專利名稱：沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒、制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腸道病原菌中沙門菌與志賀菌的同步分離和鑒定方法，特別涉及利用 選擇性分離培養基生長相應的典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗鑒 定2種腸道病原菌的試劑盒和使用方法。
背景技術：
現階段使用的沙門菌、志賀菌常規分離方法在實際工作中使用傳統分離培養基的 批間質控要求繁瑣、敏感性和特異性低，對疑似菌落篩選和鑒定所用自動化生化反應試劑 材料的費用昂貴。中國專利申請200810047994. 7公開了“一種同時快速檢測沙門菌和志 賀菌的方法”，該發明屬于食源性致病菌的快速檢測技術，具體說是一種對沙門菌和志賀菌 同時進行檢測的環介導等溫 DNA 擴增(LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION, LAMP) 檢測方法。包括由樣品處理試劑、LAMP反應試劑、BST DNA聚合酶的大片段、瓊脂糖、溴酚 藍上樣緩沖溶液、溴化乙錠溶液組成的試劑的配制，以及擴增產物的檢測和沉淀產生的檢 測程序。其步驟是首先設計特異性引物；其次是提取樣品DNA;第三是配制反應體系。該 法較之目前采用的傳統細菌培養方法、免疫檢測方法和其它分子生物學方法具有操作簡 單、快速且靈敏特異的優點。可應用于食品和其它樣品中沙門菌和志賀菌的同時快速檢 測。但是該方法篩選病原菌還存在一定局限性，即篩選到的陽性結果可能無法通過細菌學 方法分離到；也可能因為存在死菌而獲得假陽性結果；另外，需設計特異性引物及提取DNA 步驟較為復雜，篩選結果判斷還不夠直觀。本發明是基于傳統細菌學技術簡化，經提煉、加 入創新材料組合成的檢測程序，包括對樣品的預處理和增值，使用專一性、選擇性平板分離 出沙門菌和志賀菌的典型菌落，結合簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗同時鑒定沙 門菌和志賀菌的試劑盒和篩選方法，較之現階段使用的傳統分離平板和鑒定技術單純依賴 生化鑒定為主的方法更具有綜合成本低、操作簡單、快速、無需依賴特殊儀器且有特異性、 準確性及陽性預期值高的優點。適用糞便(或者糞便拭子)、食品、環境水樣等多種增菌標 本中沙門菌、志賀菌的同步分離和鑒定。更在原理設計、操作人員與實驗室要求方面和分 子生物學方法有本質的區別，且篩檢的方位更為廣泛、針對性更強，所以與中國專利申請 200810047994. 7不存在相似性與可比性。發明內容
本發明的目的是提供一種一次可同步分離沙門菌和志賀菌并利用生化和酶反應 試驗鑒定的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒、制備和應用。主要解決現有沙門菌和 志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選結果不夠直觀的技術難 題。本發明用2種不同選擇性增菌液及專一性的選擇性分離平板配合簡單的糖生化發酵反 應模式和細菌特異性酶-底物反應特征建立一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗，達到 對沙門菌和志賀菌同步篩選分離和簡易鑒定的效果。
本發明的技術方案為沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，包括1、通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植 物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH 至7.3 士 0.2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C )滅菌后分裝 225mL/瓶備用。
2、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白 胨17. 0g，植物蛋白胨3. 0g，氯化鈉5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，蒸餾水100ml，加熱溶 解后矯正？11至7.3士0.2(按冷卻至251后測量值為標準)。經壓力15磅15分鐘(121°C ) 滅菌后分裝IOmL/瓶備用。
3、沙門菌增菌液亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液(SBG)。成分酵母浸出物5. 0g，蛋 白胨5. 0g, D-甘露醇5. Og,牛磺酸鈉1. Og,磺胺抑制劑0. 5g，亞硒酸鈉4. 0g, KH2P042. 65g， K2HPO4L 02g，磺綠5. Omg，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 2士0. 2 (按冷卻至25 V 后測量值為標準)。煮沸3次后分裝9mL無菌試管備用。
4、志賀菌增菌液成分胰化酪蛋白胨20. Og,氯化鈉5. 0g, KH2P042. Og, K2HP042. Og,葡萄糖1. Og,新生霉素0. 05g,吐溫-80 1. 5mL,蒸餾水IOOOml，加熱溶解后矯正 pH至7. 0士0. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C )滅菌后冷 卻至45°C -50°C添加新生霉素溶液后混勻分裝9mL無菌試管備用。
5、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD)成分瓊脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖 7. 5g，硫代硫酸鈉6. 8g，L-賴氨酸5. 0g，氯化鈉5. 0g，木糖3. 5g，酵母浸出物3. 0g，脫氧膽 酸鈉2. 5g，枸櫞酸鐵銨0. 8g，酚紅0. 08g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 5 士0. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后傾注無菌平皿置冰 箱中，備用。
