專利名稱：：食品中5種新出現致病菌的檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及用于食品中5種新出現致病菌，即香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌及梅氏弧菌檢測的試劑盒及檢測方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
：食品微生物存在水產品、肉制品、乳制品等各種食品中廣泛存在，對于微生物的快速檢測技術的研究，是食品安全工作者們一直努力的方向。從文獻報道來看，人們的研究主要集中在幾種常見的微生物項目上，如沙門氏菌、單增李氏菌等，但對于梅氏弧菌、河流弧菌、類志賀鄰單胞菌、香港海鷗型菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌等的研究相對較少，對其在食品中的存在方式及其對人類造成的疾病危害也知之甚少。但它們對人類健康的危害是不可小覷的Elhadi等對馬來西亞市售海產品進行致病性弧菌的研究，發現梅氏弧菌占檢出致病弧菌總量的9.9%。劉秀梅等報告了青島黃島區1990年510月間，從腹瀉病人、海水、海產品等299份標本中分離出30株梅氏弧菌；其研究表明，梅氏弧菌是一類動物傳染性微生物，可通過食物鏈傳染給人類。因此應對該類菌進行廣泛而深入地快速檢測技術研究。梅氏弧菌(F/6n'oMetoc/w汰ov//)又稱麥氏弧菌，是一種致病性弧菌，廣泛存在于河流、海灣和下水道中，同時在人群和動物腸道中可分離到。國內關于梅氏弧菌引起食物中毒的報道較少。近年來，張銘漢等和曲飛等報道一起因食用梅氏弧菌污染的食品引起的中毒，周智凱等報道2000年4月一起因進食被梅氏弧菌污染的肉丸而引起的某小學集體食物中毒，沈強對該小學發生集體食物中毒的樣品檢出梅氏弧菌。梅氏弧菌引起的食物中毒癥狀主要表現為腹部不適、腹痛(主要出現在肚臍周圍)、惡心、嘔吐、腹瀉，個別人還會發燒。目前國內外對于梅氏弧菌的檢測研究報道很少，采用的研究方法包括經典的培養生化鑒定方法及基于生化原理的ATB細菌鑒定儀法，但未見開展PCR及相關技術快速檢測梅氏弧菌的研究報道。傳統的培養生化鑒定方法存在著檢測周期長、步4驟繁瑣、生化反應不穩定等缺點，食品微生物學檢測工作者們都致力于研究建立快速、簡便的檢測方法，以確保食品安全。香港海區鳥菌(Z^7'^"w/zo"^:o;7gm^，LH)是一種新的食源性致病菌。該菌最先于2001年由香港大學醫學院微生物學系袁國勇教授和胡釗逸副教授等在從入院的肝硬化病人的血液和胸腔膿液中分離得到。LH為變形菌門(Proteobacteria)、變形菌纟岡(Betaproteobacteria)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)的一個新屬，最初命名為HKU1。之后又相繼在多名香港腹瀉病人的糞便中分離到該菌，將其命名為香港海鷗菌。經鑒定該菌為兼性厭氧，不產芽孢，革蘭染色陰性，海鷗型或螺旋型桿狀，在綿羊血瓊脂培養基上不發生溶血反應。典型的菌落特征在CMA(頭孢哌酮麥康凱)培養基上呈無色、透明、扁平狀，邊緣光滑整齊，直徑在0.5mmlmm之間的微小菌落。菌落挑取時與瓊脂面無粘連。香港海鷗菌只存在淡水魚中，在其他肉類食品中未發現有該菌的存在。中國四大著名的淡水魚種，草、青、鰱、鳙，均有報道檢出。其中最多的是草魚和鳙魚。食用了未經煮熟的被該菌污染的魚肉或是被交叉污染的食物，可引起人們腹瀉。臨床表現與沙門氏菌和空腸彎曲菌引起的病癥相似，大部分病人出現水樣腹瀉，偶有血便，是近20年來醫學界發現的首種可引起致病人腹瀉，甚至嚴重腸胃炎的新的致病菌。目前該菌的感染病例在香港、中國大陸、日本、瑞士、非洲及中美洲相繼被發現，已顯示在全球廣泛存在。調査得知，約有25%的淡水魚中存在香港海鷗菌。類志賀鄰單胞菌(P/^/owo"似^2/ge〃o/cfes)。經常存在于水中，也存在于人和動物的腸道中。本菌與宋內氏志賀氏菌有共同抗原，能被宋內氏志賀氏菌的抗血清所凝集。可引起急性胃腸炎、也可引起骨髓炎、腦膜炎、蜂窩組織炎及菌血癥。經鑒定該菌為圓端的直桿菌，0.81.0pmx3.(Him。革蘭氏陰性。通常以極生鞭毛運動。兼性厭氧，化能異養菌。具有呼吸和發酵代謝類型，最適生長溫度37'C。對葡萄糖和其他糖類能產酸但不產氣。氧化酶和接觸酶皆陽性。產吲哚。V-P陰性。賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶皆陽性。