000，Trends in Genetics 16(6) :276_277 ；參見例如 // www. ebi. ac. uk/emboss/align/index, html)中的 Needleman 禾口 Wunsch 總體對比算法 (Needleman 和 Wunsch，1970，J Mol Biol 48(3) :443_53)，使用缺省設置(空位開放罰分= 10 (對于核苷酸)/10 (對于蛋白質)和空位延伸罰分=0. 5 (對于核苷酸)/0. 5 (對于蛋白質))，通過在全長比對兩條序列來發現兩條序列的“最優比對”。對于核苷酸，使用的缺省評分矩陣是EDNAFULL，而對于蛋白質，缺省的評分矩陣是EBL0SUM62。如本文中使用的，“基本相同(subtantially identical) ”或“實質相似 (essentially similar) ”指，當如上述進行最優比對時，至少具有某一最小百分比的序列同一性(如下文進一步定義)的序列。可以使用“嚴格雜交條件”來鑒定與給定的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環境中可以不同。通常，選擇的嚴格條件是比特定的序列在定義的離子強度和PH下的熱解鏈點(Tm)低約5°0。1是(在定義的離子強度和pH下)50% 的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。通常，所選擇的嚴格條件是在PH7和至少60°C的溫度下，鹽濃度為約0.02摩爾。降低鹽濃度和/或增加溫度，可增加嚴格性。用于RNA-DNA 雜交的嚴格條件(Northern印跡，使用探針例如IOOnt)是，例如包括至少一次在63°C下，在 0. 2X SSC中洗滌20min的條件，或等價的條件。“高嚴格條件”可以例如通過如下提供在65°C的水溶液中雜交，所述溶液含有 6x SSC (20x SSC 含有 3. OM NaCl，0· 3Μ Na-檸檬酸，ρΗ 7. 0), 5x Denhardt ‘ s(100X Denhardt，s含有2 % Ficol 1，2 %聚乙烯吡咯烷酮，2 %牛血清白蛋白)，0. 5 %十二烷基硫酸鈉(SDS)，和作為非特異性競爭物的20 μ g/ml變性的載體DNA (單鏈魚精子DNA，具有平均長度為120-3000核苷酸)。在雜交后，可以在若干步驟中進行高嚴格洗滌，最終洗滌(約 30分鐘)是在雜交溫度下，0. 2-0. IX SSC,0. 1% SDS中進行。
“中嚴格條件”指與上述溶液雜交等價的條件，但是在約60_62°C。中等嚴格洗滌可以在雜交溫度下，IX SSC,0. 1% SDS中進行。“低嚴格性”指與上述溶液雜交等價的條件，但是在約50-52°C。低嚴格洗滌可以在雜交溫度下，2X SSC, 0. 1% SDS中進行。還參見Sambrook等人，(1989)以及Sambrook和 Russell (2001)。“增加的收獲產量”或“增加的種子或谷粒產量”指較之從相似量的無突變IND等位基因的等基因(isogenic)植物收獲的種子或谷粒的量而言，從多株植物(每株包含根據本發明的突變IND等位基因)收獲的更大量的種子或谷粒。產量典型地以每表面單位收獲的種子的體積單位表示，例如蒲式耳/英畝或Kg/ha。產量增加典型地以百分比表示，其中參照或對照植物的產量計為100%，根據本發明的植物的產量以相對對照植物的產量的％表示。在根據本發明的蕓苔屬植物中觀察到的產量增加范圍為至少101%至至少124%，預計可取得更高的產量增加。產量增加還可在104%至108%或105%至110%的范圍內。發明詳述歐洲油菜(基因組AACC，2n = 4x = 38)是異源四倍體(雙二倍體)物種，由于其來源于雙倍體祖先，因此其含有實質上兩個雙倍體基因組(A和C基因組)，其在基因組中包含兩個IND基因。發明人發現，一個IND基因位于A基因組上(本文中稱為“IND-Al”)，一個位于C基因組中(本文中稱為“IND-C1”)。IND-Al基因被認為與IND-Cl基因“部分同源”，即“A基因”被發現于A基因組中，其來自雙倍體祖先蕪青(AA)，“C基因”被發現于歐洲油菜的C基因組上，其來自雙倍體祖先甘藍(CC)。如任何雙倍體基因組中一樣，針對每個IND基因，基因組的每個IND基因座上可體內存在兩個“等位基因”(一個等位基因是在一條染色體上發現的基因序列，另一個則在同源染色體上)。在任何給定的植物中，這兩個等位基因的核苷酸序列可相同(純合植物)或不同(雜合植物)，雖然在整個物種種群中，對于每個IND基因而言，存在的不同的可能的等位基因的數量可遠大于2。還發現，在兩個IND基因中的僅一個中(即，IND-Al或IND-Cl中)，對完全敲除型ind等位基因而言是純合的歐洲油菜植物較之不包含突變IND等位基因的歐洲油菜植物而言不顯示出顯著增加的莢果掉果抗性，而在兩個IND基因中針對完全敲除型ind等位基因均為純合的歐洲油菜植物中，莢果掉果抗性顯著增加，但是莢果掉果抗性的水平太高以至于無法保持農藝相關的可脫粒性。相反，在包含兩個歐洲油菜IND基因的三個完全敲除型ind等位基因的歐洲油菜植物中，莢果掉果抗性顯著增加至這樣的水平其中，植物保持莢果的農藝相關可脫粒性。我們認為，為了獲得顯示出增加的莢果掉果抗性同時保持莢果的農藝相關可脫粒性的植物，可需要在包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物(特別是包含 IND-Al和IND-Cl基因的歐洲油菜植物)中存在三個完全敲除型ind等位基因。
因此在本發明的一種實施方式中，在本文中提供了包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物，特別是包含IND-Al和IND-Cl基因的歐洲油菜植物，其包含3個ind等位基因，其中ind等位基因導致這些突變等位基因的野生型等同體編碼的功能性IND蛋白質類型的量顯著降低，以及由此使得植物細胞中(具體而言，在發育中的種子莢果中)體內生產的功能性IND蛋白質的量總體上顯著降低。還認為，通過在一株植物(特別是蕓苔屬植物)中將足夠拷貝的特定(突變)ind 等位基因與足夠拷貝的特定(野生型)IND等位基因組合，有可能精細調節制造的功能性 IND蛋白質的量和/或類型，其進而影響植物的果實開裂性質。因此可以以此類方式調節 IND蛋白質的絕對和相對量，以提供產生足夠的IND蛋白質從而能實現種子莢果的農藝相關可脫粒性同時降低收獲前或收獲期間的落籽的植物。因此，在本發明的一種實施方式中，提供了下述植物(特別是蕓苔屬植物)，其包含至少一個功能表達的IND等位基因，該等位基因編碼完全功能性的IND蛋白質，同時其余等位基因可以是(突變)ind等位基因。在本發明的一個方面，提供了包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物，特別是歐洲油菜植物，其包含該蕓苔屬植物中的至少2個不同IND基因(特別是IND-Al和IND-Cl基因)的η-重數(n-tuple)ind等位基因，其中，η彡3(例如η = 1、2或3)，從而至少一個等位基因產生功能性的IND蛋白質。