專利名稱：：鄰單胞屬新菌株及由其產生的酶和該酶的制法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及新的微生物、新的酶以及新酶的制造方法。更詳細地說是涉及在用酶生產海藻糖時需要的，具有麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生產能力的鄰單胞菌屬(plesiomonas)屬的新微生物、從該微生物得到新的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶以及這些酶的制造方法。進而，本發明涉及使用酶法的生產海藻糖(O-α-D吡喃葡萄糖基-(1→1)-D-吡喃葡萄糖苷的新的制造方法。進而，更詳細地說是涉及是使用來自屬于鄰單胞菌屬(plesiomonas)的新微生物的新麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶而制造海藻糖的方法。海藻糖是在醫藥、化妝品、食品等方面有著廣泛前途的物質。因此，對于海藻糖和工業生產性進行了很多的試驗。這些的技術大致分為三類。其一是從具有將海藻糖積蓄到菌體內性質的微生物中提取精制該物質的方法[JournalofAmerican.Chemical.society(72卷，2059頁、1950年、德國專利第266584號、特開平3-130084號、特開平5-91890號、特開平5-184353號、特開平5-292986號]。這些方法是由微生物的培養工序、微生物的分離工序、從微生物提取海藻糖的工序、提取的海藻糖的精制結晶化工序構成的，其制造工程非常煩雜。而且海藻糖的生產率與其他方法比較不僅少，并且有多量的微生物提取殘渣作為廢物而存留下來，所以不能說是經濟的高效率方法。此外，作為其他的方法，發現了在菌體外(培養基中)生產海藻糖的微生物，開發出了培養短頸細菌(Brevibacterium)屬和棒狀桿菌(Corynebacterium)屬等的微生物，在菌體外(培養基中)生產海藻糖的發酵法[特開平5-211882號]。可是本方法中，由于海藻糖向培養基中的積蓄率約為3％(w/v)程度的低收率，所以存在著工業規模上要大量生產海藻糖而需要大容量的發酵槽和與此相配套的精制設備而帶來的經濟問題。而且在本方法中，為了得到精制的海藻糖不僅需要除菌操作，而且在培養使用菌株時，需要除去生產海藻糖以外的夾雜物或者除去培養基成分等的煩雜工序。另一方面，為了一次性地解決這些發酵法中的種種問題，已經開發出了酶法。其中已經公開的有使用來自微生物的麥芽糖磷酸酶(MaHoseOrthophosphateβ-D-glucosyltrans-ferase)和來自藻類的海藻糖磷酸酶(α，α-Trehaloseorthophosphateβ-D-glucosyltransferrase)，在磷酸存在下與麥芽糖作用而生產海藻糖的方法(特許第1513517號、Agri.Biol.Chem.，49卷，2113頁，1958年)、以及使來自細菌的蔗糖磷酸酶(Sucroseorthophosphateα-D-glucosy-ltransferase)和來自擔子菌的海藻糖磷酸酶(α，α-Trehaloseporthophosphateaα-D-glncosyltranferase)在磷酸存在下與蔗糖作用得到海藻糖的方法(平成6年度日本農藝化學會大會講演要旨集、3Ra14)。按照這些方法可以從麥芽糖或蔗糖中以60-70％的高收率生產海藻糖。此外，本方法使用的原料由于是精制了的高純度糖質，所以可以認為由酶反應得到的海藻糖的精制也很容易，與其他方法相比更利于工業生產的方法。可是，這些方法中使用酶，特別是海藻糖磷酸化酶的供給源是裸藻屬或奇果菌屬類的藻類和擔子菌，要從這些物質生產酶，不僅在經濟上存在問題，而且在技術上也存在著困難。而且，得到的海藻糖磷酸酶和與其組合使用的蔗糖磷酸酶以及麥芽糖磷酸酶，每個酶的最佳pH領域有很大的不同，所以不僅組合使用時的pH管理非常困難，而且對于溫度的穩定性也非常低，海藻糖的生成反應只能在25-37℃的低溫下進行。這樣在使用開放型的反應槽進行酶反應時，會引起雜菌污染，為了防止由此發生的付反應就需要嚴密的衛生管理。進而組合使用這些公知的酶時，由于存在著與這些酶的基質濃度的依賴性，所以不能使用高濃度的原料。為此，這種方法也不能說是經濟且效率高的方法。從以上事實可以看出，如果能發現制造及精制容易、而且且高的熱穩定性、不依賴基質濃度的新麥芽糖磷酸酶以及海藻糖磷酸酶的話，就可以以容易且大量能得到以麥芽糖為原料，高收率地、容易地、且高效率地制造海藻糖。因此，本發明的第1個目的在于提供能滿足上述各種條件的新酶、可以高生產效率生成麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的新微生物。本發明的第2個目的在于提供制造及精制容易、而且具高的熱穩定性、不依賴于基質濃度的新麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。