專利名稱：一種用于細菌診斷的核苷酸序列及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及TaqMan探針在細菌檢測中的應用，特別是在類志賀鄰單胞菌鑒別診斷中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。
背景技術：
類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)呈世界性分布。淡水水源和江河水生態環境是類志賀鄰單胞菌的主要儲存地，魚類是類志賀鄰單胞菌常見的宿主。過去認為該菌對人的致病性不強，是魚類等水生動物重要的致病菌。最近幾年由該菌引起的嬰幼兒、老年人以及免疫功能不全病人的胃腸道感染病例逐漸增加，是人類腸炎的主要病因，世界各地屢有報道。類志賀鄰單胞菌亦可引起人類菌血癥、蜂窩組織炎、腦膜炎等腸外感染， 該菌亦與旅行者腹瀉密切相關。類志賀鄰單胞菌是一種革蘭氏陰性、能運動、兼性厭氧、氧化酶陽性的非孢子繁殖的細菌，1947年首次從腹瀉病人糞便中分離出來。類志賀鄰單胞菌是鄰單胞菌屬中唯一的一個種，其分類歸屬地位復雜。該菌曾與對人類致病的弧菌屬和氣單胞菌屬一起歸屬于弧菌科，后研究發現其在分子水平跟類志賀鄰單胞菌和變形桿菌屬更為接近，在2005年第二版《系統細菌學伯杰氏手冊》中，類志賀鄰單胞菌才被確立為腸桿菌科，鄰單胞菌屬。作為腸桿菌科病原菌，國內外已有過多起關于該菌引起的感染性腹瀉和食物中毒的報道，可認為是一種新的引起人類腹瀉的重要腸道病原菌。來自日本的一項研究發現在 1994至1996年間所有引起旅行者腹瀉的腸桿菌中，類志賀鄰單胞菌位居第一(66. 7% )。在日常感染性腹瀉病原菌監測過程中，對類志賀鄰單胞菌的檢測較少，在糞便樣本的常規培養中往往將其忽略，并且該菌缺少特異的篩選培養基，在一些腸道培養基上形成的菌落性狀與嗜水氣單胞相似，難以區別，這也影響了類志賀鄰單胞菌的分離率。類志賀鄰單胞菌的傳統檢測方法需要進行選擇性增菌、多種培養基篩選鑒定，整套操作步驟繁多， 耗時至少6-7天，且檢測結果容易受到操作人員經驗豐富與否的影響。通過序列比對我們發現類志賀鄰單胞菌的23S rRNA基因的5'端區域的核酸序列變異度高，可以將類志賀鄰單胞菌與其他密切相近的菌屬例如變形桿菌屬、弧菌屬以及氣單胞菌屬區分開來。最近，一些學者采用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法對該區域的基因組DNA進行擴增檢測，雖然這種方法可以節省大量的時間并使整個操作變得簡單，但是這種方法在實際應用中存在不可避免的弊端。例如靈敏度低，容易對含菌量低的標本發生漏檢；還有特異性差，有學者發現含有stx2基因的大腸桿菌在用該方法進行擴增時也會產生一個大小類似的擴增條帶，影響了類志賀鄰單胞菌的鑒定。因此在本技術領域需要建立一種針對類志賀鄰單胞菌的高特異性，特別是能夠鑒別診斷腸出血性大腸桿菌的檢測方法。最近幾年，實時熒光TaqMan PCR技術(real time TaqMan PCR, TaciMan是羅氏公司(Roche Molecular System, Inc.)的注冊商標)廣泛的應用于病原體微生物的檢測，普通PCR方法只能將產物從大小上進行區分，實時熒光TaqMan PCR技術在普通PCR的基礎上又加入一條特異的熒光探針，并且該技術對引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實時熒光TaqMan PCR中的探針序列必須與目標序列完全匹配，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；但在 PCR擴增時，隨著引物的延伸Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan PCR技術的應用中，探針的選擇是一個重要因素， 因為其涉及到與引物的匹配，以及最關鍵的檢測特異性的問題。在本發明中，我們針對類志賀鄰單胞菌的23S rRNA基因的5'端上下游引物之間的保守序列設計了一條TaqMan探針， 旨在建立一種針對該病原菌的靈敏、特異、快速的核酸檢測體系。

發明內容
本發明的目的在于提供一種應用能夠應用于細菌檢測，特別是熒光TaqMan PCR技術的檢測探針序列，更進一步提供熒光TaqMan PCR技術檢測類志賀鄰單胞菌方法，以及用于該方法的試劑盒。基于以上目的，發明人對NCBI上所有的類志賀鄰單胞菌核酸序列進行比對，發現該致病菌23S rRNA基因(X65487. 1，Plesiomonas shigelloides)的5'端區域核酸序列特異性好，可以將類志賀鄰單胞菌與其他密切相近的菌屬例如變形桿菌屬、弧菌屬以及氣單胞菌屬區分開來。發明人在該區域使用引物探針設計軟件Primer Express〗.O (ABI)設計引物探針，并將獲得的特異性引物和探針在NCBI數據庫中進行比對分析，以排除引物-探針與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優化后的引物_探針序列。本發明首先提供了一種用于細菌檢測的探針序列，所述序列含有如SEQ ID NO 3 所示的序列。