在本發明的另一方面，提供了蕓苔屬的物種的純合IND單突變(η = 2，S卩，對于一個IND基因的突變等位基因來說是純合的)和/或純合IND雙突變(η = 4，S卩，對于兩個 IND基因的突變等位基因來說是純合的)植物(特別是歐洲油菜)，其包含至少兩個IND基因，其中，在該蕓苔屬植物中，所述突變等位基因是2個不同IND基因(特別是IND-Al和/ 或IND-Cl基因)的突變等位基因。根據本發明，此類突變植物可用于育種目的。因此，在本發明的一種實施方式中，在本文中提供了純合IND單突變歐洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述為 ind-al/ind-al，IND-Cl/IND-Cl 或 IND-Al/IND-Al，ind-cl/ind-cl。在本發明的另一實施方式中，在本文中提供了純合IND雙突變歐洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述為 ind-al/ind-al，ind-cl/ind-cl 在本發明的另一方面，包含至少兩個IND基因的蕓苔屬的物種(特別是歐洲油菜) 的純合IND單(η = 2)突變植物包含其它突變IND等位基因，其中，所述突變植物對于另外的突變IND等位基因來說是雜合的(即η = 3)，并且其中，突變等位基因是在該蕓苔屬植物中剩下的野生型IND基因(特別是IND-Al或IND-Cl基因)的突變等位基因。因此，在本發明的另一實施方式中，此處提供了包含一個其它突變IND等位基因的純合IND單突變歐洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述為ind-al/ind-al，IND-Cl/ind-cl或IND-Al/ ind-al, ind-cl/ind-cl。
本發明還提供了來自蕓苔屬的物種的野生型和突變IND基因/等位基因的核酸序列以及野生型和突變IND蛋白質。本發明還提供了在蕓苔屬植物中產生和組合突變和野生型IND等位基因的方法，以及在其基因組中包含野生型和突變IND等位基因的特定組合的蕓苔屬植物和植物部分，其中這些植物中落籽被降低。這些植物用于將突變IND等位基因轉移到其它植物中的用途也是本發明的一種實施方式，描述的任何植物的植物產品也是。此外，還提供了用于標記輔助選擇(MAS)以組合或檢測IND基因和/或等位基因的試劑盒和方法。下文中將詳細描述本發明的每種實施方式。本文所述的展示出降低或延遲的落籽的蕓苔屬植物具有增加的收獲的種子產量。但是，出人意料地觀察到，來自僅包含兩個純合狀態的突變IND等位基因的蕓苔屬植物 (即，其中，植物的基因型可被描述為ind-al/ind-al，IND-C1/IND-C1或IND-A1/IND-A1， ind-cl/ind-cl)的收獲的種子產量較之不包含突變IND等位基因的等基因蕓苔屬植物也顯著增加，盡管在包含突變IND等位基因的蕓苔屬植物中沒有可觀察到的降低或延遲的落籽表型。本發明由此還提供了包含至少兩個IND基因的下述蕓苔屬植物，其中，至少兩個等位基因產生功能性IND蛋白質，所述植物具有更高的種子產量。清楚地，在IND-A基因座或 IND-C基因座上的兩個突變等位基因可以是相同的突變等位基因或不同的突變等位基因根據本發明的核酸序列本發明提供了來自十字花科(特別是來自蕓苔屬的物種，尤其是來自歐洲油菜，也可來自蕓苔屬作物物種)的IND基因的野生型IND核酸序列(編碼功能性IND蛋白質) 和突變ind核酸序列(包含一處或多處突變，優選地，導致編碼的IND蛋白質的生物活性顯著降低或沒有的突變，或者導致不產生IND蛋白質的突變)。例如，包含A和/或C基因組的蕓苔屬的物種可包含IND-A或IND-C基因的不同等位基因，在根據本發明的單株植物中可鑒定和組合它們。此外，可使用誘變方法來在野生型IND等位基因中產生突變，由此產生根據本發明使用的突變ind等位基因。因為優選通過雜交和選擇在植物中組合特定的IND等位基因，因此在一種實施方式中，在植物(例如蕓苔屬植物，優選是可與歐洲油菜雜交或可用于制造“合成”歐洲油菜植物的蕓苔屬植物)中提供IND和/或ind核酸序列(S卩，內源地)。不同蕓苔屬物種之間的雜交被描述于本領域中，例如參見Snowdon(2007，Chromosome research 15:85-95)。物種間雜交可例如用于將基因從例如歐洲油菜(AACC)中的C基因組轉移到埃塞俄比亞芥(BBCC)中的C基因組，或者甚至從例如歐洲油菜(AACC)中的C基因組轉移到芥菜(AABB)中的B基因組(通過其C和B基因組之間的非常規重組的散發事件進行)。可通過將原始祖先甘藍(CC)和蕪青(AA)雜交來生產“再合成”或“合成”的歐洲油菜品系。在蕓苔屬作物物種及其親屬物種之間的雜交中，物種間以及屬間不相容障礙可被成功克服，例如通過胚胎拯救技術或原聲質體融合(見例如上文的Snowdon)。但是，本發明中還提供了經分離的IND和ind核酸序列(例如通過克隆從植物分離或通過DNA合成來合成制造)及其變體以及它們任何的片段，它們可用于確定植物或植物部分中內源存在哪些序列，所述序列是否編碼功能性、非功能性的蛋白質或不編碼蛋白質(例如通過按照下文所述在重組宿主細胞中表達)以及用于選擇特定等位基因和將其從一種植物轉移到另一種，以產生具有想要的功能性和突變等位基因組合的植物。已經從歐洲油菜分離出了 IND-Al和IND-Cl的核酸序列，如序列表中所示。描述了野生型IND序列，同時下文和實施例中還參照野生型IND序列描述了這些序列以及與其實質上相似的序列的突變ind序列。來自歐洲油菜的編碼IND蛋白質的基因組DNA不包含任何內含子。根據本發明的“IND-Al核酸序列”或“IND-Al變體核酸序列”是編碼與SEQ ID NO 2具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，98%，99%或100%序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或是與SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :5具有至少80%，至少85%，至少90 %，至少95 %，96 %，97 %，98 %，99 %或100 %序列同一性的核酸序列。這些核酸序列還可被稱為與序列表中提供的IND序列“實質相似”或“實質相同”。根據本發明的“IND-Cl核酸序列”或“IND-Cl變體核酸序列”是編碼與SEQ ID NO 4(IND-C1-長)或SEQ ID NO 4的第16位氨基酸至第210位氨基酸(IND-C1-短)具有至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，98 %，99 %或100 %序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或是與SEQ ID NO :3(IND-C1-長)或SEQ ID NO :3的第46位核苷酸至第633位核苷酸(IND-C1-短)或與SEQ ID NO 7具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%，99%或100%序列同一性的核酸序列。這些核酸序列還可被稱為與序列表中提供的IND序列“實質相似”或“實質相同”。