脂酶陰性。還原硝酸鹽。大多數菌株對弧菌抑制劑2，4-二氨基-6，7-異丙基喋啶(0/129)敏感。具有腸桿菌科的共同抗原。出現于魚和其他水生動物和各種哺乳動物。與腹瀉有關，偶爾也是人的條件致病菌。5粘質沙雷氏菌(5^ra^mwcwcera)廣泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。粘質沙雷氏菌又稱靈桿菌，為細菌中最小者，約0.5X(0.51.0)微米。周身鞭毛，能運動。無莢膜，無芽胞，在普通瓊脂平板上2530'C培養12天出現粘性、中心顆粒狀、有惡臭的菌落。約半數菌株能產生紅色的靈菌素(prodigiosin)，在室溫條件下易促進色素的生成。有46個血清型，血清型與色素產生無關。粘質沙雷氏菌是臨床上常見的條件致病菌，在機體免疫功能降低時可引起肺部和尿道感染以及敗血癥。尤其在類固醇類激素，免疫抑制藥造成機體免疫力降低時，容易發病。氣味沙雷氏菌(&rra"ao&n/era)—般存在于土壤、水、植物、動物以及人類的腸道和呼吸道中，能產生非水溶性黃、紫和紅色素的革蘭氏染色陰性小桿菌。細胞直桿狀，直徑0.5-0.8微米，長0.9-2.0微米，端圓。符合腸桿菌科的一般描述。通常周生鞭毛運動。兼性厭氧。菌落大多數不透明，有些虹彩；白色、粉紅或紅色。幾乎所有的菌株能在10-36°C、pH5-9、含有0-4。/。(W/V)的NaCl中生長。這些菌分布在自然界(土壤、水、植物表面)中或作為人的條件致病菌。目前，針對食品微生物的快速檢測技術主要包括基于PCR基礎的凝膠電泳法、實時熒光PCR法、熒光免疫檢測法(VIDAS)、膠體金免疫測試條和基因芯片測試法等，這些技術方法都存在的各自的優缺點和應用范圍的局限性。PCR電泳技術存在著操作步驟繁瑣、極易引發污染的問題，且目前未見采用基于PCR技術檢測食品中梅氏弧菌、類志賀鄰單胞菌、香港海鴟型菌、肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌等8種微生物的文獻報道；實時熒光PCR技術存在著測試成本高、能夠檢測的目標菌范圍小的問題；熒光免疫檢測技術(VIDAS)技術存在著測試成本高、能夠檢測的目標菌范圍很小的問題；膠體金免疫測試技術存在著假陽性率高、能夠檢測的目標菌范圍更小的問題；基因芯片技術檢測技術能夠檢測的范圍也很有限，并且測試成本高、距離實際應用仍存在著尚未解決的技術瓶頸問題。使用傳統的微生物檢測方法耗時長、操作復雜，不宜做大批量樣本的檢測，在類似食品和化妝品等其他需大批量檢測的方面，傳統的檢測方法暴露出其種種弊端。而在臨床上由于檢測的時間長更可能會導致延遲診斷和治療。基于上述事實，急需建立針對食品中5種新出現致病菌，即香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌及梅氏弧菌的高效、快捷、簡本發明首先提供用于快速檢測食品中香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌及梅氏弧菌的基于PCR-DHPLC檢測的試劑盒。食品中5種新出現致病菌的檢測試劑盒，該試劑盒包括5種檢測溶液，這5種檢測溶液中均含有10mMTris*Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM及TaqDNA聚合酶5UL;檢測溶液A中還含有香港海鷗型菌引物對10^M;檢測溶液B中還含有粘質沙雷氏菌引物對10)iM;檢測溶液C中還含有氣味沙雷氏菌引物對10nM;檢測溶液D中還含有類志賀鄰單胞菌引物對10^M;檢測溶液E中還含有梅氏弧菌引物對10nM;其中，各個菌株的引物對序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')擴增產物(bp)香港海鵑型菌GAAAGGGAGCGGTAACACAGTGGCGGATTCCACTCCCATG403粘質沙雷氏菌GGAAGCGACTGCATTATTACCATTGGTGGTGGCGATCACTT332氣味沙雷氏菌TCGAGCGGTAGCACAGGACAACGTATTAAGCTATTG412類志賀鄰單胞菌CTTGTGATTCGTAATGGCTGACCATAACAACGTCAGCAACTA284梅氏弧菌AGCATGACCAAGCTGCTCTTGCAAATATCCGACAGCACCATT260本發明還提供了利用上述試劑盒檢測食品中5種新出現致病菌的方法，包括如下步驟①PCR反應取l)il待測樣品DNA溶液，根據檢測目標菌加入相應的檢