專利名稱：一種快速檢測志賀菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種環介導等溫DNA擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)在檢測志賀菌中的用途。
背景技術：
志賀菌屬"/u'geZ/aspp.)是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌， 通稱痢疾桿菌。志賀菌病常為食物爆發型或經水傳播，志賀菌在擁擠和不衛生條件下能迅速 傳播，經常發現于人員大量集中的地方如餐廳和食堂等。食源性志賀菌流行的最主要原因是 從事食品加工行業人員患菌痢或帶菌者污染食品，接觸食品人員個人衛生差，已污染的食品 存放在不適當的溫度下等。
目前鑒定志賀菌主要有細菌學檢査和免疫學方法。前者作為我國國標檢測志賀菌的方法，
雖然結果可靠，但是操作煩瑣、耗時，已經不能滿足大量樣品的檢測需要，而后者雖然可以
快速檢測，但容易出現假陽性且重復性較差。
新興的分子生物學的方法，包括聚合酶鏈式反應(PCR)、依耐核酸序列的擴增(NASBA)，
自主序列復制(3SR)以及鏈置換技術(SDA)等。這些方法都能擴增靶核酸到相似的數量
級，都有較高的檢出限，但是它們仍然有一些缺陷不能克服。它們有的需要精密的儀器來擴
增，有的因為對靶序列的選擇特異性不高而需要精細的方法來檢測擴增產物。盡管操作簡單，
但需要高精度的熱循環儀使得PCR這一有力的技術沒有被廣泛的應用。另一方面，不使用熱
循環儀的NASBA和3SR，在特異性上又大打折扣，主要是由于必須用一個相對較低的溫度
40。C來進行擴增。SDA利用四種引物在等溫條件下擴增很大程度上克服了這些缺陷，但是仍
然存在薄落的環節，必須利用昂貴的修飾核苷酸作為底物來進行擴增反應。
綜合以上原因，研究一種快速、準確、簡便的方法來檢測志賀菌是非常必要的。
本發明選用志賀菌高度保守的!;pfl/Z基因，設計了 6條能在60'C-65'C的溫度條件下擴增 志賀菌DNA序列的特異性引物。所有的志賀菌均攜帶一個侵襲性非結合型大質粒，該質粒 編碼多種侵襲性相關外膜蛋白。Venkatesan等發現侵襲性質粒抗原H (invasive plasmid，
同時多拷貝存在于染色體和侵襲性大質粒上，不因傳代而丟失。因此選擇編碼侵襲性質粒抗
原H (^fli/)的基因作為靶基因。
該擴增反應依賴于一組針對靶基因的引物包括一組內引物FIP和BIP，以及一組外引
物F3和B3和一組環引物LB和LF，利用具有鏈置換活性的fi對DNA聚合酶的大片段，在
64'C左右的條件下即可完成對靶基因的特異性擴增。由于其針對*^//基因的6個區段，所以特異性高；且其反應溫度恒定，不需要PCR儀，僅需一個水浴'鍋即可完j^;另外，在反應過 程中，從dNTPs中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子結合，能產生一種焦磷酸鎂的 沉淀物，出現渾濁沉淀，因此用肉眼就判定擴增結果，無需進行凝膠電泳。
實驗證明，通過該法檢測食品中污染的志賀菌，其特異性良好，操作簡單，無需昂貴儀 器和試劑，且靈敏度比常規PCR高。
主要參考文獻 Notomi T， Okayama H， Masubuchi H.， ef fl/.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA.
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發明內容
(一) 要解決的技術問題
本發明的目的是提供一種簡單方便的快速檢測志賀菌的方法。
(二) 技術方案
為達到上述目的，本發明采用的技術方案是 1.樣品DNA的提取
樣品按照GB4789.5-2003處理，經增菌培養后，取培養物lmL于12 000r/min離心5min; 沉淀用0.8mLlxTE (100mmol/L Tris-Cl， 10mmol/L EDTA， pH8.0)洗滌，12 000r/min離心 5min，沉淀加入10QaL無菌水，混勻后，于100°C沸水浴15min，立即冰浴5min， 12 000r/min 離心5min，上清液即為提取的DNA模板。 2. LAMP反應體系 反應體系中分別加入以下物質10xLAMP bufffer 2.5//L; 10mmol/L Mg2+ 4.0〃L ~6.0〃L; lOmmol/LdNTP 1.5〃L 2.5/fL; lOmmol/Lbetaine 1.5wL 2.5^L; 0.5〃mol/L的FIP和BIP各2/fL; 0.25^mol/L的F3和B3各 0.5/^L;樣品中提取的DNA模板5.QaL; DNA聚合酶8U/^mL超純水補至25/^L。
3.反應條件
63。C 65。C水浴鍋溫浴60min， 80。C加熱2min。 (三)有益效果
本發明以志賀菌^fl/f基因為靶基因，設計了一組用于擴增該基因部分序列的特異性引物， 研究了反應體系和反應條件，能檢出lfg/反應的DNA，克服了目前所用細菌培養法繁瑣費時 和免疫檢測法易出現假陽性及一些分子生物學方法需要特殊儀器和試劑等缺點。
具體實施例方式
1. 引物的設計
外引物F3 (forward outer primer): 5'-GCCnTCCGATACCGTCTCT;外引物B3 (forward outer primer): 5'陽TGATGGACCAGGAGGGTT; 內引物FIP (backward inner primer): 5'國TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGAITC;內引物BIP (backward inner primer): 5'-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGrrCCGGAGAITGTrC -CATGTGA;環引物 LB為5'-TGCAGCGACCTGTTCACG;環引物LF為5'-CTGCTGATG-CCACTGAGAGC。