序列選自于X65487. 1中的第1111到1132位核苷酸.優選地，所述序列為SEQ ID NO 3所示。其次，本發明提供了一種熒光TaqMan PCR檢測方法，所述方法包括(1)被檢測物種的基因組DNA的抽提；(2)以步驟⑴獲得的DNA為模板進行TaqMan PCR擴增，其中上游引物為SEQ ID NO 1所示的序列，下游引物為SEQ ID NO 2所示的序列，探針序列為SEQ ID NO 3 ；(3)對擴增結果進行檢測分析。上述SEQ ID NO :1 選自于 X65487. 1 中的第 1165 到 1189 位核苷酸，SEQ ID NO 2 選自于X65487. 1中的第906到930位核苷酸。優選地，步驟(2)的PCR反應條件為優選地，所述步驟(2)和(3)在ABI 7500Fast實時熒光定量PCR儀中進行。在上述方法中，所述物種優選為細菌。更為優選地，所述細菌選自下述細菌腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸聚集性大腸桿菌
95 0C 30s 95 0C5s
60 °C 34s
4(EaggEC)、尿路致病性大腸桿菌(UPEC)、福氏志賀菌、宋內志賀菌、甲型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質沙雷菌、 副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、牛鏈球菌、 糞腸球菌、小腸結腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、單增李斯特菌、空腸彎曲菌。更為優選地，所述細菌為類志賀鄰單胞菌。更為優選地，所述細菌為腸出血性大腸桿菌。最后，本發明還提供了一種用于細菌檢測的TaqMan PCR試劑盒，所述試劑盒包括(1)熱啟動Taq DNA聚合酶；(2)實時熒光定量PCR緩沖液；(3)序列為SEQ ID NO 1的上游引物為和序列為SEQ ID NO 2的下游引物；(4)序列為 SEQ ID NO 3 的探針。本發明建立的實時熒光TaqMan PCR方法是首次將熒光探針運用到了類志賀鄰單胞菌的檢測，與普通PCR相比，實時熒光TaqMan PCR方法主要有三個優點1、實時熒光 TaqMan PCR檢測方法比普通PCR方法的靈敏度高，能檢測出10拷貝/ μ 1的質粒標準品和含菌量為1.2X103CFU/ml的糞便模擬標本，靈敏度提高了 100倍。2、實時熒光TaqMan PCR 方法對樣本檢測所需時間短，整個反應在2h內完成。3、實時熒光TaqManPCR方法的特異性更好，TaqMan探針的使用避免了非特異性擴增，在對腸出血性大腸桿菌進行檢測時未產生特異性擴增曲線。


圖1為普通PCR檢測靈敏度的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為實時熒光TaqMan PCR對質粒標準品的擴增曲線圖；圖3為普通PCR對類志賀鄰單胞菌基因組DNA檢測靈敏度的電泳圖；圖4為實時熒光TaqMan PCR對類志賀鄰單胞菌基因組的擴增圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例類志賀鄰單胞菌實時熒光TaqMan PCR檢測體系(一 )本發明中涉及的實時熒光TaqMan PCR引物及探針序列上游引物為SEQ ID NO :1所示，下游引物為SEQ ID NO 2所示，探針序列為SEQ ID NO 3所示。
( 二)本發明中實時熒光TaqMan PCR檢測使用和涉及的主要試劑1、熱啟動 DNA 聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS 及 Buffer (Premix Ex Taq Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司。2、無 DNA 酶和 RNA 酶超純水(UltraPure Dnase/RNase-Free Distilled Water), 購自美國Invitrogen公司。3、細菌基因組 DNA 抽提試劑盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)購自Promega公司。4、PCR 產物膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)，購自德國 Qiagen 公司。5、PCR產物克隆試劑盒(pMD 20-T Vector)，購自寶生物工程(大連)有限公司。6、DL2000DNA Marker和EasyDilution均購自寶生物工程(大連)有限公司。其余試劑均為市售分析純產品(三)本發明實驗中使用和涉及的主要儀器。PCR 儀為 Sensoquest Labcycler,德國 Sensoquest 產品；離心機為 Eppendorf5415D，德國 Eppendorf 產品；電泳設備為北京君意東方電泳設備有限公司產品；凝膠成像系統為Bio-Rad Gel Doc XR，美國Bio-Rad產品；ABI 7500Fsat實時熒光定量PCR儀為美國應用生物系統公司產品。