測溶液10^和14^1滅菌超純水，總體積25^1;將以上各組分加入至0.2mLPCR反應管中，混勻，5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR循環預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，6(TC退火60s，72t:延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②將PCR擴增產物進行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3|am;柱溫50°C;流動相(體積比)0.0min，48.0%緩沖溶液A，52.0%緩沖溶液B;0.5min，42.9%緩沖溶液A，57.1%緩沖溶液B;2.4min，40.1%緩沖溶液A，59.9%緩沖溶液B;4.3min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;6.1min，36.9%緩沖溶液A，63.1%緩沖溶液B;8.0min，36.0%緩沖溶液A，64.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5pL。檢測結朿后，根據DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形、保留時間以及與陽性對照譜圖的對照，來確定樣品的染菌情況。本發明采用PCR-DHPLC技術，針對食品中5種新出現致病菌建立靈敏便捷的檢測方法，并建立應用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發明的檢測試劑盒及檢測方法，可以高靈敏度地檢測食品中的香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌及梅氏弧菌，并且檢測耗時短，操作簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。本發明附圖5幅，圖1是梅氏弧菌特異性檢測的DHPLC圖譜，其中，1是梅氏弧菌；28.分別為副溶血性弧菌，霍亂弧菌，溶藻性弧菌，創傷弧菌，河流弧菌，擬態弧菌，解蛋白弧菌和嗜水氣單胞菌8圖2是粘質沙雷氏菌特異性檢測的DHPLC圖譜，其中，l是粘質沙雷氏菌ATCC14040，2是粘質沙雷氏菌分離株，3是氣質沙雷氏菌ATCC33077;圖3是氣質沙雷氏菌特異性檢測的DHPLC圖譜，其中，l是氣質沙雷氏菌ATCC33077，2是氣質沙雷氏菌分離株，37分別為粘質沙雷氏菌、液質沙雷氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌和沙門氏菌；圖4是香港海鷗型菌特異性檢測的DHPLC圖譜，其中，13是香港海鷗型菌；48分別是金黃色葡萄球菌，嗜水氣單胞菌，熒光假單胞菌，河流弧菌和梅氏弧菌；圖5是類志賀鄰單胞菌特異性檢測的DHPLC圖譜。上述附圖巾，橫坐標均為保留時間(單位分鐘min)，縱坐標表示吸收峰信號強度(單位毫伏mV)。具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，但并不以任何形式限制本發明的內容。若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器及其商品來源為營養肉湯培養液，普通瓊脂培養平板，以及本部分所使用的各菌株的增菌、分離和生化鑒定培養基等均按照相關的國家標準(GB)、檢驗檢疫行業標準(SN)或國際權威標準方法中的配方，購于美國BD公司。細菌基因組DNA提取試劑(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)及ExTaq等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司；乙腈(色譜純)購自Fisher公司。本部分所使用的標準菌株分分別購自美國ATCC標準生物品收藏中心和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。