進而，本發明的第3個目的在于提供使用上述微生物，可以簡單且高收率地得到上述2種酶的制造方法。另外，本發明的第4個目的在于使用滿足上述各種條件的新麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，而且使用麥芽糖作為基質，提供能夠在比較高的溫度及比較高的基質濃度下進行酶反應、且pH的調節容易的海藻糖的制造方法。本發明者們為了得到工業上使用的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，并且生產具有這些各種性質酶能力的微生物，廣泛地檢索了自然界。其結果，發現屬于鄰單胞菌屬的微生物可以較大量地生產具備上述條件的兩種酶，從而完成了本發明。進而，發現了從屬于鄰單胞菌屬的新微生物得到新的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，并通過使用此麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶可以達到上述目的，從而完成了本發明。即，本發明涉及具有麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生產能的。屬于鄰單胞菌屬(Plesiomonas)的微生物(生命工學工業技術研究所FERMBP-5144)。進而，本發明涉及具有以下理化性質的麥芽糖磷酸酶。(1)作用在磷酸存在下可逆地加磷酸分解麥芽糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷鍵可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸。(2)基質特異性(分解反應)與麥芽糖作用，不與其他二糖類作用。(3)最佳pH及穩定pH值范圍分解反應的最佳pH是7.0～7.5，合成反應的最佳pH是6.0。在50℃加熱10分鐘條件下pH5.5～7.0的范圍內是穩定的。(4)對溫度的穩定性pH6.0下加熱15分鐘時在45℃之前是穩定的。(5)作用適當溫度的范圍在50℃附近有分解反應的最佳作用溫度，合成反應的作用適當溫度是50℃-55℃。(6)失活條件50℃下加熱10分鐘時，pH5.0及8.0下完全失活，另外pH6.0下處理15分鐘，在55℃下完全失活。(7)抑制可被銅、水銀、鎘、鋅、N-溴代丁二酰亞胺、對氯苯甲酸汞、十二烷基苯磺酸鈉抑制。(8)用等電聚焦法的等電離點3.8(9)用SDS聚丙烯酸酰胺電泳法測定的分子量約92000(用凝膠過濾法的分子量約是200000、是由兩個亞單位構成的)。進而，本發明涉及具有以下理化性質的海藻糖磷酸酶。(1)作用在磷酸存在下可逆地加磷酸分解海藻糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷鍵可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸。(2)基質特異性(分解反應)與海藻糖作用，不與其他二糖類作用。(3)最佳pH及穩定pH值范圍分解及合成反應的最佳pH是7.0，在50℃加熱10分鐘條件下pH6.0～9.0的范圍內是穩定的。(4)對溫度的穩定性pH7.0下加熱15分鐘時在50℃之前是穩定的。(5)作用適當溫度的范圍分解反應及合成反應的作用適當溫度是50℃-55℃。(6)失活條件50℃下加熱10分鐘時，pH5.0及9.5下完全失活，另外pH7.0下處理15分鐘，在55℃下完全失活。(7)抑制可被銅、水銀、鎘、鋅、N-溴代丁二酰亞胺、對氯苯甲酸汞抑制。(8)用等電聚焦法的等電離點4.5(9)用SDS聚丙烯酸酰胺電泳法測定的分子量約88000(用凝膠過濾法的分子量約是200000、是由兩個亞單位構成的)。另外，本發明涉及麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的制造方法，其特征是培養屬于上述鄰單胞菌屬(Plesiomonas)的本發明微生物，生成、蓄積上述本發明的麥芽糖磷酸酶及上述本發明的海藻糖磷酸酶中至少一種，將其進行采集。進而，本發明涉及海藻糖的制造方法，其特征是在磷酸存在下，使上述本發明的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶與麥芽糖進行作用。以下，對本發明加以說明。本發明的新菌株是本發明者們，從靜岡縣富士市田子的浦海岸的污泥中新分離出的。該菌株若按貝格的鑒定手冊中Bacteriolgy(Bergey′sMannualofDeterminativeBacteriolgy)、第8版、第1卷鑒定時，其分離的菌株的菌學各種性質如表1所示，是屬于鄰單胞菌屬(Pleseiomonas)，被鑒定為P.shige-lloides類綠菌。