尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其通過使用hMeDIP-Chip技術得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因將有助于進一步闡明尿毒癥的發病機理，為尿毒癥的診斷和治療提供新途徑。上述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種尿毒癥差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的尿毒癥的相關信息。
【專利說明】尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及表觀遺傳學研究領域，尤其是涉及一種尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法和應用。
【背景技術】
[0002]慢性腎衰竭是指各種腎臟病導致腎臟功能漸進性不可逆性減退，直至功能喪失所出現的一系列癥狀和代謝紊亂所組成的臨床綜合征，簡稱慢性腎衰。慢性腎衰的終末期即尿毒癥。尿毒癥不是一個獨立的疾病，而是各種晚期的腎臟病共有的臨床綜合征，是慢性腎功能衰竭進入終末階段時出現的一系列臨床表現所組成的綜合征。
[0003]慢性腎臟疾病(CKD)是復雜的疾病，近幾十年來，其發病率逐年增長，調查結果發現中國人群中CKD的發病率為11.8%—13.0%，預測在全國范圍內CKD患者已超過I億。我國的尿毒癥患者在100萬以上,此類患者每年治療總費用將超過500—1000億元，因而解決好腎臟疾病的早期預警和有效防治問題有重要的意義。目前臨床上尚缺乏早期診斷手段和行之有效治療方法，其中部分患者進展至尿毒癥。CKD患者發病較隱匿，疾病的發生往往先是功能和分子的變化，繼而是形態學的改變，很多患者首診時就已經出現腎病綜合征或腎小球腎炎的臨床癥狀。因此，有必要用創新的方法尋找并發現尿毒癥特異性的生物標志物。
[0004]表觀遺傳學是研究DNA序列沒有發生改變的情況下而基因表達和表型卻發生可遺傳改變的學科。這種變化涉及組蛋白修飾，主要包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化。研究表明，表觀遺傳異常與尿毒癥發病相關，表觀遺傳學研究的發病機制密切相關可能為闡明尿毒癥的發病機制和開發新的策略來治療這種疾病的線索。

【發明內容】

[0005]基于此，有必要提供一種尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法和應用。
[0006]一種尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，包括如下步驟:
[0007]分別采集尿毒癥患者和健康人的血液樣本，并從所述血液樣本中提取DNA ；
[0008]將所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羥甲基化的寡核苷酸鏈作為陽性對照；
[0009]將含有所述陽性對照的所述DNA片段加熱變性，再將得到的單鏈DNA樣本分成兩份，其中一份作為實驗組加入抗5’-羥甲基化胞嘧啶核苷抗體得到DNA片段抗體復合物，另一份作為對照組，記為Input，其中，實驗組用免疫磁珠法分離所述DNA片段抗體復合物，共沉淀后非羥甲基化的DNA片段被清洗除去，得到純化的DNA片段抗體復合物，記為hMedIP ；
[0010]對上述實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段進行擴增；
[0011]對擴增后的實驗組DNA片段抗體復合物和對照組DNA片段分別使用Cy5和Cy3染料標記；
[0012] 將染料標記后的實驗組DNA片段抗體復合物與對照組DNA片段混合后與羥甲基化微陣列檢測芯片雜交，使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果，得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
[0013]在其中一個實施例中，在將所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前，所述分析方法還包括對提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析儀測定所述DNA的數量和質量以及用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性的步驟。
[0014]在其中一個實施例中，在對上述實驗組純化的DNA片段和對照組的DNA片段進行擴增之前，所述分析方法還包括對免疫磁珠法分離得到的DNA片段抗體復合物的富集效率進行評估的步驟。
[0015]在其中一個實施例中，所述使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果包括如下步驟:
[0016]使用高解析度芯片掃描儀分別檢測尿毒癥患者組與健康人的芯片雜交信號，獲取Cy3及Cy5的熒光掃描圖像；
[0017]使用Bioconductor packages Ringo、Iimma 及 MEDME 對雜交結果進行數據提取、標準化和峰值分析；
[0018]經過校正得到所述羥甲基化微陣列檢測芯片上每個檢測探針的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值，log2 (hMeDIP/Input)值代表每個探針在實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段中的相對富集強度，p-value表示探針紅綠信號差異是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS檢驗算法計算。
[0019]在其中一個實施例中，所述分析方法還包括在篩選得到所述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因之后針對篩選得到的差異表達基因使用實時熒光定量PCR對hMeDIP-Chip分析結果進行驗證的步驟。
[0020]上述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法通過使用hMeDIP-Chip技術來分析尿毒癥羥甲基化狀態的改變，得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因將有助于進一步闡明尿毒癥的發病機理，為尿毒癥的診斷和治療提供新途徑。上述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種尿毒癥差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的尿毒癥的相關疾病信肩、O