實施例1、食品中5種新出現致病菌的檢測試劑盒及檢測方法的建立(1)引物的設計、合成與試劑盒的組裝，如表l所述表1菌株上、下游引物序列(5'-3')擴增產物(bp)香港海鵑型菌GAAAGGGAGCGGTAACACAGTGGCGGATTCCACTCCCATG403粘質沙雷氏菌GGAAGCGACTGCATTATTACCATTGGTGGTGGCGATCACTT332氣味沙雷氏菌TCGAGCGGTAGCACAGGACAACGTATTAAGCTATTG412類志賀鄰單胞菌CTTGTGATTCGTAATGGCTGACCATAACAACGTCAGCAACTA284梅氏弧菌AGCATGACCAAGCTGCTCTTGCAAATATCCGACAGCACCATT260在此基礎上，設計用于PCR-DHPLC檢測的試劑盒該試劑盒中包括5種檢測溶液，分別針對香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌、梅氏弧菌進行檢測，依次標注為檢測溶液A、B、C、D、E，其中檢測溶液A中含10mMTris《1、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/^iL)及表1中所述的香港海鷗型菌引物對10)iM;檢測溶液B中含10mMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/l4j及表1中所述的粘質沙雷氏菌引物對10檢測溶液C中含lOmMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/nL)及表1中所述的氣味沙雷氏菌引物對10^M;檢測溶液D中含10mMTris.Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/pL)及表1中所述的類志賀鄰單胞菌引物對10^M;檢測溶液E中含10mMTris'Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCfP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U爾L)及表1中所述的梅氏弧菌引物對10)aM;(2)PCR-DHPLC檢測方法的建立本檢測方法使用本實施例建立的PCR-DHPLC檢測的試劑盒，包括如下步10驟①待檢樣品的制備a.食品樣品無菌方法稱取25克樣品于225mL胰蛋白胨大豆肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。b.標準菌株弧菌菌株挑取單個菌落于3%NaCl營養肉湯中培養1824h;其他菌株于普通營養肉湯中培養1824h，使用細菌基因組提取試劑盒提取其基閔組DNA，制取PCR模板。標記，直接作為PCR模板或-2(TC保存。②PCR擴增取lpl待測樣品DNA溶液，根據檢測目標菌加入相應的檢測溶液10^和14(il滅菌超純水，總體積25pl;將以十.各組分加入至0.2mLPCR反應管中，混勻，5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR循環預變性94°C，3min;進入循環94r變性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min。③DHPLC分析色譜柱PS-DVB&C18DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3柱溫50°C;流動相(體積比)O.Omin，48.0%緩沖溶液A，52.0%緩沖溶液B;0.5min，42.9%緩沖溶液A，57.1%緩沖溶液B;2.4min，40.1%緩沖溶液A，59.9%緩沖溶液B;4.3min，38.2%緩沖溶液A，61.8%緩沖溶液B;6.1min，36.9%緩沖溶液A，63.1%緩沖溶液B;8.0min，36.0%緩沖溶液A，64.0%緩沖溶液B;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5jjL。實施例2、檢測方法特異性試驗按照實施例1所建立的分析條件，分別對35種微生物進行PCR-DHPLC特異性試驗。(1)梅氏流弧菌的特異性試驗結果選取梅氏弧菌的近源種菌株28株和非近源種菌株24株，按照實施例1所建立的方法和條件進行PCR-DHPLC檢測。所選取的近源種菌株包括副溶血性弧菌、霍亂弧菌Ol群、霍亂弧菌0139群、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、河流弧菌、解蛋白弧菌、嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌等菌株的標準株及分離株共28株。