可是，VP試驗及脲酶是陽性，以及可以同化D-甘露糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、并且在pH9的堿性條件下，也可以生長，從這一點看，與上述記載內容不同，而且在菌體內及培養基中(菌體外)生成、蓄積海藻糖磷酸酶及麥芽糖磷酸酶的這一點上，與已知菌株有很大差異。另外，上述菌株鄰單胞菌屬SH-35以寄存于FERMBP-5144寄存在工業技術院生命工學工業技術研究所中。麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生產菌株的菌學的性質<<p>本發明的新菌株進行如下的篩選。首先，將采集海岸污泥懸浮在調理食鹽水中，將1滴該懸浮液涂抹在下述組成的瓊脂培養基上。使用的瓊脂平板培養基含有瓊脂2％(w/v)、海藻糖或麥芽糖1％、多胨0.5％、酵母提取物0.5％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·7水合鹽0.02％。這樣，在37℃下需氧地培養瓊脂平板，得到平板上顯現的各菌落，在除去瓊脂的上述組成的液體培養基中，在37℃下，以180r.p.m振蕩培養各各菌落24-72小時。接著，在12,000×g、4℃下離心分離各培養液10分鐘，分離成菌體和上清液。將這樣得到的菌體懸浮在少量的0.1M磷酸緩沖液(7.0)中，用下述方法測定活性。其結果，可分離具有上述菌學的各種特性的菌株。本發明的新微生物是生產新麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的細菌。下面，對于這些酶的制造方法加以說明。將本發明的微生物(FERM-5144)接種到適當的培養基上，并進行培養。培養是從該菌體生長溫度觀點看，取25～42℃的溫度范圍，需氧地培養8～70小時是適當的。通過培養本發明的微生物，可生成本發明的海藻糖磷酸酶和/或麥芽糖磷酸酶。生成酶的大部分蓄積在菌體內，一部分蓄積在菌體外(培養基中)。因此，采集生成蓄積在菌體內或菌體外(培養基中)的麥芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶。另外，上述培養也可通過間歇式、連續式中的任何一種來進行。對于上述培養所用的培養基加以說明。作為碳源，可以使用有海藻糖及麥芽糖及含有它們的糖質。作為氮源，使用各種有機及無機的氮化物，進而，培養基可以含有各種無機鹽。若作為碳源，使用海藻糖或含有該物質的糖質時，本發明的微生物可優先地生產海藻糖磷酸酶。另外，若以麥芽糖或含有該物質的糖質作為碳源時，本發明的微生物可同時生產麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。但是，此時，海藻糖磷酸酶的生產量，與使用海藻糖作為碳源時相比較，有變少的趨勢。進而，若同時使用海藻糖及麥芽糖兩者或含有這些物質的糖質作為碳源時，則可同時生產海藻糖磷酸酶及麥芽糖磷酸酶，用控制海藻糖及麥芽糖的量，可控制海藻糖磷酸酶及麥芽糖磷酸酶的生成比例。另外，作為氮源可以使用玉米淀粉(コ-ンスチ-プリカ-、)大豆渣、或各種胨類等有機氮源，也可使用硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨、尿素等的無機氮源等的一般用于微生物培養的廉價化合物。另外，也可用尿素及有機氮源作為碳源。作為適合于本發明方法中使用的培養基，例如想優先生產海藻糖磷酸酶時，使用含有海藻糖1～2％(w/v)、酵母提取物2％、磷酸銨0.15％、尿素0.15％、食鹽1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·7水合鹽0.02％及碳酸鈣0.2％的pH7.0～7.5的液體培養基是適當的。另外，若想同時生產麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶時，使用含有麥芽糖1～2％(w/v)，多胨S(日本制藥制)2～3％、磷酸胺0.15％、尿素0.15％、食鹽1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·7水合鹽0.02％及碳酸鈣0.2％的液體培養基是適當的。另外，如上所述，若以麥芽糖作為碳源使用，不僅能生產麥芽糖磷酸酶，而且也生產一定量的海藻糖磷酸酶。因此，為了得到海藻糖生產用的粗酶(麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的混合物)，以麥芽糖作為碳源來使用是方便且經濟的。培養菌體內或培養上清液中蓄積的各種酶可以用常法進行分離。首先，菌體內的酶可以以每個菌體作為粗酶來使用。進而，從菌體萃取酶，也可以回收粗酶。另外，菌體外的培養上清液中也含有酶，也可將分離了菌體的殘余培養液作為粗酶含有液加以利用。進而，這些粗酶，可使用通過乙醇、丙酮、異丙醇等的溶劑沉淀法、硫酸銨分級法、離子交換色譜分析法、凝膠過濾色譜分析法等通常的方法，進行精制。