因此編碼野生型功能性IND-Al和IND-Cl蛋白質的核酸序列都被提供于本發明中，這包括其變體和片段(如下文所定義的)以及上述任何的突變核酸序列，其中，核酸序列中的突變優選導致較之野生型IND蛋白質而言一個或多個氨基酸被插入、缺失或取代。優選地，核酸序列中的一個或多個突變導致一處或多處氨基酸改變(即，相對于野生型氨基酸序列而言，一個或多個氨基酸被插入、缺失和/或取代)，由此IND蛋白質的生物活性顯著降低或完全消失。IND蛋白質的生物活性顯著降低或完全消失在本文中表示IND蛋白質的DNA結合活性、二聚化能力和/或轉錄調控活性降低或消失，使得表達突變IND蛋白質的植物的莢果掉果抗性較之表達相應野生型IND蛋白質的植物而言有所增加。為測定植物(特別是蕓苔屬植物)中特定IND等位基因/蛋白質的功能性，可通過對包含特定IND等位基因/蛋白質的植物和相應野生型植物的果實和花進行宏觀、顯微和組織學測定(與Liljegren等人(2004，見上文)所述對擬南芥屬的果實和花進行的測定類似，或按照下文實施例中所述)，來測定植物中莢果掉果抗性的水平。簡言之，可例如通過宏觀測試，例如肉眼檢查種子莢果評估例如裂另邊緣是否存在、莢果喙長度等等；人工沖擊測試(MIT)以比較不同突變IND品系和相應野生型品系之間的莢果掉果抗性水平(通過評估輕柔扭動莢果時莢果開口的容易程度)；隨機沖擊測試(RIT)以比較分別來自不同突變 IND品系和相應野生型品系的植物的種子莢果的可脫粒性(通過測量這些品系的莢果樣品的半壽期)；和/或通過顯微測試以檢查例如種子莢果的開裂區和裂另邊緣的細胞是否以及如何受到IND中突變的影響，來評估和/或測量莢果掉果抗性的變化。或者，一旦IND蛋白質的二聚化伴侶(例如，當其功能依賴同源二聚體的形成時，是IND蛋白質自身，或者，當其功能依賴異源二聚體的形成時是另外的蛋白質)和/或其轉錄受到IND蛋白質調控的基因被鑒定和分析出來，可通過本領域已知的重組DNA技術，來評估特定IND等位基因/蛋白質的功能性，例如通過在宿主細胞(例如細菌，例如大腸桿菌)中共表達二聚體的兩個伴侶并評估是否仍可形成二聚體、二聚體是否仍可與被調控基因的bHLH結合位點結合和/或這些基因的轉錄是否仍被這種結合調控來進行。本文提供了內源和經分離的核酸序列。還提供了 IND序列的片段和IND變體核酸序列(如上文定義的)，它們用作為引物或探針以及用作為根據本發明的另一方面(見下文)的試劑盒的組分。IND或ind核酸序列或其變體(如所定義的)的“片段”長度可以變化，例如，IND或ind序列(或變體序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600個
連續核苷酸。
編碼功能性IND蛋白質的核酸序列序列表中示出的核酸序列編碼來自歐洲油菜的野生型功能性IND蛋白質。因此，這些序列是從其中分離出它們的歐洲油菜植物內源的。可對其它蕓苔屬作物物種、品種、育種品系或野生登記種加以篩選，來篩選其它IND等位基因，其編碼相同的IND蛋白質或其變體。例如，可使用核酸雜交技術(例如Southern印跡分析，其中使用例如嚴格雜交條件) 或基于PCR的技術，來鑒定其它蕓苔屬植物(例如多種歐洲油菜品種、品系或登記種)內源的IND等位基因，以及，可針對其它野生型IND等位基因，來篩選芥菜(尤其是A-基因組上的IND等位基因)、埃塞俄比亞芥(尤其是C-基因組上的IND等位基因)和蕪青(A-基因組)和甘藍(C-基因組)植物、器官和組織。為針對IND等位基因的存在篩選此類植物、植物器官或組織，可使用序列表中提供的IND核酸序列或任何這些的變體或片段。例如，完全序列或片段可用作為探針或引物。例如，可使用特異性的或簡并引物，從植物、植物器官或組織的基因組DNA中擴增編碼IND蛋白質的核酸序列。可使用標準分子生物學技術，對這些IND核酸序列加以分離和測序。然后可使用生物信息學分析來分析等位基因，例如，以確定哪些IND等位基因對應該序列以及哪些IND蛋白質或蛋白質變體是該序列編碼的。可通過本領域已知的重組DNA技術來分析核酸序列是否編碼功能性IND蛋白質，例如通過遺傳學互補測試，其中使用例如對于完全敲除型ind突變等位基因來說是純合的擬南芥屬植物，或者對于IND-Al和IND-Cl基因二者的完全敲除型ind突變等位基因來說是純合的歐洲油菜植物。此外，應當理解，可通過計算機方式，通過針對實質上相似的序列篩選核酸數據庫，來鑒定IND核酸序列及其變體(或它們中任何的片段)。類似地，可化學合成核酸序列。還提供了根據本發明的核酸分子的片段，下文中將對其進行進一步描述。片段包括僅編碼 bHLH結構域或者包含bHLH結構域的部分的更小的片段(例如堿性結構域或者HLH結構域等等)的核酸序列。編碼突變IND蛋白質的核酸序列相對于野生型核酸序列，包含一個或多個核苷酸缺失、插入或取代的核酸序列是發明的另一個實施方案，同樣地此類突變核酸分子的片段也是。如下文進一步描述的，可以利用多種已知的方法產生和/或鑒別此類突變核酸序列(稱為ind序列)。此外，以內源性形式和以分離的形式提供了此類核酸分子。在一個實施方案中，突變導致所編碼的IND蛋白質的氨基酸序列中的一個或多個改變(缺失、插入和/或取代)(即，不是“沉默突變”)。在另一個實施方案中，核酸序列中的突變導致相對于野生型蛋白質，所編碼的IND蛋白質的生物學活性顯著降低或完全消失。因此，核酸分子可以包含一個或多個突變，例如(a) “錯義突變”，所述突變是核酸序列中的改變，其導致氨基酸取代另一個氨基酸；(b) “無義突變”或“STOP密碼子突變”，所述突變是核酸序列中的改變，其導致引入過早的STOP密碼子，從而終止翻譯(導致截短的蛋白質)；植物基因包含翻譯終止密碼子“TGA” (RNA中的UGA) ,"TAA" (RNA中的UAA)禾P“TAG” (RNA中的UAG)；因此，在待翻譯的成熟mRNA中(在閱讀框中)導致上述密碼子之一的任何核苷酸取代、插入、缺失將終止翻譯。(c) 一個或多個氨基酸的“插入突變”，原因是在核酸的編碼序列中添加一個或多個密碼子；
(d) 一個或多個氨基酸的“缺失突變”，原因是在核酸的編碼序列中缺失一個或多個密碼子；(e) “移碼突變”，導致在突變下游以不同的框翻譯核酸序列。移碼突變可以具有各種原因，例如一個或多個核苷酸的插入、缺失或重復。如已經提到的，核酸序列中的突變優選導致下述突變蛋白質是想要的，所述蛋白質包含顯著降低的或者沒有體內生物活性，或者想要導致不生產蛋白質。基本上，導致產生相對于野生型蛋白質而言包含至少一處氨基酸插入、缺失和/或取代的蛋白質的任何突變可導致顯著降低的生物活性或沒有生物活性。但是，應當理解，蛋白質某些部分中的突變更易于導致突變的IND蛋白質功能降低，例如導致截短的蛋白質的突變，由此缺乏功能性結構域(例如DNA結合結構域(“b”)、二聚化結構域(“HLH”)和/或轉錄調控結構域)的顯著部分。IH ig The Arabidopsis Information Resource (TAIR) ■ ig _ (http//www. arabidopsis. org/)，擬南芥屬 INDEHISCENT 蛋白質(基因座 At4g00120. 