所選取的非近源種菌株包括單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶血性鏈球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗勞地檸檬酸桿菌、臘樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、綿羊李斯特氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌。試驗結果顯示只有梅氏弧菌出現陽性吸收峰。附圖1顯示了部分菌種的檢測結果圖譜，其中保留時間為3.6min的吸收峰為梅氏弧菌的陽性吸收峰。為了證實該陽性吸收峰為梅氏弧菌基因的片段，我們將DHPLC的陽性吸收峰產物回收后進行了克隆和測序，結果與梅氏弧菌DNA比對，證明了DHPLC陽性吸收峰為梅氏弧菌基因的片段。上述結果說明，實施例1所建立的檢測試劑盒及檢測方法對梅氏弧菌有很高的檢測特異性。(2)粘質沙雷氏菌的特異性試驗結果取粘質沙雷氏菌等41株參考菌株的DNA模板庫，按照實施例1所述的方法和條件進行PCR-DHPLC檢測。所選取的菌株包括粘質沙雷氏菌、氣質沙雷氏菌、液質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌，嗜水氣單胞菌，熒光假單胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌Ol群、霍亂弧菌0139群、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、解蛋白弧菌、類志賀鄰單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶血性鏈球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗勞地檸檬酸桿菌、臘樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、綿羊李斯特氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌。試驗結果顯示只有粘質沙雷氏菌出現陽性吸收峰，而非粘質沙雷氏菌檢測結果均為陰性。附圖2顯示了部分菌種的檢測結果圖譜，其中粘質沙雷氏菌的吸收峰如線1和線2所示，而與粘質沙雷氏菌近緣的氣質沙雷氏菌則無陽性吸收峰，如線3所示。保留時間為4.8min的吸收峰為粘質沙雷氏菌的陽性吸收峰。上述結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測方法中對粘質沙雷氏菌有很高的檢測特異性。(3)氣質沙雷氏菌的特異性試驗結果取氣質沙雷氏菌等41株參考菌株的DNA模板庫，按照實施例1所述的方法和條件進行PCR-DHPLC檢測。所選取的菌株包括氣質沙雷氏菌、粘質沙雷氏菌、液質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌，嗜水氣單胞菌，熒光假單胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌Ol群、霍亂弧菌0139群、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、解蛋白弧菌、類志賀鄰單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶血性鏈球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗勞地檸檬酸桿菌、臘樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、綿羊李斯特氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌。試驗結果顯示只有氣質沙雷氏菌出現陽性吸收峰，而非氣質沙雷氏菌檢測結果均為陰性。附圖3顯示了部分菌種的檢測結果圖譜，其中氣質沙雷氏菌的吸收峰如線1和線2所示。保留時間為4.9min的吸收峰為氣質沙雷氏菌的陽性吸收峰。上述結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測方法中對氣質沙雷氏菌有很高的檢測特異性。(4)香港海鷗型菌的特異性試驗結果取香港海鴟型菌等43株參考菌株的DNA模板庫，按照實施例1所述的方法和條件進行PCR-DHPLC檢測。