進而，麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的分離，由于兩者的等電離點不同，所以可通過陰離子交換色譜法進行。這樣得到的本發明的酶，如下述實施例中詳細說明的那樣，是具有上述理化性質的麥芽糖磷酸酶及海藻磷酸酶。這些酶的活性測定，由于本發明的鄰單胞菌屬SH-35株不生產加水分解的麥芽糖及海藻糖的α-葡糖苷酶(麥芽糖酶)、葡萄糖淀粉酶，海藻糖酶等，所以在用加磷酸分解反應進行測定時，可以適用分別以麥芽糖或海藻糖作為基質，在磷酸鹽存在下，使其進行酶反應，用葡糖氧化酶法測定生成的葡萄糖的簡便方法。另外，合成反應，以β-D-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖的混合液作為基質，并能夠用常法測定通過酶反應生成的無機磷酸。酶活性測定方法(1)分解反應在50mM的磷酸緩沖液(pH7)中溶解了20mM的麥芽糖或海藻糖的溶液0.5ml中，添加酶液0.01ml，在50℃下使其反應15分鐘后，在沸騰水浴中加熱3分鐘后，終止酶反應。接著，在流水中冷卻后，用葡糖氧化酶法(和光純藥工業(株)制、葡萄糖C-II試驗·和光)測定生成的葡萄糖。在此，1單位的酶活性是將在相同條件下，在1分鐘內，以1μmole(微摩爾)的葡萄糖作為生成的酶量。(2)合成反應在70mM的HEPES緩沖液(pH7.0)中溶解了的27mM的β-D-葡萄糖-1-磷酸鈉鹽和同濃度的葡萄糖的混合溶液0.15mM中，添加0.05ml的酶液，在50℃下使其反應15分鐘后，在沸騰水浴中加熱2分鐘后終止酶活性。接著，用和光純藥工業(株)制P-試驗和光測定生成的無機磷酸。在此，1單位的酶活性是，在同上條件下，1分鐘內，以1摩爾(μmole)的無機磷酸作為生成的酶量。作為本發明的新酶的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶；可分別作為粗酶或精制酶來利用。進而，也可以將具有兩酶活性的菌體及將該菌體包括、吸附或化學地結合在適當的載體上的固定菌體用于例如制造海藻糖。進而，本發明的酶也可作為用公知的方法進行固定的各種酶的固定酶來使用。本發明的海藻糖的制造方法，是在磷酸存在下，使上述2種酶與麥芽糖作用的方法。磷酸是麥芽糖加磷酸進行分解所必要的，反應液中取0.1～500毫摩爾/升、優選的是5～10毫摩爾/升的濃度范圍是適宜的。作為磷酸，例如可以使用正磷酸、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等的無機磷酸及其鹽等。另外，作為基質，使用麥芽糖。但是，麥芽糖可以是精制品，或者也可以是含有麥芽糖的糖質。麥芽糖濃度，從容易操作的粘度的溶液，及每次加料的收量即所謂經濟性的觀點看，取10～600克/升、優選的是200～400克/升的范圍是適宜的。酶的濃度可以考慮海藻糖的生成率及反應時間等而適當地決定。但是，通常取0.1～50單位/g-基質為適宜。反應溫度可考慮酶的最佳溫度及反應時間等而適當地決定，但若考慮防止雜菌污染，取30～65℃、優選的為45～55℃范圍是適宜的。另外，反應pH，若考慮酶的最佳pH，取5.0～9.0，優選的是6.0～7.0的范圍是適宜的。反應時間可根據海藻糖的生成率、酶的添加量、反應容器的容量來適宜地決定。但是，一般，在工業規模時，50～80小時的范圍是適宜的。麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酯，可以分別作為粗酶或精制酶加以利用。進而，也可使用具有兩酶活性的菌體及將該菌體包括、吸附或化學地結合于適當的載體中的固定菌體。進而，也可作為用公知的方法固定的各種酶的固定酶來使用。例如，可以使用用海藻酸及K-角叉薄聚糖固定菌體或將提取酶吸附在陰離子交換樹脂上的。通過上述反應生成的海藻糖，與淀粉糖的精制方法相同地，可以通過硅藻土過濾、用離子交換樹脂進行脫鹽、用離子交換色譜分析法的分級、濃縮、結晶化而進行分離精制。以下，用實施例進一步說明本發明。實施例1菌體內及菌體外麥芽糖磷酸酶的制造及精制將鄰單胞菌屬SH-35株(FERMBP-5144)接種在含有麥芽糖1％(w/v)、多胨S(日本制藥制)2％、磷酸銨0.15％、尿素0.15％、食鹽1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·七水合鹽0.02％及碳酸鈣0.2％的pH7.0的液體培養基上。接著，將該液體培養基，在37℃下需氧地培養24小時。將得到的培養液，在4℃下，以12,000×g離心分離15分鐘，分開菌體及上清液。將得到的菌體懸浮在少量的20mM磷酸緩沖液(pH7.0)后，用超聲波菌體破碎機破壞菌體。然后，在該破碎菌體懸浮液中，加入硫酸銨，作成30％飽和液，在4℃下放置一夜。接著，進行離心分離、除去沉淀物，在得到的上清液中進一步加入硫酸銨，作成70％飽和液。在4℃下放置一夜，以離心分離收集生成的沉淀物，使其溶解在20mM磷酸緩沖液(pH7)后，用上述相同緩沖液進行充分的透析。