1 ；SEQ ID NO 10) 長度為198個氨基酸，其包含位于SEQID NO 10的第121至168位氨基酸之間(pfam結構域 PF00010)、第124至173位氨基酸之間(smart結構域SM00353)或第112和168位氨基酸之間(prosite結構域PS50888)的“堿性螺旋-環-螺旋(bHLH) 二聚化”結構域和第114至 196或198位的氨基酸之間的“螺旋-環-螺旋(HLH) DNA結合”結構域(分別是superfam 結構域 G3D. 4. 10. 280. 10 或 SSF47459)。本文描述的蕓苔屬的IND-Al蛋白質長度為大約185個氨基酸(SEQID NO 2), IND-Cl蛋白質大約195個氨基酸(SEQ ID NO 4的第16至210位)或210個氨基酸(SEQ ID NO :4)，它們包含位于SEQ ID NO 2的第120至167位和SEQ ID NO 4的第133至180 位氨基酸之間(pfam結構域PF00010)、位于SEQ ID NO :2的第123至172位和SEQ ID NO 4 的第136至185位氨基酸之間(smart結構域SM00353)或位于SEQ IDNO 2的第111至167 位和SEQ ID NO 4的第124至180位氨基酸之間(prosite結構域PS50888)的“堿性bHLH 二聚化”結構域和SEQ ID NO 4的第127至208或210位的氨基酸之間(分別為superfam 結構域G3D. 4. 10. 280. 10或SSF47459)的“HLH DNA結合”結構域，這是通過對蕓苔屬和擬南芥屬的IND蛋白質進行最優比對測定的并且基于TAIR數據庫中的注釋信息。如Heim 等人(2003，Mol Biol Evol 20，735-747)所述，133 種擬南芥屬 bHLH 轉錄因子基因的共有bHLH結構域序列由大約56個氨基酸構成(Heim等人，圖1 ；對應于SEQ ID NO 10的119-174位)。該二分結構域包含⑴堿性區域，位于結構域的N-末端，其參與 DNA結合，由具有高數量堿性殘基的大約13個氨基酸構成(“b” ；對應于SEQ ID NO 10的 119-131位)；和(2)螺旋-環-螺旋區域，位于C-末端，其作為二聚化結構域發揮功能，其由大約43個主要疏水的氨基酸殘基構成(對應于SEQ IDNO 10的第132-174位)，它們形成分別為大約15個氨基酸(“HI”;對應于SEQ ID NO 10的第132-146位)和大約22個氨基酸(“H2”;對應于SEQ ID NO 10的第153-174位)的兩個兩性α-螺旋，它們之間由大約6個至可多達大約14個氨基酸的環區域(“L”;對應于SEQ ID NO 10的第147-152位) 分開，該環區域是bHLH結構域中大小和氨基酸組成上最具分歧性的區域。兩個α-螺旋促進二聚化，允許在不同家族成員之間形成同源二聚體和/或異源二聚體(Toledo-Ortiz等人，2003，Plant Cell 15:1749-1770)。雖然 bHLH 結構域進化上保守(Atchley 和 Fitch， 1997，PNAS94 :5172_5176)，但是不同bHLH家族成員間在該結構域外僅有很少的序列相似性(Morgenstern 禾口 Atchley，1999，Mol Biol Evol 16:1654—1663)。
在證明具有結合DNA的能力的這些bHLH蛋白質中，Heim等人(見上文)鑒定的共有bHLH結構域序列的第5、9和13位處的氨基酸是最關鍵的。對于非植物bHLH蛋白質而言，顯示，第5位的His(H)殘基、第9位的Glu(E)殘基和第13位的Arg(R)殘基(全部都在堿性區域內)對于DNA結合來說是關鍵的(Brownlie等人，1997，Structure 5，509-520 ； Atchley 等人，1999，J Mol Evol 48，501-516 ;Ledent 禾口 Vervoort，2001，Genome Res 11， 754-770)。但是，一些植物蛋白質具有H-E-R構型變化。例如，根據Heim等人(見上文)，擬南芥屬基因At4g00120 (對應于SEQ ID NO 9代表的擬南芥屬IND基因)編碼的bHLH結構域的5-9-13基序分別由氨基酸殘基Gln(Q) ,Ala(A)和Arg(R)(分別對應于SEQ ID NO 10的第123、127和131位)構成(Heim等人(見上文)的圖4)。具有H-E-R構型的變異的此類植物蛋白質可還在堿性區域含有破壞螺旋的脯氨酸，例如，VIII和X組的成員，特征在于可干擾對DNA的親和性。這些變異使得這些蛋白質可作為負面調控子(保留了與其他 bHLH蛋白質二聚化的能力但是缺乏結合DNA的能力)發揮作用。雖然5_9_13基序對DNA 結合來說是重要的，但是DNA主鏈與第10和12位上的堿性殘基(在共有bHLH結構域序列中都是Arg(R))接觸，它們在大多數植物蛋白質中也是保守的(對應于SEQ ID N0:10的第 128 和 130 位)。此外，Heim等人(見上文)描述了螺旋1的第16、20、23、27位(對應于SEQ ID NO 10 的第 134、138、141、145 位)和螺旋 2 的第 36、39、43、49、53 和 56 位(對應于 SEQ ID NO=IO的第154、157、161、167、171、174位)的高度保守的疏水殘基，例如，螺旋1結構域中第23位的亮氨酸殘基(對應于SEQ ID NO 10的第141位)和螺旋2中位于螺旋一側的保守疏水殘基，對于二聚體形成的二聚化或穩定來說是必要的。最后，Heim等人(見上文；圖4)顯示了 DNA結合結構域之外的保守氨基酸序列，其中一些被認為作為活化結構域發揮作用，或者對于與轉錄復合體的其它組件的相互作用來說是重要的，或者是信號轉導鏈的靶。表IIND蛋白質-氨基酸(AA)區域和位置AtINDlAtINDlBnIND-AlBnIND-C la/b
(SEQ ID(SEQ ID (SEQ ID(SEQ ID 4/8
NO: 10)NO: 9)NO: 2/6)從 16-210 /
SEQ ID 4/8)
TAIR: 1-1981-5941-18516-210/ 1-210
區域 (198 AA)(185 AA)(195 / 210
AA)
PFOOOl O --180
SM00353 --185
PS50888 --180
G3D.4.10.280.10 -588-127-208
SSF47459 -594-127-210
Lilieeren 等人 30-19888-594
(169 AA)
bHLH: Heim 等人 --186
Toledo-Ortiz 等人 --179
Lilieeren 等人 --179
"b Heim 等人 --145
Toledo-Ortiz 等人 --145
Liljegren 等人 --145
"Η Heim 等人 --158Toledo-Ortiz 等人--158
Liljegr en 等人--157
THeim 等人147-152~ -151159-164
Toledo-Ortiz 等人--164
Liljegren 等人--164
~H2 Heim 等人--186
Toledo-Ortiz 等人--179
Liljegren 等人--179
保守 N(1')115343-345Π4127 M
V(2T)
Q(5h)
A(9h- 13t)
R(10h- 14t)
R(12h- 16t)
R (13H)
I(16h- 20t)
S (21T)
I(20h- 24t)138.