[0021]一種基因檢測芯片，所述基因檢測芯片上固定有上述任一實施例所述的方法得到的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
[0022]在其中一個實施例中，所述差異表達基因為HMGCR、THBD及STAT3中的至少一種。
[0023]通過上述基因檢測芯片，可以為初步診斷尿毒癥提供中間結果信息，檢測過程方便，不需要使用傳統的繁雜的檢測步驟，但由于尿毒癥往往是一種綜合病征，獲取這些中間結果之后還需要結合其他檢測數據才能診斷為是否是尿毒癥疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為hMeDIP-Chip技術在 全基因組范圍內分析尿毒癥患者5_hmC狀態技術路線圖；
[0025]圖2為尿毒癥患者和健康人的總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；
[0026]圖3為尿毒癥組的芯片雜交結果圖；[0027]圖4為健康對照組的芯片雜交結果圖；
[0028]圖5為19號染色體上(Chr 19)存在5_hmC水平差異的位點分析；
[0029]圖 6 為 5-hmC、un5_hmC 基因在 HCP、ICP、LCP 分布；
[0030]圖7為HCP、ICP、LCP的羥甲基化狀態；
[0031]圖8為HCP、ICP、LCP中羥甲基化基因所占總數比例；
[0032]圖9為在啟動子(promoter，下同)區(_800bp的~+200bp)，5_hmC基因在HCP、ICP、LCP分布情況；
[0033]圖10為CpG島上5-hmC、un5_hmC基因的分布情況,其中兩個intergenic表示CpG島上 5_hmC、un5-hmC 基因；
[0034]圖11為啟動子區表達上調基因在各染色體上的分布(順時針從I號染色體X和Y性染色體);
[0035]圖12為CpG島表達上調基因在各染色體上的分布(順時針從I號染色體X和Y性染色體);
[0036]上述圖中，縱坐標Enrichment peaks表示掃描圖像中的富集峰值，黑色表示尿毒癥組的羥甲基化，灰色表示健康對照組的羥甲基化，ALL代表所有DNA片段，Hydroxymethylated表不輕甲基化，Unhydroxymethylated表不輕甲基化表不未甲基化，下同。
【具體實施方式】
[0037]下面主要結合附圖及具體實施例對尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法和應用作進一步詳細的說明。
[0038]一實施方式尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其包括如下步驟:
[0039]步驟SllO:分別采集尿毒癥患者和健康人的血液樣本。
[0040]血液樣本可以直接采集自患者或者健康人，也可以取自醫院或研究機構的血液樣本庫。
[0041]步驟S120:從血液樣本中提取DNA。
[0042]優選的，在本步驟提取DNA之后還包括使用NanoDrop ND-100分析儀測定提取的DNA的數量和質量以及使用瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA的完整性進行評估的步驟。
[0043]步驟S130:將DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羥甲基化的寡核苷酸鏈作為陽性對照。
[0044]在本實施方式中，使用Mse I限制性內切酶將DNA消化成小DNA片段。76mer完全羥甲基化的寡核苷酸鏈可選用市售的通用完全羥甲基化的寡核苷酸鏈。76mer完全羥甲基化的寡核苷酸鏈可選用市售的通用完全羥甲基化的寡核苷酸鏈。
[0045]步驟S140:將含有陽性對照的DNA片段加熱變性，再將得到的單鏈DNA樣本分成兩份，其中一份作為實驗組加入抗5’-羥甲基化胞嘧啶核苷抗體得到DNA片段抗體復合物，另一份作為對照組，記為Input，其中，實驗組用免疫磁珠法分離DNA片段抗體復合物，共沉淀后非羥甲基化的DNA片段被清洗除去，得到純化的DNA片段抗體復合物，記為hMeDIP。
[0046] 因目前在人類基因組中發生羥甲基化的特定基因未明確，發生羥甲基化水平也未知，而將基因片段上芯片與芯片上探針雜交，需要對羥甲基化水平有一定的要求，因此，在本實施方式中，當得到純化的DNA片段抗體復合物之后,該分析方法還包括使用NanoDropND-1000光譜分析儀對該DNA片段抗體復合物的富集效率進行評估的步驟。
[0047]步驟S150:使用Sigma WGA Kit對上述實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段進行擴增。
[0048]步驟S160:對擴增后的實驗組DNA片段抗體復合物和對照組DNA片段分別使用Cy5和Cy3染料標記。
[0049]步驟S170:將染料標記后的實驗組DNA片段抗體復合物與對照組DNA片段混合后與羥甲基化微陣列檢測芯片雜交，使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果，得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
[0050]在本實施方式中，所述使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果包括如下步驟:
[0051]使用高解析度芯片掃描儀分別檢測尿毒癥患者組與健康人的芯片雜交信號，獲取Cy3及Cy5的熒光掃描圖像；
[0052]使用Bioconductor packages Ringo、Iimma 及 MEDME 對雜交結果進行數據提取、標準化和峰值分析；
[0053]經過校正得到羥甲基化微陣列檢測芯片上每個檢測探針的log2 (HMeDIP/Input)值以及p-value值,log2 (HMeDIP/Input)值代表每個探針在實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段中的相對富集強度，p-value表示探針紅綠信號差異是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS檢驗算法計算。
[0054]進一步，在篩選得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因之后，本實施方式的分析方法還包括針對篩選得到的差異表達基因使用實時熒光定量PCR對hMeDIP-Chip分析結果進行驗證的步驟。