接著，在用上述相同緩沖液進行平衡了的DEAE-付拉克特凝膠(默克社制)柱中通入上述液體，以吸附酶。用含在上述相同緩沖液中所含的OM到0.6M的食鹽濃度梯度法洗脫出吸附了的酶后，用UF臘(阿米康社制、YM-30)進行濃縮。濃縮酶，用含有0.2M食鹽的上述相同緩沖液平衡了的賽法克利爾(セファケリル)S-300(弗爾馬西亞社制)柱，用凝膠過濾色層(分離)法進行精制。收集得到的活性成分，用含有1.5M硫酸銨的上述相同緩沖液充分地透析后，通入到用含有1.5M硫酸銨的上述相同緩沖液平衡了的費尼爾·特約帕爾(東曹社制)柱中，以吸附酶。用在上述緩沖液中所的從1.5M到0M的硫酸銨濃度梯度法洗脫出吸附了的酶后，收集得到的活性成分，用含有0.2M食鹽的上述緩沖液充分地進行透析。用上述的UF膜濃縮后，用含有0.2M食鹽的上述緩沖液平衡了的斯帕第克斯200(弗爾馬西亞社制)再次進行凝膠過濾色層(分離)法，并用上述方法濃縮得到的活性成分后，用聚丙烯酰凝膠園片電泳法(PAGE)及SDS-PAGE法，可得到均勻的菌體內麥芽糖磷酸酶精制酶(5ml、約2,800單位、活性收率約28％)。另外，對于菌體外酶，也以培養上清液作為初始原料，用與上述方法相同的方法進行精制濃縮，以活性收率約25％(5ml、約425單位)得到麥芽糖磷酸酶的精制酶。實施例2菌體內及菌體外海藻糖磷酸酶的制造及精制將鄰單菌屬SH-35株(FERMBP-5144)接種在含有海藻糖1％(w/v)、酵母提取物2％、磷酸銨0.15％、尿素0.15％、食鹽1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·七水含鹽0.02％及碳酸鈣0.2％的pH7.0的液體培養基上。將該液體培養基與實施例1相同地進行培養，經過后處理，得到菌體破碎液及上清液。對于得到的菌體破碎液和上清液，分別用與實施例1相同的方法進行精制。用PAGE法及SDS-PAGE法，分別以活性收率35％(5ml、約7,880單位)及32％(5ml、約2,400單位)得到均勻的菌體內海藻糖磷酸酶及菌體外海藻糖磷酸酶。實施例3鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海或糖磷酸酶的酶化學的各種性質關于本發明鄰單胞菌屬SH-35株(FERMBP-5144)生產的新的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的一般的酶化學特性，使用以與實施例1及2相同的方法精制得到的精制酶進行研究，其結果如下所示。另外，予實驗結果，由于在菌體內及菌體外兩種酶顯示了大致相同的物理化學的各種性質，所以在此，表示了菌體內酶的各種性質。(1)作用在10mM磷酸緩沖液(pH7.0)中溶解了1％(w/v)的麥芽糖及海藻糖溶液中，對于1g基質分別添加5單位(分解反應)的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，在50℃下反應5小時后，在沸水浴中加熱3分鐘，用高速液體色譜法測定酶失活后而得到的糖化液中的糖。其結果分別檢測出葡萄糖及葡萄糖-1磷酸。另外，在以10mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)鹽酸緩沖液(pH7.0)中溶解了的1％的(w/v)的葡萄糖及β-D-葡萄糖-1磷酸鈉鹽或者α-D-葡萄糖-1磷酸鈉鹽的混合溶液作為基質，對于1g基質，分別添加5單位麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，在50C下反應5小時后，如上述那樣進行處理，測定其糖組成的結果，從葡萄糖及β-D-葡萄糖-1磷酸鹽分別檢測出麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，但沒檢測出來自葡萄糖及α-D-葡萄糖-1磷酸鹽的二糖類的合成反應。用以下方法進行生成糖的分析。即，以用0.45μm的薄膜過濾器過濾加熱失活得到的糖化液中的不溶物所得到的濾液作為供試驗糖液，使用YMC-Pack、ODS-AQ(AQ-304、YMC社制)柱的高速液相色譜分析法進行測定。另外，在移動相中使用水，柱溫為30℃檢測時，使用了差示折射儀。(2)基質特異性(分解反應)以各種糖類作為基質時的活性作為相對活性來代替以往所述的活性測定法(分解反應)所示的基質(麥芽糖或海藻糖)進行表示。其結果如表2所示。鄰單胞菌屬SH-35株生產的葡萄糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的基質特異性<<p>(3)最佳pH及穩定pH范圍使用精制酶，測定分解及合成反應的最佳pH。其結果，如圖1A所示。麥芽糖磷酸酶的分解反應(用白圈表示)的最佳pH為7.0～7.5，而合成反應(用黑圈表示)是6.0為最佳值。另外，如圖1B所示，對于海薄糖磷酸酶，分解反應(白圈)及合成反應(黑圈)都是7.0為最佳值。