L (23H- 27T)
K (28丁)
V(27H) K (39T) T (42T) A (36H) M (45丁) L (39H -46T) A (49T)160478-480 159172 I (43H- 50T)
V(52T) T (53T)164490-492〗63176 L (49H -56T)
V(53H)
L (56H)174580-582 173(A)186 ______At ind I/W-J(W13>ST0P)l I 42124-12625[41
ind-2 (A26>FS)1 55163-165 --
ind-6w在61 后在 185后 --
插入插入
ind-4 (Q63>STOP)L 92274-276 91104
ind-3 (R99>H)L128382-384 127140
ind-1 (L112>F)l141421-423 140153Heim 等人，H :Heim 等人，2003，Mol Biol Evol 20，735-747 ;Toledo_0rtiz 等人， T :Toledo-Ortiz 等人，2003，Plant Cell 15 1749-1770 ；Liljegren 等人，L =Liljegren 等人，2004，Cell, 116,843-853 ;w :ffu 等人，2006，Planta 224，971-979.類似地，如Toledo-Ortiz 等人(2003，Plant Cell 15 :1749-1770 ；圖 1)所述，擬南芥屬bHLH轉錄因子家族的bHLH結構域由大約56個氨基酸構成(Toledo-Ortiz等人；對應于SEQ ID NO 10的第115-167位)。該雙分結構域包含(1)堿性區域，位于結構域的 N-末端，其參與DNA結合，由具有高數量堿性殘基的大約17個氨基酸構成(“b” ；對應于 SEQ IDN0:10的115-131位)；和(2) HLH區域，位于C-末端，其作為二聚化結構域發揮功能，其由大約39個主要疏水的氨基酸殘基構成(對應于SEQID NO 10的第132-167位)，它們形成大約15個氨基酸的兩個兩性α -螺旋(“Η1”，對應于SEQ ID NO 10的第132-146 位；和“Η2”，對應于SEQID NO 10的第152-167位)，它們之間由大約9個氨基酸的環區域 ("V'；對應于SEQ ID NO 10的第147-151位)分開，該環區域是bHLH結構域中大小和氨基酸組成上最具分歧性的區域基于序列保守的模式，Atchley等人(1999)產生了假定的共有基序，其代表bHLH 區域中最保守的氨基酸，包括分散在bHLH結構域的19個氨基酸(18個來自b、Hl和H2 ;1 個來自L)。鑒定的保守氨基酸對應于Toledo-Ortiz等人(2003，見上文)鑒定的擬南芥屬 bHLH 結構域的第 l、2、13、14、16(b 中)；20、21、24、27、28 (Hl 中)；39(L 中)；42、45、46、49、 50、52、53 和 56 (H2 中)位的氨基酸，其對應于 SEQID NO 10 的第 115、116、127、128、130 (b 中);134、135、138、141、142(!11中)；150(L 中)；153、156、157、160、161、163、164 和 167 (H2 中)位的氨基酸。根據Liljegren 等人(2004，Cell，116，843-853)，擬南芥屬 IND 基因的 bHLH 結構域包含13個氨基酸的堿性區域(SEQ ID NO: 10中第119至131位的氨基酸)和分別14和 15個氨基酸的兩個α -螺旋(分別是SEQ ID NO 10中第132-145位的氨基酸和第153至 167位的氨基酸)，它們之間由7個氨基酸的可變環區域(SEQ ID NO 10中第146至152位的氨基酸)分開。擬南芥屬IND核酸(SEQ ID NO 9)和氨基酸(SEQ ID NO 10)序列與本發明的IND 核酸序列，特別是蕓苔屬IND核酸(SEQ ID NO 1和3)和氨基酸(SEQ ID NO 2和4)序列的最佳比對，允許確定這些蕓苔屬序列中相應的保守結構域和氨基酸(關于SEQ ID NO 1 至4的蕓苔屬IND序列，見表1)的位置。因此，在一種實施方式中，提供了包含一種或多種任何類型的上文所述突變的核酸序列。在另一實施方式中，提供了包含一個或多個終止密碼子(無義)突變、一個或多個錯義突變和/或一個或多個移碼突變的ind序列。提供了上述任何突變核酸序列本身(經分離的形式)以及內源包含此類序列的植物和植物部分。在下文的表中，描述了最優選的 ind等位基因，如所示的，包含一個或多個ind等位基因的歐洲油菜種子的種子保藏物已被保藏。在本文中使用時，IND等位基因中的無義突變是IND等位基因中的下述突變，由所述突變向相應野生型IND等位基因的編碼DNA和相應mRNA序列中引入一個或多個翻譯終止密碼子。翻譯終止密碼子是TGA (mRNA中是UGA)、TAA (UAA)和TAG (UAG)。因此，導致在編碼序列中產生框內終止密碼子的任何突變(缺失、插入或取代)將導致翻譯終止以及氨基酸鏈的截短。在一種實施方式中，包含無義突變的突變IND等位基因是這樣的IND等位基因，其中，通過單核苷酸取代，例如CAG至TAG、TGG至TAG、TGG至TGA或CAA至TAA的突變，在IND密碼子序列中引入框內終止密碼子。在另一實施方式中，包含無義突變的突變IND等位基因是這樣的IND等位基因，其中，通過雙核苷酸取代，例如CAG至TAA、TGG至TAA或CGG 至TAG或TGA的突變，在IND密碼子序列中引入框內終止密碼子。在還一種實施方式中，包含無義突變的突變IND等位基因是這樣的IND等位基因，其中，通過三核苷酸取代，例如CGG 至TAA的突變，在IND密碼子序列中引入框內終止密碼子。截短的蛋白質缺乏突變下游的編碼DNA編碼的氨基酸(即IND蛋白質的C-末端部分)，但保持了突變上游的編碼DNA編碼的氨基酸(即，IND蛋白質的N-末端部分)。在一種實施方式中，含無義突變的突變IND 等位基因是這樣的IND等位基因，其中，無義突變在H2結構域的保守Leu殘基(在Heim等人，2003 (見上文)所述共有bHLH結構域序列的第56位)之前的任何地方存在，使得至少缺乏保守的Leu殘基。較之野生型IND蛋白質而言突變IND蛋白質越截短，截短越可能導致顯著降低的IND蛋白質活性或者沒有活性。因此，在另一實施方式中，提供了包含導致少于大約170個氨基酸(缺乏保守Leu)、少于大約150個氨基酸(缺乏H2結構域)、少于大約145個氨基酸(缺乏L和H2結構域)、少于大約130個氨基酸(缺乏HLH結構域)、少于大約115個氨基酸(缺乏bHLH結構域)或者甚至氨基酸長度更短(例如對應于擬南芥屬 ind-4或ind-5 (Liljegren等人，2004，見上文)等位基因的突變IND等位基因)的截短蛋白質的無義突變的突變IND等位基因(見表1)。本文下表描述了本文提供的歐洲油菜IND序列中一系列可能的無義突變。表2a IND-Al (SEQ ID NO 1)中可能的STOP密碼子突變
39
權利要求
包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物或其細胞、部分、種子或后代，其特征在于其在其基因組中包含三個突變IND等位基因。
2.根據權利要求1的植物，其中所述IND基因是IND-Al或IND-Cl基因。
3.根據權利要求1或2的植物，其中所述IND基因包含選自下述的核酸分子(a)核酸分子，其包含與SEQID NO =USEQ ID NO 3的第46位核苷酸至第633位核苷酸、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 的至少 90% 的序列同一性；(b)核酸分子，其編碼下述氨基酸序列，所述氨基酸序列包含與SEQIDN0:2、SEQ ID NO 4的第16位氨基酸至第21位氨基酸或SEQ ID NO 4的至少90%的序列同一性。
4.根據前述任意一項權利要求所述的植物，其中所述突變IND等位基因是完全敲除型 IND等位基因。
5.根據前述任意一項權利要求所述的植物，其中所述突變IND等位基因選自 ind-al-EMS01、ind-al_EMS05、ind-c1-EMS01和 ind-cl_EMS03。
6.根據前述任意一項權利要求所述的植物，其對于一個突變IND等位基因來說是純合的，對另一個來說是雜合的。
7.根據前述任意一項權利要求所述的植物，其產生的功能性IND蛋白質的量較之由不包含突變IND等位基因的相應植物產生的功能性IND蛋白質的量顯著降低。
8.根據前述任意一項權利要求所述的植物，其中，所述植物的落籽較之不包含突變 IND等位基因的相應植物的落籽顯著降低或延遲。
9.根據權利要求8的植物，其保持莢果的農藝相關可脫粒性。
10.據前述任意一項權利要求所述的植物，其是來自蕓苔屬作物物種的植物，優選來自歐洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncea)、埃塞俄比亞芥(Brassica carinata)(Brassica rapa) gJc1=t"M (Brassica oleracea)。
11.據前述任意一項權利要求所述的植物，其是來自蕓苔屬油菜物種的植物，優選來自歐洲油菜，芥菜或蕪青。
12.在其基因組中包含IND-Al或IND-Cl基因的至少一個突變等位基因的植物或其細胞、部分、種子或后代，其中，所述IND-Al或IND-Cl基因包含選自下述的核酸分子(a)核酸分子，其包含與SEQID NO =USEQ ID NO 3的第46位核苷酸至第633位核苷酸、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 的至少 90% 的序列同一性；(b)核酸分子，其編碼下述氨基酸序列，所述氨基酸序列包含與SEQIDN0:2、SEQ ID NO 4的第16位氨基酸至第21位氨基酸或SEQ ID NO 4的至少90%的序列同一性。
13.根據權利要求12所述的植物，其中所述突變IND等位基因是完全敲除型IND等位基因。
14.根據權利要求12或13所述的植物，其中所述突變IND等位基因選自 ind-al-EMS01、ind-al_EMS05、ind-c 1-EMS01 和 ind-cl_EMS03。
15.根據權利要求12-14中任意一項所述的植物，其中所述突變IND等位基因源于蕓苔屬的物種的植物。
16.根據權利要求12-15中任意一項所述的植物，其是來自蕓苔屬的物種的植物。
17.能夠從根據權利要求1-16中任意一項所述的植物獲得的種子莢果。
18.IND-Al或IND-Cl基因的突變等位基因，其中，所述IND-Al或IND-Cl基因包含選自2下述的核酸分子(a)核酸分子，其包含與SEQID NO =USEQ ID NO 3的第46位核苷酸至第633位核苷酸、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 的至少 90% 的序列同一性；(b)核酸分子，其編碼下述氨基酸序列，所述氨基酸序列包含與SEQIDN0:2、SEQ ID NO 4的第16位氨基酸至第21位氨基酸或SEQ ID NO 4的至少90%的序列同一性。
19.根據權利要求18的突變等位基因，其是完全敲除型IND等位基因。
20.根據權利要求18或19的突變等位基因，其選自ind-al-EMS01、ind-al_EMS05、 ind-c1-EMS01 和 ind-cl_EMS03。
21.根據權利要求18-20中任意一項所述的突變等位基因，其源于蕓苔屬的物種的植物，優選源于蕓苔屬作物物種或蕓苔屬油菜物種。
22.根據權利要求18-21中任意一項所述的突變等位基因編碼的突變IND蛋白質。
23.在生物樣品中鑒定根據權利要求18-21中任意一項所述的突變IND等位基因的方法，所述方法包括測定生物樣品中存在的核酸中突變IND特異性區域的存在。
24.根據權利要求23的方法，其還包括使用至少兩個引物的組，對所述生物樣品進行聚合酶鏈式反應測定，所述組選自-引物組，其中，分別地，所述引物之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’側翼區域，所述引物之另一特異性識別所述突變IND等位基因的3’側翼區域，-引物組，其中，所述引物之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域，所述引物之另一特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，-引物組，其中，分別地，所述引物之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域，所述引物之另一特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域。
25.根據權利要求24的方法，其中_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物分別由選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者_特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述引物由選自所述突變IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物由選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，其中，所述17 至200個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或所述側翼序列。
26.根據權利要求24的方法，其中-特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物在其最3’末端包含分別選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者_特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述引物在其最3’末端包含選自所述突變IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物在其最3’末端包含選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述位于3’的17個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
27.根據權利要求24-26中任意一項所述的方法，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:5的第1至924 位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO 5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO :5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第 1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至644 位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至899 位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