(四)本發明中的主要實驗步驟1、引物和探針的合成利用GenBank的Blast工具對類志賀鄰單胞菌的基因序列進行分析，選擇23S rRNA基因上的一段特定區域作為檢測靶標，針對這段序列設計引物和探針。引物和探針均由上海基康生物公司合成。2、細菌基因組DNA的抽提細菌基因組DNA 的抽提使用 TaKaRa 公司的"Wizard Genomic DNAPurification 試劑盒，按照說明書進行操作。利用紫外分光光度計測定細菌基因組DNA的純度和濃度， 類志賀鄰單胞菌基因組DNA用EasyDilution緩沖液稀釋至3X IO5 3X lC^pg/y L的濃度梯度，陰性對照用EasyDilution緩沖液稀釋至3 X 104pg/ μ L，各種基因組DNA均少量分裝，-20°C保存備用。3、質粒標準品的構建與制備①以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2為引物，擴增目的基因284bp ；②切膠回收，純化PCR產物；③連接到T載體；④轉化JM109感受態細胞；⑤篩選陽性克隆子，用PCR進行驗證，最終測序確認；⑥提取質粒，根據質粒的分子量將質粒樣品濃度換算為拷貝數濃度每 μ L樣品中檢測基因的拷貝數=濃度(ng/yL)X阿佛加德羅常數X 10_9/(660 X重組質粒堿基數)；⑦用EasyDilution將上述質粒依次稀釋成1. O X 10°拷貝/ μ L 1. O X IO9拷貝 /yL，共10個濃度梯度。4、普通PCR反應體系的建立普通PCR反應體系如下
ExTaq DNA 聚合酶0.5 u 1 ( 5U/u 1)
IOxBuffer ( Mg2+ plus )5u1
dNTPs (IOmM)2 u1
上游引物(10(iM)2u1
下游引物(I(HiM)2ul
Template DNA1 ul
dH2037.5 u 1
總反應體積50u1PCR反應條件
權利要求
1.一種用于細菌檢測的探針序列，所述序列含有如SEQ ID NO :3所示的序列。
2.根據權利要求1所述的探針序列，所述序列為SEQID NO 3所示。
3.一種熒光TaqMan PCR檢測方法，所述方法包括(1)被檢測物種的基因組DNA的抽提；(2)以步驟(1)獲得的DNA為模板進行TaqManPCR擴增，其中上游引物為SEQ ID NO=I 所示的序列，下游引物為SEQ ID NO 2所示的序列，探針序列為SEQ ID NO 3所示的序列；(3)對擴增結果進行檢測分析。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟⑵的PCR反應條件為
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)在ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀中進行。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述物種為細菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細菌選自下述細菌腸致病性大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、尿路致病性大腸桿菌、福氏志賀菌、宋內志賀菌、甲型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質沙雷菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、牛鏈球菌、糞腸球菌、小腸結腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、單增李斯特菌、空腸彎曲菌。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述細菌為類志賀鄰單胞菌。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述細菌為腸出血性大腸桿菌。
10.一種用于細菌檢測的TaqMan PCR試劑盒，所述試劑盒包括(1)熱啟動TaqDNA聚合酶；(2)實時熒光定量PCR緩沖液；(3)序列為SEQID NO 1的上游引物為和序列為SEQ ID NO 2的下游引物；(4)序列為SEQID NO 3的探針。
全文摘要
本發明提供了一種核苷酸序列及所述核苷酸序列在細菌鑒別診斷中的應用，本發明所提供的探針序列及檢測方法可以快速、特異、靈敏地檢測類志賀鄰單胞菌，有效地避免了其它細菌，特別是腸出血性大腸桿菌的非特異性擴增。
文檔編號C12N15/11GK102304573SQ20111024369
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月24日 優先權日2011年8月24日
發明者葉長蕓, 孟雙, 徐建國 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所