另外，pH分解反應時，使用20mM磷酸緩沖液進行調節，而在合成反應時，分別使用MES(pH5.5-6.5)、MOPS(pH值6.5～7.0)、HEPES(pH7.0～8.0)、Tris-鹽酸(pH7.5～9.0)-的各緩沖液進行調節。另外，在各緩沖液中，在50℃下處理10分鐘精制了的兩種酶，以分解反應測定它們的殘存酶活性；其結果如圖2所示，麥芽糖磷酸酶(白圈)的pH是在5.5～6.5的范圍、海藻糖磷酸酶(黑圈)的pH在6.0～9.0范圍是穩定的。且pH用醋酸(pH5.0～5.5)、磷酸(pH6.0～8.0)、碳酸(pH8.9)的各緩沖液進行調整。(4)反應作用適當溫度測定兩酶的分解反應及合成反應的作用適當溫度的結果，如圖3所示，麥芽糖磷酸酶(A.白圈分解反應、黑圈合成反應)、海藻糖磷酸酶(B.白圈分解反應、黑圈合成反應)，分解反應均是50℃、合成反應均是50～55℃范圍。(5)由于溫度引起失活的條件將麥芽糖磷酸酯及海藻糖磷酸酶，分別在穩定的pH為6.0及7.0的條件下，處理15分鐘，將殘存的失活與無處理的比較，用常法進行測定。其結果，如圖4所示，麥芽糖磷酸酶(白圈)在55℃下，另外，海藻糖磷酸酶(黑圈)在60℃下完全失活。(6)抑制劑在各種抑制劑存在下，測定兩種酶的合成反應的活性，以無添加時的活性作為100％的相對活性而表示的結果，如表3所示。各種抑制劑對于鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的影響EDTA(乙二胺四乙酸)，IAA(乙酸-碘)，NBS(N-溴代丁二酰亞胺)，pCMB(對氯苯甲酸汞)，pMSF(P-甲磺酰氟)，SDS(十二烷基苯磺酸鈉)(7)等電離點通過使用愛索凝膠(FMCBioproducto社制)的等電聚焦法測定兩酶的等電離點的結果，如圖5所示，麥芽糖磷酸酶為3.8、海藻糖磷酸酶為4.5。(8)分子量通過使用SDS-PAGE法及賽法克利爾(セファケリル)S-200的凝膠過濾法，測定兩種精制酶的分子量。其結果，如圖6所示，用凝膠過濾法時，兩酶的分子量約為200,000，而用SDS-PAGE法時，麥芽糖磷酸酶約為92,000，而且海藻糖磷酸酶約為88,000，所以可以予想這些酶分別是由兩個亞單位構成的。將上述的各種理化性質，與已知的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶進行比較，歸納在表4及表5中。各種來源的麥芽糖磷酸酶的理化性質</tables>各種來源的海藻糖磷酸酶的理化性質<p>實施例4菌體內及菌體外海藻糖磷酸酶的制造方法將予先在同上培養基培養一夜得到的鄰單胞菌屬SH-35株種菌(FERMBP-5144)11，無菌地添加到含有海藻糖1％(w/v)、酵母提取液(Difco社制)2％、磷酸銨0.15％、尿素0.15％、食鹽1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂·七水合鹽0.02％及碳酸鈣0.2％的pH7.5的液體培養基201中，在37℃、300rpm、通氣量1V.V.m條件下，通過攪拌培養24小時。測定該培養液的海藻糖磷酸酶活性的結果，每1ml培養液的活性為1.5單位。另外，同樣地也測定麥芽糖磷酸酶活性，但其活性是微量。接著，以12,000×g、4℃下，離心分離10分鐘，得到約160g的菌體(濕潤時)及19.51的上清液，用羅米康(Romicon)社制UF膜(YM-30)濃縮，得到約11(約6,400單位)的菌體外濃縮粗酶。測定上清液中的酶活性結果，有全活性(約30×103單位)的約25％(7.5×103單位)的活性。另外，對于菌體部分，用10mM的磷酸緩沖液(pH7)充分洗凈，懸浮在500ml的同上緩沖液后，用超聲波菌體破碎機破碎菌體，用常法測定海藻糖磷酸酶活性結果，全活性的約75％(22.5×103單位)含在菌體內。實施例5(含有麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶菌體及菌體外酶的制造)分別以實施例1所用的培養基成分中的海藻糖代替麥芽糖、用酵母提取液代替多胨FC(日本制藥(株)制5％(w/v)，除此之外，用同樣的方法培養SH-35株(FERMBP-5144)。測定該培養液的麥芽糖磷酸酶活性及海藻糖磷酸酶活性的結果，每1ml培養液中含有0.5單位的麥芽糖磷酸酶活性及0.45單位的海藻糖磷酸酯酶。接著，同樣地進行離心分離，得到約150g的菌體(濕潤時)及19.61的上清液。接著，測定菌體及上清液中的麥芽糖磷酸酶活性結果，麥芽糖磷酸酶的全活性的約78％(約10,000單位)含在菌體內，而約22％含在菌體外(培養上清液)。另外，海藻糖磷酸酶的全活性的約82％(約9,000單位)含在菌體內、而約18％含在菌體外。用與實施例1相同的方法，濃縮培養上清液，得到約11的濃縮酶，在該濃縮酶中，含有1,700單位的麥芽糖磷酸酶和1,430單位的海藻糖磷酸酶。