28.根據權利要求24-27中任意一項所述的方法，其中所述引物組選自下述-引物組，其包含含有SEQ ID NO 13的序列的一條引物和/或含有SEQ ID NO :15的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 16的序列的一條引物和/或含有SEQ ID NO :18的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 19的序列的一條引物和/或含有SEQ ID NO 21的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 22的序列的一條引物和/或含有SEQ ID NO 24的序列的一條引物。
29.根據權利要求23所述的方法，其還包括使用特異性探針組對所述生物樣品進行雜交測定，所述特異性探針組包含至少一條特異性探針，所述組選自下述-特異性探針組，其中，所述探針之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’側翼區域，所述探針之另一特異性識別所述突變IND等位基因的3’側翼區域，-特異性探針組，其中，所述探針之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域，所述探針之另一特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，-特異性探針組，其中，分別地，所述探針之一特異性識別所述突變IND等位基因的5’ 或3’側翼區域，所述探針之另一特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和3’或5’ 側翼區域之間的連接區域，-特異性探針，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域。
30.根據權利要求29所述的方法，其中_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針由分別選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述探針由選自所述突變IND等位基因的突變序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少 80 %序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針由分別選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少 80%序列同一性的序列構成，其中所述13至1000個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或所述側翼序列。
31.根據權利要求29所述的方法，其中_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針分別包含選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述探針包含選自所述突變IND等位基因的突變序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者_特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針分別包含選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，其中所述至少13 個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
32.根據權利要求29-31中任意一項所述的方法，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:5的第1至924 位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO 5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第 1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至644 位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至899 位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
33.根據權利要求29-32中任意一項所述的方法，其中所述探針組選自下述-探針組，其包含含有SEQ ID NO 25的序列的一條探針和/或含有SEQ ID NO 26的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO :28的序列的一條探針和/或含有SEQ ID NO :29的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 31的序列的一條探針和/或含有SEQ ID NO 32的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO :34的序列的一條探針和/或含有SEQ ID NO :35的序列的一條探針。
34.在植物或其細胞、部分、種子或后代中測定根據權利要求18-21中任意一項所述的突變IND等位基因的接合狀態的方法，所述方法包括在所述植物或其細胞、部分、種子或后代的基因組DNA中測定突變和/或相應野生型IND特定區域的存在。
35.根據權利要求34的方法，其還包括使用至少兩條或至少三條引物的組對所述植物或其細胞、部分、種子或后代的基因組DNA進行聚合酶鏈式反應測定，其中所述引物中的至少兩條特異性識別所述野生型IND等位基因，所述至少兩條引物選自-分別地，第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的3’或5’側翼區域，-第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二引物，其特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域，-分別地，第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二引物，其特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域，以及其中，所述引物中的至少兩條特異性識別突變IND等位基因，所述至少兩條引物選自 -分別地，第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的3’或5’側翼區域，-第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第三引物，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，-分別地，第一引物，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第三引物，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域。
36.根據權利要求35的方法，其中-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物分別由選自所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17至200 個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述引物分別由選自所述突變或野生型IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物分別由選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或 3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，其中，所述17至200個連續核苷酸不僅僅源于所述突變區域或所述側翼序列。
37.根據權利要求35的方法，其中-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物在其最 3’末端分別包含選自所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述引物在其最3’末端分別包含選自所述突變或野生型IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物在其最3’末端分別包含選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述位于3’的17個連續核苷酸不僅僅源于所述突變位點或區域或源于所述側翼序列。
38.根據權利要求35-37中任意一項所述的方法，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO :5的第1至924位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 5的第1至923位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第925至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有SEQ IDNO 5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列a或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO :5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者 SEQ ID NO 5的第1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第868至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第1至939位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者，-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至644位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至643位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第645至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至899位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至898位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第900至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
39.根據權利要求35-38中任意一項所述的方法，其中，所述至少三個引物的組選自下述-引物組，其包含含有SEQ ID NO 13的序列的一條引物，含有SEQID NO 14的序列的一條引物，和/或含有SEQ ID NO :15的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO :16的序列的一條引物，含有SEQID NO 17的序列的一條引物，和/或含有SEQ ID NO :18的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO :19的序列的一條引物，含有SEQID NO 20的序列的一條引物，和/或含有SEQ ID NO 21的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO :22的序列的一條引物，含有SEQID NO :23的序列的一條引物，和/或含有SEQ ID NO :24的序列的一條引物。
40.根據權利要求34的方法，其還包括使用至少兩條特異性探針的組對所述植物或其細胞、部分、種子或后代的基因組DNA進行雜交測定，其中所述特異性探針中的至少一條特異性識別所述野生型IND等位基因，所述至少一條探針選自-分別地，第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的3’和5’側翼區域，-第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二探針，其特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域，-分別地，第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二探針，其特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域，-探針，其特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域，以及其中所述特異性探針中的至少一條特異性識別所述突變IND等位基因，所述至少一條探針選自-分別地，第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第二探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的3’或5’側翼區域，-第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第三探針，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，-第一探針，其特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域，以及第三探針，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域，-探針，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域。
41.根據權利要求40的方法，其中-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針由分別選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的13至1000 個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述探針由分別選自所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針由分別選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或 3’側翼區域之間的連接區域的序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，其中，所述13至1000個連續核苷酸不僅僅源于所述突變位點或區域或源于所述側翼序列。