所選取的菌株包括香港海鷗型菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、大腸埃希氏菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶血性鏈球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗勞地檸檬酸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、臘樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、綿羊李斯特氏菌、氣質沙雷氏菌、粘質沙雷氏菌、液質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌，嗜水氣單胞菌，熒光假單胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌Ol群、霍亂弧菌0139群、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、解蛋白弧菌、類志賀鄰單胞菌。試驗結果顯示只有香港海鷗型菌出現陽性吸收峰，而非香港海鷗型菌檢測結果均為陰性。附圖4顯示了部分菌種的檢測結果圖譜，其中保留時間為4.5min的吸收峰為香港海鴟型菌的陽性吸收峰。上述結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測方法中對香港海鷗型菌有很高的檢測特異性。(5)類志賀鄰單胞菌的特異性試驗結果取類志賀鄰單胞菌等41株參考菌株的DNA模板庫，按照實施例1所述的方法和條件進行PCR-DHPLC檢測。所選取的菌株包括類志賀鄰單胞菌、嗜水氣單胞菌，氣質沙雷氏菌、粘質沙雷氏菌、液質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌，熒光假單胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌Ol群、霍亂弧菌0139群、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、解蛋白弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、溶血性鏈球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗勞地檸檬酸桿菌、臘樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、綿羊李斯特氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌。試驗結果顯示只有類志賀鄰單胞菌出現陽性吸收峰，而非類志賀鄰單胞菌檢測結果均為陰性。附圖5顯示了類志賀鄰單胞菌的檢測結果圖譜，其中保留時間為3.3min的吸收峰為類志賀鄰單胞菌的陽性吸收峰。上述結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測方法中對類志賀鄰單胞菌有很高的檢測特異性。實施例3、檢測靈敏度試驗(1)梅氏弧菌檢測靈敏度試驗取梅氏弧菌標準菌株36'C培養24h,采用以平板計數方式為對比的靈敏度試驗方法，對各稀釋梯度分別提取制備模板DNA進行PCR-DHPLC檢測，結果見表2所示。計數為7600CFU/mL、790CFU/mL和76CFU/mL的梅氏弧菌均檢測到了陽性吸收峰，而5CFU/mL濃度則未檢測到陽性吸收峰。試驗結果表明，本研究所建立的方法可檢出梅氏弧菌標準菌株的10—6濃度梯度，即檢測靈敏度可達到76CFU/mL。表2稀釋梯度a平板計數結果b(CFU/mL)PCR-DHPLC檢測結果第l梯度oo+第2梯度oo+第3梯度oo+第4梯度7600+第5梯度790+第6梯度76+第7梯度5'_a:7個梯度之間的稀釋倍數為IO倍;b:平板計數結果為兩個平行平板計數結果的平均值。(2)粘質沙雷氏菌檢測靈敏度試驗取粘質沙雷氏菌標準菌株36'C培養24h，采用以平板計數方式為對比的靈敏度試驗方法，對各稀釋梯度分別提取制備模板DNA進行PCR-DHPLC檢測，結果見表3所示。計數為840CFU/mL、84CFU/mL的粘質沙雷氏菌均檢測到了陽性吸收峰，而10CFU/mL濃度則未檢測到陽性吸收峰。