實施例6在l0ml的10mM磷酸緩沖液(pH6)中溶解了10、20、30及40％(w/v)的各麥芽糖溶液中，對于每1g基質重量，分別添加5單位(分解活性)的，用與實施例2及實施例1相同方法調制的菌體內精制海藻糖磷酸酶及菌體內精制麥芽糖磷酸酶，在55℃下，使其反應70小時。反應結束后，測定在100℃下加熱5分鐘反應，使酶失活后得到的糖化液中的海藻糖含量。其結果，對于基質重量，分別生成58.2、58.1、58.6、57.9％的海藻糖。另外，用以下方法進行海藻糖的定量。即，在加熱失活的糖化液中加入水，制得約1％(w/v)后，在該糖化液0.5ml中添加0.01單位的葡糖糖化酶(生化學工業制、純凈級30U/mg)，在50℃、pH5.0下，使其反應1小時，將未反應的麥芽糖完全分解成葡萄糖。接著，在100℃的沸騰水浴中，加熱5分鐘，使葡糖糖化酶失活后，使用YMC-PackODS-AQ(AQ-304、Ymc社制)柱的液相色譜分析法(HPLC法)測定用0.45μm的膜過濾器除去生成不溶性蛋白質后得到的濾液中的海藻糖含量。另外，測定是在移動相使用水、柱溫為30℃，檢測時使用差示析射儀的條件下進。實施例7在10ml的5mM磷酸緩沖液(pH6)中溶解了20％(w/v)的高濃麥芽糖漿液(日本食品化工制、商品名MC-95、糖組成葡萄糖2.5％、麥芽糖95.2％、麥芽三糖0.8％、麥芽四糖1.5％)中，對每1g基質重量，分別添加5單位的，用與實施例2及1相同的方法調制的菌體外精制海藻糖磷酸酶及菌體外精制的麥芽糖磷酸酶，以下與實施例6相同地進行反應。用HPLC法測定生成的海藻糖結果，對于使用的基質重量是54.3％。實施例8用與實施例7相同的方法調制，得到含有海藻糖磷酸酶及麥芽糖磷酸酶的菌體約1kg(濕潤時)。用常法測定酶活性(分解活性)，其結果在該菌體中，具有55單位/g(濕潤時)的海藻糖磷酸酶及68單位/g(濕潤時)的麥芽糖磷酸酶活性。在10mM的磷酸緩沖液(pH6.5)中含有30％(w/v)的麥芽糖溶液2501中，添加1kg調制了的菌體，在50℃下使其反應80小時后，離心分離除去菌體。將得到的上清液的一部分進行葡糖糖化酶處理，用HPLC法測定其糖組成。其結果，海藻糖為58.1％、葡萄糖39.6％、葡萄糖-1-磷酸為2.3％。接著，在得到的糖化上清液約2401(固態物72kg)中，對于固態物重量，添加0.1％的工業用粗葡糖糖化酶(新日本化學社制、商品名斯密其姆#3,000)，將在pH5.5、55℃下再糖化20小時后殘存的麥芽糖、大致完全地加水分解成葡萄糖。接著，用常法，活性炭脫色通過離子交換樹脂脫鹽等進行精制，在減壓下進行濃縮，得到濃度約75％(w/v)的精制糖化液(固態物約65kg)。本發明的效果按照本發明，提供在菌體內及菌體外(培養基中)中，可生產得到制造海藻糖時所必要的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的新的微生物。由于本發明的微生物是細菌，與作為以往海藻糖磷酸酶來源的已知的綠藻及擔子細菌相比較，酶的取得方法不僅容易，而且培養時間也大幅度地縮短，所以是經濟的。進而，本發明的微生物也具有一種細菌可同時生產海藻糖的酶的生產必要的兩種酶的優點。另外，本發明的兩種酶，由于能滿足用酶生產海藻糖時要求的各種條件，所以很容易地有效地利用得到的海藻糖，也能保證在經濟上得到大幅度地改善。即，本發明的麥芽糖磷酸酶，及海藻糖磷酸酶由于具有高溫穩定性，且在高溫下可進行酶反應，所以可避免反應中的雜菌污染。進而，由于兩種酶具有大致相同的最佳pH范圍，所以具有不需要在反應中進行復雜的pH調節的優點。進而，按照本發明，使用新的麥芽糖磷酸化酶及海藻糖磷酸化酶，可以用酶法制造海藻糖。另外，本發明的海藻糖的制造方法，pH的調節是容易的，即使在高基質(麥芽糖)濃度下，也可以高收率得到海藻糖。進而，也可使反應溫度變高，選擇更高反應溫度，可以高收率地得到海藻糖。進而，由于可以在高溫下進行酶反應，所以可以避免反應中的雜菌污染。圖的簡單說明圖1表示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的反應最佳曲線[符號分解反應(○)、合成反應(●)]。圖2表示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的pH穩定性[符號麥芽糖磷酸酶(○)、海藻糖磷酸酶(●)]。圖3表示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的作用適宜溫度[符號分解反應(○)、合成反應(●)]。圖4表示示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的溫度穩定性[符號麥芽糖磷酸酶(○)、海藻糖磷酸酶(●)]。圖5表示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的等電離點。圖6表示鄰單胞菌屬SH-35株生產的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的分子量。