42.根據權利要求40的方法，其中-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針分別包含選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的至少13 個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述探針包含選自所述突變或野生型IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針分別包含選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’ 或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述至少13個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
43.根據權利要求40-42中任意一項所述的方法，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO :5的第1至924位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 5的第1至923位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第925至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有SEQ IDNO 5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列a或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO :5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者 SEQ ID NO 5的第1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第868至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第1至939位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者，-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至644位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至643位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第645至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至899位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至898位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第900至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
44.根據權利要求40-43中任意一項所述的方法，其中所述至少三條特異性探針的組選自下述-探針組，其包含含有SEQ ID NO 25的序列的一條探針，含有SEQID NO 26的序列的一條探針，和/或含有SEQ ID NO ,21的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 28的序列的一條探針，含有SEQID NO 29的序列的一條探針，和/或含有SEQ ID NO 30的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 31的序列的一條探針，含有SEQID NO 32的序列的一條探針，和/或含有SEQ ID NO 33的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 34的序列的一條探針，含有SEQID NO 35的序列的一條探針，和/或含有SEQ ID NO 36的序列的一條探針。
45.在生物樣品中鑒定根據權利要求18-21中任意一項所述的突變IND等位基因的試劑盒，所述試劑盒包含引物或探針的組，所述組選自-引物或探針組，其中，所述引物或探針中的一條特異性識別所述突變IND等位基因的 5’側翼區域，并且所述引物或探針中的另一條特異性識別所述突變IND等位基因的3’側翼區域，-引物或探針組，其中，所述引物或探針中的一條特異性識別所述突變IND等位基因的 5’或3’側翼區域，并且所述引物或探針中的另一條特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，-引物或探針組，其中，分別地，所述引物中的一條特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域，并且所述引物或探針中的另一條特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域，-探針，其特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域。
46.根據權利要求45的試劑盒，其中_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物分別由選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者_特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述引物由選自所述突變IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物由選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，其中，所述17 至200個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列，_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針由分別選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述探針由選自所述突變IND等位基因的突變序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少 80 %序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針由分別選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少 80%序列同一性的序列構成，其中所述13至1000個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
47.根據權利要求45的試劑盒，其中-特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物在其最3’末端包含分別選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者_特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述引物在其最3’末端包含選自所述突變IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物在其最3’末端包含選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述位于3’的17個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列，_特異性識別所述突變IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針分別包含選自所述突變IND等位基因的5’或3’側翼序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域的所述探針包含選自所述突變IND等位基因的突變序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針分別包含選自跨越所述突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列或其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，其中所述至少13 個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
48.根據權利要求45至47中任意一項所述的試劑盒，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:5的第1至924 位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO 5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第 1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至644 位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變區域具有SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述連接區域分別包含SEQ ID N0:7的第1至899 位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
49.根據權利要求45至48中任意一項所述的試劑盒，其中至少兩條引物的所述組和/ 或至少兩條特異性探針的所述組選自下述-引物組，其包含含有SEQ ID NO 13的序列的一條引物和序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 16的序列的一條引物和序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 19的序列的一條引物和序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 22的序列的一條引物和序列的一條引物，-探針組，其包含含有SEQ ID NO :25的序列的一條探針和序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO :28的序列的一條探針和序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO :31的序列的一條探針和序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 34的序列的一條探針和序列的一條探針。
50.在植物或其細胞、部分、種子或后代中測定根據權利要求18-21中任意一項所述的突變IND等位基因的接合狀態的試劑盒，所述試劑盒包含引物或探針的組，其中所述引物中的至少兩條或所述探針中的至少一條特異性識別野生型IND等位基因，并且其中，所述引物中的至少兩條或所述探針中的至少一條特異性識別突變IND等位基因，所述引物或探針的組選自下述-至少兩條引物或探針的組，其中第一引物或探針特異性識別所述突變和野生型IND 等位基因的5’側翼區域，以及第二引物或探針特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的3’側翼區域，-至少三條引物或探針的組，其中第一引物或探針特異性識別所述突變和野生型IND 等位基因的5’或3’側翼區域，第二引物或探針特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域，第三引物或探針特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域，-至少三條引物或探針的組，其中第一引物或探針特異性識別所述突變和野生型IND 等位基因的5’或3’側翼區域，第二引物或探針分別特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域，并且第三引物或探針分別特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域和3’或5’側翼區域之間的連接區域，-至少兩條探針的組，其中第一探針特異性識別所述突變IND等位基因的突變區域和 5’或3’側翼區域之間的連接區域，以及第二探針特異性識別所述野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域。
51.根據權利要求50的試劑盒，其中/或含有SEQIDNO 15的/或含有SEQIDNO 18的/或含有SEQIDNO 21的/或含有SEQIDNO 24的/或含有SEQIDNO 26的/或含有SEQIDNO 29的/或含有SEQIDNO 32的/或含有SEQIDNO 35的-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物分別由選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17至200 個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述引物分別由選自所述突變或野生型IND等位基因的突變區域序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，或者-特異性識別所述野生型或突變IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物分別由選自跨越所述野生型或突變IND等位基因的突變區域和5’或 3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列構成，其中，所述17至200個連續核苷酸不僅僅源于所述突變區域或所述側翼序列，或者-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針由分別選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的13至1000 個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述探針由選自所述突變或野生型IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針由分別選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或 3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的13至1000個連續核苷酸的核苷酸序列，或與其具有至少80%序列同一性的序列構成，其中，所述13至1000個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