試驗結果表明，本研究所建立的方法可檢出粘質沙雷氏菌標準菌株的10-6濃度梯度，即檢測靈敏度可達到80CFU/mL。表315稀釋梯度a平板計數結果b(CFU/mL)PCR-DHPLC檢測結果第l梯度oo+第2梯度oo+第3梯度oo+第4梯度oo+第5梯度840+第6梯度80+第7梯度10—a:7個梯度之間的稀釋倍數為IO倍;b:平板計數結果為兩個平行平板計數結果的平均值。(3)氣質沙雷氏菌檢測靈敏度試驗取氣質沙雷氏菌標準菌株36E培養24h，采用以平板計數方式為對比的靈敏度試驗方法，對各稀釋梯度分別提取制備模板DNA進行PCR-DHPLC檢測，結果見表4所示，計數為2400CFU/mL和210CFU/mL的氣質沙雷氏菌均檢測到了陽性吸收峰，而25CFU/mL濃度則未檢測到陽性吸收峰。試驗結果表明，本研究所建立的方法可檢出氣質沙雷氏菌標準菌株的10-6濃度梯度，即檢測靈敏度可達到210CFU/mL。表4稀釋梯度a平板計數結果(CFU/mL)PCR-DHPLC檢測結果第l梯度oo+第2梯度oo+第3梯度oo+第4梯度31000+第5梯度2400+第6梯度210+第7梯度25-a:7個梯度之間的稀釋倍數為IO倍;b:平板計數結果為兩個平行平板計數結果的平均值。(4)香港海鴟型菌檢測靈敏度試驗取香港海鷗型菌標準菌株36。C培養24h，采用以平板計數方式為對比的靈敏度試驗方法，對各稀釋梯度分別提取制備模板DNA進行PCR-DHPLC檢測，結果見表5所示，計數為650CFU/mL和65CFU/mL的香港海區鳥型菌均檢測到了陽性吸收峰，而10CFU/mL濃度則未檢測到陽性吸收峰。試驗結果表明，本研究所建立的方法可檢出香港海鷗型菌標準菌株的10—6濃度梯度，即檢測靈敏度可達到65CFU/mL。表5稀釋梯度a平板計數結果b(CFU/mL)PCR-DHPLC檢測結果第l梯度oo+第2梯度oo+第3梯度oo+第4梯度oo+第5梯度650+第6梯度65十第7梯度10—a:7個梯度之間的稀釋倍數為10倍;b:平板計數結果為兩個平行平板計數結果的平均值。(5)類志賀鄰單胞菌檢測靈敏度試驗取類志賀鄰單胞菌標準菌株36。C培養24h，采用以平板計數方式為對比的靈敏度試驗方法，對各稀釋梯度分別提取制備模板DNA進行PCR-DHPLC檢測，結果見表6所示，計數為3700CFU/mL和370CFU/mL的類志賀鄰單胞菌均檢測到了陽性吸收峰，而45CFU/mL濃度則未檢測到陽性吸收峰。試驗結果表明，本研究所建立的方法可檢出類志賀鄰單胞菌標準菌株的l(T6濃度梯度，即檢測靈敏度可達到370CFU/mL。表6稀釋梯度a平板計數結果b(CFU/mL)PCR-DHPLC檢測結果第l梯度oo+第2梯度oo+第3梯度oo+第4梯度oo+第5梯度3700第6梯度370+第7梯度45一a:7個梯度之間的稀釋倍數為IO倍;b:平板計數結果為兩個平行平板計數結果的平均值。實施例4、檢測試劑盒及檢測方法在實際樣品檢測中應用試驗(1)在梅氏弧菌實際檢測中的應用本實施例從市售的蝶魚、進口的魷魚中分離出的2株可疑梅氏弧菌，該2株菌的主要生理生化特征為革蘭氏染色陰性，TCBS上生長呈黃色，在0。/。NaCl及10。/。NaCl胨水中均不生長，在3%、6%、8%鹽胨水中生長良好。氧化酶陰性，能發酵葡萄糖、甘露糖，甘露醇產酸不產氣；B半乳糖苷、鼠李糖陰性；不分解乳糖、水楊苷、肌醇；靛基質、賴氨酸脫羧酶陽性；硝酸鹽還原陰性；尿素陰性，有動力。上述反應都符合梅氏弧菌的生化特性。經實施例1的PCR-DHPLC檢測均為陽性。為了證實該分離株的陽性吸收峰確實為梅氏弧菌infC基因的片段，我們將其中的一個DHPLC陽性吸收峰產物回收后進行了克隆和測序(編號080712.1)，結果與Genbank中梅氏弧菌(Genbank編號AY014398.2)DNA序列(基因位點11501409)比對。結果兩者序列的符合率為100%，證明該分離株的DHPLC陽性吸收峰為梅氏弧菌infC基因的片段。(2)在香港海鷗型菌實際檢測中的應用取1株從實際檢測樣品中分離出的所留存的香港海鷗型菌分離菌株的DNA進行PCR-DHPLC的驗證試驗，結果該1株香港海鵑型菌分離株均經DHPLC檢測到了擴增吸收峰，且出峰時伺和峰型重現性較好，以沙門氏菌為陰性對照的檢測結果則為陰性。結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測香港海鵑型菌的方法，具有很好的符合性和結果重現性。(3)在粘質沙雷氏菌實際檢測中的應用取3株從實際檢測樣品中分離出的所留存的粘質沙雷氏菌分離菌株的DNA進行PCR-DHPLC的驗證試驗，結果該3株粘質沙雷氏菌分離株均經DHPLC檢測到了擴增吸收峰，且出峰時間和峰型重現性較好，以沙門氏菌為陰性對照的檢測結果則為陰性。