[0055]具體在本實施方式中得到3個較大差異表達的基因，分別是三個表達上調的HMGCR、THBD 及 STAT3 基因。
[0056]上述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法通過使用hMeDIP-Chip技術來分析尿毒癥羥甲基化狀態的改變，得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因，深入研究這些差異表達基因將有助于進一步闡明尿毒癥的發病機理，為尿毒癥的診斷和治療提供新途徑。上述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法設計合理可行，能夠有效地協助建立一種尿毒癥差異表達基因的圖譜模型，獲取作為中間結果的尿毒癥的相關疾病信息。[0057]此外，本實施方式還提供了一種基因檢測芯片，在該基因檢測芯片上固定有上述方法得到的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因作為檢測探針。
[0058]一種基因檢測芯片，基因檢測芯片上固定有由上述方法得到的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
[0059]在其中一個實施例中，差異表達基因為HMGCR、THBD及STAT3中的至少一種。
[0060]通過上述基因檢測芯片，可以初步檢測待測患者血液內上述三種差異表達基因的表達情況，為初步診斷尿毒癥提供中間結果信息，檢測過程方便，不需要使用傳統的繁雜的檢測步驟，但由于尿毒癥往往是一種綜合病征，獲取這些中間結果之后還需要結合其他檢測數據才能診斷為是否是尿毒癥疾病。[0061]以下為具體實施例部分:
[0062]1.實驗對象
[0063]本實驗中共有30個樣本，見表1，其中，疾病組15人，健康對照組15人。疾病組患者來源于桂林市第181醫院腎臟科。健康對照組與疾病組年齡、種族、性別相匹配。本研究征得了桂林市第181醫院倫理委員會的同意。
[0064]表1.疾病組和對照組的人口學和臨床特征
[0065]
【權利要求】
1.一種尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，包括如下步驟: 分別采集尿毒癥患者和健康人的血液樣本，并分別從所述血液樣本中提取DNA ； 將所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羥甲基化的寡核苷酸鏈作為陽性對照； 將含有所述陽性對照的所述DNA片段加熱變性，再將得到的單鏈DNA樣本分成兩份，其中一份作為實驗組加入抗5’ -羥甲基化胞嘧啶核苷抗體得到DNA片段抗體復合物，另一份作為對照組，記為Input，其中，實驗組用免疫磁珠法分離所述DNA片段抗體復合物，共沉淀后非羥甲基化的DNA片段被清洗除去，得到純化的DNA片段抗體復合物，記為hMeDIP ； 對上述實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段進行擴增； 對擴增后的實驗組DNA片段抗體復合物和對照組DNA片段分別使用Cy5和Cy3染料標記； 將染料標記后的實驗組DNA片段抗體復合物與對照組DNA片段混合后與羥甲基化微陣列檢測芯片雜交，使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果，得到尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
2.如權利要求1所述的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，在將所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前，所述分析方法還包括對提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析儀測定所述DNA的數量和質量以及用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性的步驟。
3.如權利要求1所述的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，在對上述實驗組純化的DNA片段和對照組的DNA片段進行擴增之前，所述分析方法還包括對免疫磁珠法分離得到的DNA片段抗體復合物的富集效率進行評估的步驟。
4.如權利要求1所述的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，所述使用hMeDIP-Chip技術對比分析尿毒癥患者和健康人的芯片雜交結果包括如下步驟: 使用高解析度芯片掃描儀分別檢測尿毒癥患者組與健康人的芯片雜交信號，獲取Cy3及Cy5的熒光掃描圖像； 使用Bioconductor packages Ringo、Iimma及MEDME對雜交結果進行數據提取、標準化和峰值分析； 經過校正得到所述羥甲基化微陣列檢測芯片上每個檢測探針的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值,log2 (hMeDIP/Input)值代表每個探針在實驗組純化的DNA片段抗體復合物和對照組的DNA片段中的相對富集強度，p-value表示探針紅綠信號差異是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS檢驗算法計算。
5.如權利要求1所述的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因的分析方法，其特征在于，所述分析方法還包括在篩選得到所述尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因之后針對篩選得到的差異表達基因使用實時熒光定量PCR對hMeDIP-Chip分析結果進行驗證的步驟。
6.一種基因檢測芯片，其特征在于，所述基因檢測芯片上固定有如權利要求1~5中任一項所述的方法得到的尿毒癥羥甲基化狀態的差異表達基因。
7.如權利要求6所述的基因檢測芯片，其特征在于，所述差異表達基因為HMGCR、THBD及ST AT3中的至少一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911438SQ201410093631
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】眭維國, 戴勇, 譚秋培, 薛雯 申請人:眭維國, 戴勇