52.根據權利要求50的試劑盒，其中-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述引物在其最 3’末端分別包含選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述引物在其最3’末端分別包含選自所述突變或野生型IND等位基因的突變區域序列或選自其互補序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述引物在其最3’末端分別包含選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的序列的17個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述位于3’的17個連續核苷酸不僅僅源于所述突變區域或源于所述側翼序列，或者-特異性識別所述突變和野生型IND等位基因的5’或3’側翼區域的所述探針分別包含選自所述突變或野生型IND等位基因的5’或3’側翼序列或選自其互補序列的至少13 個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域的所述探針包含選自所述突變或野生型IND等位基因的突變序列或選自其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，或者-特異性識別所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’或3’側翼區域之間的連接區域的所述探針分別包含選自跨越所述突變或野生型IND等位基因的突變區域和5’ 或3’側翼區域之間的連接區域的序列或選自其互補序列的至少13個連續核苷酸的核苷酸序列，其中，所述至少13個連續核苷酸不僅僅源于所述突變或側翼序列。
53.根據權利要求50-52中任意一項所述的試劑盒，其中-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至923位核苷酸或第925至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ IDNO 5的第924位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO :5的第1至924位核苷酸或第924至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 5的第1至923位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第925至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸或第868至 1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者分別包含SEQ ID NO :5的第1至939位核苷酸或第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有SEQ IDNO :5的第867位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第940位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列a或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至867位核苷酸或第867至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者 SEQ ID NO 5的第1至940位核苷酸或第940至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ ID NO 5的第1至866位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第868至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 5的第1至939位核苷酸接著是a或a接著是核苷酸序列SEQ ID NO 5的第941至1622位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者，-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至643位核苷酸或第645至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第644位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至644位核苷酸或第644至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至643位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第645至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列，或者-所述5，或3，側翼區域分別包含SEQ ID NO 7的第1至898位核苷酸或第900至 1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述野生型IND等位基因的所述突變區域具有 SEQ ID NO :7的第899位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；所述突變IND等位基因的所述突變區域具有序列t或其互補序列；所述野生型IND等位基因的所述連接區域分別包含 SEQ IDNO 7的第1至899位核苷酸或第899至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列；以及所述突變IND等位基因的所述連接區域分別包含SEQ IDNO 7的第1至898位核苷酸接著是t或t接著是核苷酸序列SEQ ID NO 7的第900至1593位核苷酸或其互補序列的核苷酸序列。
54.根據權利要求50-53中任意一項所述的試劑盒，其中，至少三條引物或探針的所述組選自下述-引物組，其包含含有SEQ ID NO 13的序列的一條引物，含有SEQID 一條引物，和/或含有SEQ ID NO :15的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 16的序列的一條引物，含有SEQID 一條引物，和/或含有SEQ ID NO :18的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 19的序列的一條引物，含有SEQID 一條引物，和/或含有SEQ ID NO 21的序列的一條引物，-引物組，其包含含有SEQ ID NO 22的序列的一條引物，含有SEQID 一條引物，和/或含有SEQ ID NO :24的序列的一條引物，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 25的序列的一條探針，含有SEQID 一條探針，和/或含有SEQ ID NO ,21的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 28的序列的一條探針，含有SEQID 一條探針，和/或含有SEQ ID NO 30的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 31的序列的一條探針，含有SEQID 一條探針，和/或含有SEQ ID NO 33的序列的一條探針，-探針組，其包含含有SEQ ID NO 34的序列的一條探針，含有SEQID 一條探針，和/或含有SEQ ID NO 36的序列的一條探針。
55.在一株植物中組合至少兩個選擇的根據權利要求18-21中任意一項所述的突變 IND等位基因的方法，所述方法包括下述步驟(a)根據權利要求23-33中任意一項所述，鑒定至少兩株植物，它們每株包含至少一個選擇的突變IND等位基因，(b)將至少兩株植物雜交，并從至少一次雜交收集Fl雜交種子，(c)任選地，根據權利要求23-33中任意一項所述，鑒定出包含至少兩個選擇的突變 IND等位基因的Fl植物。
56.根據權利要求55的方法，其還包括下述步驟通過根據權利要求34-44中任意一項所述，測定所述選擇的突變IND等位基因的接合狀態，鑒定對于選擇的突變IND等位基因來說是純合或雜合的Fl植物。
57.將至少一個選擇的突變IND等位基因從一株植物轉移到另一植物的方法，所述方法包括下述步驟(a)根據權利要求23-33中任意一項所述，鑒定包含至少一個選擇的突變IND等位基因的第一植物，或者根據權利要求55所述，產生包含至少兩個選擇的突變IND等位基因的第一植物，(b)將所述第一植物與不包含所述至少一個選擇的突變IND等位基因的第二植物雜交，從所述雜交收集Fl雜交種子，(c)任選地，根據權利要求23-33中任意一項所述，鑒定包含所述至少一個選擇的突變 IND等位基因的Fl植物，NO 14的序列的 NO 17的序列的 NO 20的序列的 NO 23的序列的 NO 26的序列的 NO 29的序列的 NO 32的序列的 NO 35的序列的(d)將包含所述至少一個選擇的突變IND等位基因的Fl植物與不包含所述至少一個選擇的突變IND等位基因的第二植物回交至少一代(χ)，從所述雜交收集BCx種子，(e)根據權利要求23-33中任意一項所述，在每一代中鑒定包含所述至少一個選擇的突變IND等位基因的BCx植物。
58.根據權利要求57的方法，其還包括下述步驟通過根據權利要求34至44中任意一項所述，測定所述選擇的突變IND等位基因的接合狀態，鑒定對于選擇的突變IND等位基因來說是純合或雜合的BCx植物。
59.制造根據權利要求1-16中任意一項所述的植物的方法，所述方法包括按照權利要求55至58中任意一項所述，在一株蕓苔屬植物中或向一株蕓苔屬植物中組合和/或轉移根據權利要求18-21中任意一項所述的突變IND等位基因。
60.制造根據權利要求1至11中任意一項所述的雜交蕓苔屬種子或植物的方法，所述方法包括下述步驟(a)按照權利要求34至44中任意一項所述，鑒定包含純合狀態的第一和第二選擇的突變IND等位基因的第一植物，以及包含純合狀態的第三選擇的突變IND等位基因的第二植物，(b)將所述第一和第二植物雜交，從所述雜交收集Fl雜交種子。
61.根據權利要求60的方法，其中所述第一或所述第二選擇的突變IND等位基因是與所述第三選擇的突變IND等位基因相同的突變IND等位基因。
62.根據權利要求60或61的方法，其中所述第一植物被用作為雄性親本植物，所述第二植物被用作為雌性親本植物。
63.包含ind-al-EMS01和ind-cl_EMS01等位基因的蕓苔屬種子，其已經于2007年11 月20日以登錄號PTA-8796保藏于ATCC，以及包含ind-al_EMS05和ind-cl_EMS03等位基因的蕓苔屬種子，其已經于2007年11月20日以登錄號PTA-8795保藏于ATCC，或者來自所述種子的衍生物。
64.從權利要求63的種子獲得的蕓苔屬植物或其細胞、部分、種子或后代。
65.蕓苔屬植物或其細胞、部分、種子或后代，其在其基因組中包含ind-al-EMSOl、 ind-al-EMS05、ind-c 1-EMS01或ind-cl_EMS03等位基因，其是通過用從權利要求63的種子種植的蕓苔屬植物繁殖和/或育種獲得的。
66.包含ind-al-EMS01、ind-al-EMS05、ind-c 1-EMS01 或 ind-cl_EMS03 等位基因的種子，包含所述等位基因的以登錄號PTA-8796和PTA-8795于2007年11月20日保藏于ATCC 的參照種子。
67.從權利要求66 的種子生產的包含 ind-al-EMS01、ind-al-EMS05、ind-c 1-EMS01 或 ind-c 1-EMS03等位基因的植物或其細胞、部分、種子或后代。
68.在兩個基因座包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物或其細胞、部分、種子或后代，其特征在于，其在其基因組中的一個基因座上包含兩個突變IND等位基因。
69.根據權利要求68的植物，其中所述兩個突變IND等位基因是純合的。
70.根據權利要求68的植物，其中所述IND基因是IND-41或IND-Cl基因。(a)核酸分子，其包含與SEQID NO =USEQ ID NO 3的第46位核苷酸至第633位核苷酸、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 的至少 90% 的序列同一性；(b)核酸分子，其編碼下述氨基酸序列，所述氨基酸序列包含與SEQIDN0:2、SEQ ID NO 4的第16位氨基酸至第21位氨基酸或SEQ ID NO 4的至少90%的序列同一性。
71.
72.根據權利要求68至71中任意一項所述的植物，其中所述突變IND等位基因是完全敲除型IND等位基因。
73.根據權利要求68至72中任意一項所述的植物，其中所述突變IND等位基因選自 ind-al-EMS01、ind-al-EMS05、ind-c 1-EMS01 和 ind-cl_EMS03。
74.根據權利要求68至73中任意一項所述的植物，其生產的功能性IND蛋白質的量較之通過不包含突變IND等位基因的相應植物生產的功能性IND蛋白質的量顯著降低。
75.根據權利要求68至74中任意一項所述的植物，其中，所述植物的種子產量較之不包含突變IND等位基因的相應植物的種子產量而言有所增加，優選地，顯著增加。
76.根據權利要求68至75中任意一項所述的植物，其是來自蕓苔屬作物物種的植物，優選地來自歐洲油菜、芥菜、埃塞俄比亞芥、蕪青或甘藍的植物。
77.根據權利要求68至76中任意一項所述的植物，其是來自蕓苔屬油菜物種的植物，優選來自歐洲油菜、芥菜或蕪青的植物。
78.增加包含至少兩個IND基因的蕓苔屬植物產量的方法，所述方法包括在其基因組中引入兩個突變純合IND等位基因。
79.根據權利要求18至21中任意一項所述的突變IND等位基因用于在蕓苔屬植物中增加種子產量的用途。
80.根據權利要求18至21中任意一項所述的突變IND等位基因用于在蕓苔屬植物中增加莢果的掉果抗性的用途。
全文摘要
本發明涉及其果實開裂性質經調節的作物植物。更具體地，本發明涉及改進的方法和手段，用于在植物中降低落籽或者延遲落籽直至收獲之后，同時保持莢果的農藝相關可脫粒性。
文檔編號C12N15/82GK101970667SQ200880125655
公開日2011年2月9日申請日期2008年11月25日優先權日2007年11月28日
發明者B·拉加, B·朗伯特, B·登博爾申請人:拜爾生物科學公司

完整全部詳細(xi)技術資(zi)料下載