6、沙門菌顯色瓊脂平板(CAS)成分瓊脂17. 0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨 10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化鈉5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg, 辛酸鹽250mg，磺胺吡啶0. 5g，蒸餾水1000ml。配制取瓊脂粉17. 0g、胰化酪蛋白胨10. 0g、 蛋白胨10. 0g、酵母浸出物3. 0g、氯化鈉5. Og置990ml蒸餾水中加熱溶解煮沸2次后，稱取 5-溴-4-氯-3- 口引哚- β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTri. HCl (ρΗ8· 0)，繼續稱取 辛酸鹽250mg溶解于細1蒸餾水中，再稱取磺胺吡啶0. 5g溶解于2ml0. 01摩爾濃度NaOH 中，待加熱培養基冷卻至50°C—并加入后混勻，調整pH至7. 2 (按冷卻至25°C后測量值為 標準)。傾注無菌平板置冰箱中，備用。
7、沙門菌-志賀菌綜合生化鑒定管配方第一試管瓊脂14. 0g，牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖1. Og,蛋白胨15. Og,甘 露醇10. 0g，尿素10. 0g，重量百分濃度為0.洲麝香草酚藍溶液10ml，重量百分濃度為0. 2% 溴麝香草酚藍溶液12. 5ml，重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液細1，蒸餾水1000ml。
第一試管配制1)、取瓊脂14.0g、牛肉膏2. Og及蒸餾水1000ml，混合后加熱溶解，并用數層紗布過濾；2)、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖l.Og、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素10. Ogjg 入已溶解的瓊脂中。充分搖勻，使全部溶解。再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉約1. 5ml, 矯正pH至7. 1 (按冷卻至25°C后測量值為標準)；3)、然后加入重量百分濃度為0.洲指示劑溴麝香草酚藍溶液12.5ml、重量百分濃度為 0. 2%甲酚紅溶液細1、重量百分濃度為0. 2%麝香草酚藍溶液10ml。指示劑配制見表1 ；4)、混合后，充分搖勻。分裝于13XIOOmm的試管內，每管約3ml ；5)、置高壓滅菌器內，經10磅壓力10分鐘的滅菌；6)、滅菌后，制成斜面，底部宜厚。待凝固后，置于冰箱中，備用。
表1指示劑所需量及其配制
權利要求
1.沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，包括1)、通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯；2)、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液10倍濃縮胰酪胨大豆胨肉湯；3)、沙門菌增菌液亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液；4)、志賀菌增菌液；5)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板；6)、沙門菌顯色瓊脂平板；7)、沙門菌-志賀菌綜合生化鑒定管包括第一試管和第二試管；8)、硫化氫濾紙條；9)、吲哚濾紙條。
2.根據權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，其特征是所述的 胰酪胨大豆胨肉湯為胰化酪蛋白胨17. 0g，植物蛋白胨3. 0g，氯化鈉5. OgjK2HPO4 2. 5g，葡 萄糖2. 5g，蒸餾水1000ml。
3.根據權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，其特征是所述 的亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液酵母浸出物5. Og,蛋白胨5. 0g, D-甘露醇5. Og,牛磺酸 鈉1. Og,磺胺抑制劑0. 5g，亞硒酸鈉4. Og, ΚΗ2Ρ042· 65g，K2HPO4L 02g,磺綠5. Omg,蒸餾水 1000ml。
4.根據權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，其特征是所述 的志賀菌增菌液配方胰化酪蛋白胨20. Og,氯化鈉5. 0g, KH2P042. 0g, K2HP042. Og,葡萄糖 1. Og,新生霉素0. 05g,吐溫-80 1. 5mL,蒸餾水IOOOml。
5.根據權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，其特征是所述的 沙門菌顯色瓊脂平板瓊脂17. Og,胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母浸出物3. Og, 氯化鈉5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸鹽250mg，磺胺抑制劑 0. 5g，蒸餾水 IOOOml0
6.根據權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，其特征是所述 的第一試管瓊脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖lg，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素 10g，重量百分濃度為0.洲麝香草酚藍溶液10ml，重量百分濃度為0.洲溴麝香草酚藍溶液 12. 5ml，重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液鈿1，蒸餾水1000ml ；第二試管瓊脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，重量百分濃度為 10%Na2HP042. 5ml，蔗糖10g，重量百分濃度為1%硫代硫酸鈉溶液2. 5ml,重量百分濃度為 0. 2%溴麝香草酚藍溶液5ml，蒸餾水1000ml。