2. 樣品的處理
樣品按照GB/T4789.4-2003處理，經增菌培養后，取培養物lmL于12 OOOr/min離心5min; 沉淀用0.8mLlxTE (100mmol/L Tris-Cl， 1Ommol/L EDTA， pH8.0)洗滌，12 OOOr/min離心 5min，沉淀加入IOQmL無菌水，混勻后，'于IOO'C沸水浴15min,立即冰浴5min， 12 OOOr/min 離心5min，上清液即為提取的DNA模板。
3. LAMP反應體系
在反應體系中分別加入以下物質
IOxLAMP bufffer 2.5;ML; 10mmol/LMg2+ 4.0~6.QaL; 10mmol/LdNTP 1,5^L 2.5^L ; 10mmol/L betaine 1.5#L —2.5^L; 0.5#mol/L的FIP和BIP各2^L; 0.25^mol/L的F3和B3各 0.5^L; 0.5/miol/L的LF和LB各l^L;超純水2.5#L;樣品中提取的DNA模板5.0#L; DNA 聚合酶8U///L，補水至25^L。
4. 反應條件
63。C 65。C水浴鍋溫浴60min， 80'C加熱2min。
5. 檢測結果
直接觀察反應混合液中是否出現白色沉淀。如果出現白色沉淀，則為陽性結果，如果未出現上述現象，則為陰性結果。
另一種檢測結果的方法取反應后的混合液2pL，加入0.5wL溴酚藍上樣緩沖液，在2% 的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時間30min，置于紫外檢測系統檢測電泳條帶。如果出現 梯度條帶，則為陽性結果，如未出現，則結果為陰性。
權利要求
1.一種檢測志賀菌的環介導等溫DNA擴增檢測方法，包括設計志賀菌ipaH基因特異性引物，其特征在于，志賀菌引物序列為ipaH-F35′-GCCTTTCCGATACCGTCTCT；ipaH-B35′-TGATGGACCAGGAGGGTT；ipaH-FIP5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGATTC；ipaH-BIP5′-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATFGTTCCATGTGA；ipaH-LB5′-TGCAGCGACCTGTTCACG；ipaH-LB5′-CTGCTGATGCCACTGAGAGC。
2. 根據權利要求1所述的志賀菌的環介導等溫DNA擴增檢測方法，其特征在于，包括樣品DNA的提取細菌培養物lmL于12 000r/min離心5min;沉淀用0.8mLlxTE (10Ommol/LTris-Cl， 1Ommol/LEDTA， pH8.0)洗滌，12 OOOr/min離心5min,沉淀加入100^L無菌水，混勻后，于100°C沸水浴15min，立即冰浴5min， 12 OOOr/min離心5min，上清液即為DNA模板。
3. 根據權利要求2所述的志賀菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，擴增反應體系包括10xLAMPbufffer2.5^L， 10mmol/L Mg2+4.0~6.QaL， 10mmol/LdNTP 1.5~2.5#L， 10mmol/Lbetaine 1.5-2.5^L， 0.5^mol/L的！;pa/f-FIP和*fl//-BIP各2^L， 0.25〃mol/L的*ai/-F3和*fli/-B3各0.5〃L， l^mol/L環引物^a/f-LB和*fl//-LB各0.5//L,樣品中提取的DNA模板2.0~5.0pL， DNA聚合酶8U/〃L 1^L。
4. 根據權利要求3所述的志賀菌的環介導等溫DNA擴增檢測方法，其特征在于，擴增反應條件為63。C 65。C水浴鍋溫浴60min， 8(TC加熱2min 10min終止反應。
5. 根據權利要求4所述的志賀菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，擴增結果的檢測可以直接觀察反應混合液中是否出現白色沉淀。如果出現白色沉淀(渾濁)，則為陽性結果，如果未出現上述現象，則為陰性結果。
6. 根據權利要求5所述的志賀菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，另一種檢測結果的方法是取反應后的混合液2^L，加入0.5wL溴酚藍上樣緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時間30min，在0.5^g/mL溴化乙錠溶液中浸泡20min，置于凝膠成像系統照相，如果出現梯度條帶，則為陽性結果，如未出現，則結果為陰性。
全文摘要
本發明屬于食源性致病菌的快速檢測技術，具體說是一種檢測志賀菌DNA的環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法。包括由樣品處理試劑、LAMP反應試劑、Bst DNA聚合酶的大片段、瓊脂糖、溴酚藍上樣緩沖溶液、溴化乙錠溶液組成的試劑的配制，以及擴增產物的檢測和沉淀產生的檢測程序。其步驟是首先設計特異性引物；其次是提取樣品DNA；第三是反應體系的配制。該法較之目前采用的傳統細菌培養方法、免疫檢測方法和其它分子生物學方法具有操作簡單、快速、無需特殊儀器試劑且靈敏特異的優點。可應用于食品和其它樣品中志賀菌的快速檢測。
文檔編號C12Q1/10GK101603070SQ20081004799
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月12日 優先權日2008年6月12日
發明者朱勝梅, 陳福生 申請人:陳福生;朱勝梅