權利要求1.一種屬于鄰胞菌屬(Plesiomonas)的微生物(FERMB)-544)，其具有麥芽糖磷酸酶及海藻磷酸酶的生產能力。2.一種具有下述理化性質的麥芽糖磷酸酶，(1)作用在磷酸存在下可逆地加磷酸分解麥芽糖在的α-1，4-呋喃葡萄糖苷鍵可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸，(2)基質特異性(分解反應)與麥芽糖作用，不與其他二糖類作用，(3)最佳pH及穩定pH值范圍分解反應的最佳pH是7.0～7.5，合成反應的最佳pH是6.0。在50℃加熱10分鐘條件下pH5.5～7.0的范圍內是穩定的，(4)對溫度的穩定性pH6.0下加熱15分鐘時在45℃之前是穩定的，(5)作用適當溫度的范圍在50℃附近有分解反應的最佳作用溫度，合成反應的作用適當溫度是50℃-55℃，(6)失活條件50℃下加熱10分鐘時，pH5.0及8.0下完全失活，另外pH6.0下處理15分鐘，在55℃下完全失活，(7)抑制可被銅、水銀、鎘、鋅、N-溴代丁二酰亞胺、對氯苯甲酸汞、十二烷基苯磺酸鈉抑制。(8)用等電聚焦法的等電離點3.8(9)用SDS聚丙烯酸酰胺電泳法測定的分子量約92000(用凝膠過濾法的分子量約是200000、是由兩個亞單位構成的)。3.一種具有下述理化性質的海藻糖磷酸酶，進而，本發明涉及具有的下理化性質的海藻糖磷酸酶。(1)作用在磷酸存在下可逆地加磷酸分解海藻糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷鍵可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸，(2)基質特異性(分解反應)與海藻糖作用，不與其他二糖類作用，(3)最佳pH及穩定pH值范圍分解及合成反應的最佳pH是7.0，在50℃加熱10分鐘條件下pH6.0～9.0的范圍內是穩定的，(4)對溫度的穩定性pH7.0下加熱15分鐘時在50℃之前是穩定的，(5)作用適當溫度的范圍分解反應及合成反應的作用適當溫度是50℃-55℃，(6)失活條件50℃下加熱10分鐘時，pH5.0及9.5下完全失活，另外pH7.0下處理15分鐘，在55℃下完全失活，(7)抑制可被銅、水銀、鎘、鋅、N-溴代丁二酰亞胺、對氯苯甲酸汞抑制，(8)用等電聚焦法的等電離點4.5(9)用SDS聚丙烯酸酰胺電泳法測定的分子量約88000(用凝膠過濾法的分子量約是200000、是由兩個亞單位構成的)。4.一種麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的制造方法，其特征是培養權利要求1所述的微生物，生成、積蓄權利要求2所述的麥芽糖磷酸酶以及權利要求3所述海藻糖磷酸酶的至少一種，而后采集。5.權利要求4所述的制造方法，其中上述培養是在碳源麥芽糖存在下進行，生成積蓄麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。6.權利要求4所述的制造方法，其中上述培養是在碳源海藻糖存在下進行，優先地生成積蓄海藻糖磷酸酶。7.權利要求4所述的制造方法，其中從培養后的培養液中分離菌體，將分離的菌體直接作為麥芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶。8.權利要求4所述的制造方法，其中從培養后的培養液中分離菌體，從分離的菌體提取麥芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶。9.權利要求4所述的制造方法，其中從培養后的培養液中分離菌體，將得到的培養上清液作為麥芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶含有液。10.一種海藻糖的制造方法，其中特征是將權利要求2所述的麥芽糖磷酸酶以及權利要求3所述的海藻糖磷酸酶在磷酸的存在下與麥芽糖作用。11.權利要求10所述的制造方法，其中麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶是培養權利要求1所述的微生物后而得到的菌體內酶素或菌體外酶素。12.權利要求10或11所述的制造方法，其中酶反應是在30℃～65℃的溫度范圍內進行。全文摘要本發明涉及在用酶生產海藻糖時需要的，具有麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生產能力的鄰單胞菌屬的新微生物，從該微生物得到的新的麥芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶以及這些酶的制造方法。本發明還涉及使用酶法的生產海藻糖的新的制造方法。文檔編號C12N9/10GK1134980SQ95118448公開日1996年11月6日申請日期1995年9月15日優先權日1994年9月16日發明者吉田雅浩,中村信之,掘越弘毅申請人:日本食品化工株式會社