7.權利要求1所述的沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒的制備方法，其特征是通用型非選擇性增菌液制備將胰化酪蛋白胨17. 0g，植物蛋白胨3. 0g，氯化鈉5. Og,K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 3 士 0. 2，經加熱加壓滅菌 后備用；10倍濃縮通用型非選擇性增菌液制備將胰化酪蛋白胨17. 0g，植物蛋白胨3. 0g，氯化 鈉5. 0g, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，蒸餾水100ml，加熱溶解后矯正pH至7. 3 士 0. 2，經加熱 加壓滅菌后備用；沙門菌增菌液的制備將酵母浸出物5. Og,蛋白胨5. 0g, D-甘露醇5. Og,牛磺酸鈉1. Og,磺胺抑制劑 0. 5g，亞硒酸鈉 4. 0g, KH2P042. 65g，K2HPO4L 02g,磺綠 5. Omg,蒸餾水 1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 2 士0. 2，煮沸3次后分裝無菌試管備用；志賀菌增菌液制備將胰化酪蛋白胨20. Og,氯化鈉5. 0g，KH2P042. 0g,K2HP042. Og,葡萄 糖1. 0g，新生霉素0. 05g，吐溫-80 1. 5mL，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 0 士 0. 2， 經加熱加壓滅菌后冷卻至45°C -50°C添加新生霉素溶液后混勻分裝無菌試管備用；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板制備將瓊脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖7. 5g，硫代硫酸 鈉6. 8g，L-賴氨酸5. Og,氯化鈉5. Og,木糖3. 5g，酵母浸出物3. Og,脫氧膽酸鈉2. 5g，枸櫞 酸鐵銨0. 8g，酚紅0. 08g,蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 5 士 0. 2，經加溫加壓滅菌 后傾注無菌平皿置冰箱中備用；沙門菌顯色瓊脂平板制備取瓊脂粉17. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母 浸出物3. Og,氯化鈉5. Og置990ml蒸餾水中加熱溶解煮沸2次后，稱取5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于^ilTri. HCl(pH8. 0)，繼續稱取辛酸鹽250mg溶解于 4ml蒸餾水中，再稱取磺胺吡啶0. 5g溶解于2ml0. 01摩爾濃度NaOH中，待加熱培養基冷卻 至50°C—并加入后混勻，調整pH至7. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)，傾注無菌平板置 冰箱中，備用；沙門菌-志賀菌綜合生化鑒定管制備 第一試管配制1)、取瓊脂14.0g、牛肉膏2. Og及蒸餾水1000ml，混合后加熱溶解，并用數層紗布過濾，2)、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖l.Og、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素10. Ogjg 入已溶解的瓊脂中，充分搖勻，使全部溶解，再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉1. 5ml，矯 正PH至7. 1，3)、然后加入指示劑重量百分濃度為0.洲溴麝香草酚藍溶液12.5ml、重量百分濃度為 0. 2%甲酚紅溶液細1、重量百分濃度為0.洲麝香草酚藍溶液10ml，4)、混合后，充分搖勻，分裝于13X IOOmrn的試管內，5)、置高壓滅菌器內滅菌，6)、滅菌后，制成斜面，待凝固后，置于冰箱中備用； 第二試管配制1)、取瓊脂3.0g，加入1000ml的蒸餾水中，加熱溶解，并用數層紗布過濾，2)、再取胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10. 0g、氯化鈉5. 0g、重量百分濃度為10% Na2HP042. 5ml、蔗糖10. Og及硫代硫酸鈉溶液2. 5ml，混合后，加入已溶解的瓊脂中，充分搖 勻，使全部溶解，再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉溶液1. 5ml，矯正pH至7. 6，3)、溴麝香草酚藍的配制取溴麝香草酚藍0.2g、Ν/10氫氧化鈉溶液5ml及蒸餾水 95ml，混合后放在棕色瓶中備用，4)、加重量百分濃度為0.洲溴麝香草酚藍5ml，充分搖勻，分裝于13XIOOmrn的試管內，5)、置高壓滅菌器內滅菌，取出后，置于冰箱中備用；硫化氫濾紙條的制備選取細薄的濾紙剪成3X50mm的長條，浸在飽和的醋酸鉛溶液 中，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中烤干備用；吲哚濾紙條的制備選取細薄的濾紙剪成3X50mm的長條浸于對一二甲氨基苯甲醛 5. 0g、甲醇50ml和磷酸IOml的混合液中，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中烤干即取出，冷卻至室溫備用。
8.權利要求1所述試劑盒用于血液中沙門菌和志賀菌的篩選。
9.權利要求1所述試劑盒用于糞便中沙門菌和志賀菌的篩選。
10.權利要求1所述試劑盒用于水中沙門菌和志賀菌的篩選。
11.權利要求1所述試劑盒用于食品中沙門菌和志賀菌的篩選。
全文摘要
本發明涉及腸道病原菌中沙門菌與志賀菌的同步分離和鑒定方法，主要解決現有沙門菌和志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選結果不夠直觀的技術難題。試劑盒包括1)通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯；2)10倍濃縮通用型非選擇性增菌液10倍濃縮胰酪胨大豆胨肉湯；3)沙門菌增菌液亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液；4)志賀菌增菌液；5)木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板；6)沙門菌顯色瓊脂平板；7)沙門菌-志賀菌綜合生化鑒定管包括第一試管和第二試管；8)硫化氫濾紙條；9)吲哚濾紙條。利用選擇性分離培養基生長相應的典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗鑒定2種腸道病原菌。
文檔編號C12Q1/04GK102031281SQ20101055037
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者許學斌, 金匯明 申請人:上海市疾病預防控制中心