結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測乳酸桿菌的方法，具有很好的符合性和結果重現性。(4)在氣味沙雷氏菌實際檢測中的應用取2株從實際檢測樣品中分離出的所留存的氣味沙雷氏菌分離菌株的DNA進行PCR-DHPLC的驗證試驗，結果該2株氣味沙雷氏菌分離株均經DHPLC檢測到了擴增吸收峰，且出峰時間和峰型重現性較好，以沙門氏菌為陰性對照的檢測結果則為陰性。結果表明實施例1所建立的PCR-DHPLC檢測乳酸桿菌的方法，具有很好的符合性和結果重現性。(5)在類志賀鄰單胞菌實際檢測中的應用取1株從實際檢測樣品中分離出的所留存的類志賀鄰單胞菌分離菌株的DNA進行PCR-DHPLC的驗證試驗，結果該1株類志賀鄰單胞菌分離株均經DHPLC檢測到了擴增吸收峰，且出峰時間和峰型重現性較好，以沙門氏菌為陰性對照的檢測結果則為陰性。結果表明本研究建立的PCR-DHPLC檢測類志賀鄰單胞菌的方法，具有很好的符合性和結果重現性。權利要求1、食品中5種新出現致病菌的檢測試劑盒，其特征在于包括5種檢測溶液，這5種檢測溶液中均含有10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM及TaqDNA聚合酶5U/μL；檢測溶液A中還含有香港海鷗型菌引物對10μM；檢測溶液B中還含有粘質沙雷氏菌引物對10μM；檢測溶液C中還含有氣味沙雷氏菌引物對10μM；檢測溶液D中還含有類志賀鄰單胞菌引物對10μM；檢測溶液E中還含有梅氏弧菌引物對10μM；其中，各個菌株的引物對序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="171"></tables>2、食品中5種新出現致病菌的檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟①PCR反應取lpl待測樣品DNA溶液，根據檢測目標菌加入相應的檢測溶液10|il和14pl滅菌超純水，總體積25^1;將以上各組分加入至0.2mLPCR反應管中，混勻，5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR循環預變性94°C，3min;進入循環94。C變性60s，60。C退火60s，72。C延伸60s，35次循環；終止延伸72°C，7min;②將PCR擴增產物進行DHPLC分析色譜柱PS-DVB&CI8DNASep色譜柱，4.6mmx50mm，粒度3|am;<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>;其中，緩沖溶液A是濃度O.lmM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1MTEAA水溶液與乙腈按體積比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;檢測器熒光檢測器，光源150WXenon燈；激發譜帶寬15nm;發射譜帶寬15.3nm;檢測靈敏度在波長350nm積分2s;上樣量PCR產物5pL。全文摘要一種用于食品中5種新出現致病菌的檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒包括5種檢測溶液，其中均含有10mmTris·Cl、50mmKCl、25mmMgCl₂、dNTP各2.5mm及TaqDNA聚合酶5U/μl；此外，檢測溶液A、B、C、D或E中還分別含有香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌或梅氏弧菌特異性引物對各10μm。使用本發明的檢測試劑盒及檢測方法，可以高靈敏度地檢測食品中的香港海鷗型菌、粘質沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、類志賀鄰單胞菌及梅氏弧菌，并且檢側耗時短，操作簡捷，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求。文檔編號C12Q1/68GK101659992SQ200910010799公開日2010年3月3日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者曹際娟申請人:曹際娟