專利名稱：一種通用的抗體靶向非病毒型基因導入系統的制作方法
專利說明一種通用的抗體靶向非病毒型基因導入系統 本發明涉及一種通用的抗體靶向非病毒型基因導入系統。基因導入系統或方法可分成兩類病毒型基因導入系統，以逆轉錄病毒，腺病毒，腺相關病毒為載體；非病毒型基因導入，如DNA直接注射，基因槍，磷酸鈣共沉淀法，脂質體介導法。由于病毒型基因導入系統存在許多嚴重不足，如病毒轉染有可能激活癌基因等，故非病毒型基因導入系統是目前研究的一個熱點，然而所有這些方法均存在一個重大缺陷，這也是目前基因導入和基因治療亟待解決的重大問題，即基因導入的細胞靶向性或特異性。以抗體為配體的受體介導的基因導入方法能克服這些方法不足，其原理將能識別細胞膜受體的抗體(也可認為是一種配體)先與帶強大正電荷的多聚陽離子多肽(常用為多聚賴氨酸，PLL)共價交聯，形成抗體-多聚陽離子多肽交聯物，再與帶負電荷的核酸片段非共價結合形成抗體靶向的非病毒型基因導入系統，然后通過抗體(配體)與細胞表面的受體結合，借助受體內化機制從而將目的基因片段靶向導入細胞中。以抗體為配體的靶向非病毒基因導入系統較其它配體有其獨特的優勢可以針對任何受體制備其相應抗體；抗體易純化；靶向性較好。目前已有多種以抗體為配體通過受體介導的基因導入研究的報道，且獲得了較好結果，如抗CD3抗體，抗EGF抗體靶向基因的轉染，然而這些抗體靶向的非病毒型基因導入系統的構建需要抗體與多聚陽離子多肽的共價交聯，這對于抗體的活性有很大影響，因抗體較其它蛋白易變性失活，另外共價交聯過程需用較多的抗體，而抗體的成本較高，故有必要尋找避免抗體化學交聯的方法。本發明為一種抗體和核酸片段的連接物，能將IgG抗體與核酸片段(包括質粒或寡核苷酸)非共價鍵結合，組裝成抗體靶向非病毒型基因導入系統用于核酸片段的靶向導入，本發明由金黃色葡萄球菌A蛋白(葡萄球菌A蛋白，SPA或A蛋白)與多聚賴氨酸(Poly-L-Lysin，PLL)共價結合形成A蛋白-多聚賴氨酸交聯物(SPA-PLL)，將該SPA-PLL交聯物與IgG抗體和質粒或寡核苷酸經混合組裝成細胞靶向結合的基因導入系統用于基因轉染，該基因導入系統為非病毒導入系統。
由于IgG抗體能與一種小分子蛋白SPA以高親和力，非共價迅速結合，我們可以先將PLL與SPA共價連接形成SPA-PLL交聯物，再將IgG抗體通過SPA的非共價結合從而與PLL連結起來，最后與目的基因片段結合組裝抗體靶向的非病毒型基因導入系統(見下圖解)，這樣可避免抗體的化學交聯。換句話說，該SPA-PLL交聯物有兩個“臂”，一只與預導入的基因片段非共價連接，另一只與IgG抗體非共價連接，也即通過SPA-PLL交聯物將IgG抗體和基因片段非共價結合在一起，進行基因片段的細胞靶向性導入。這種靶向基因導入系統有多種特性及優越性1、抗體以非共價方式與預導入的基因片段結合，故對抗體的靶向活性無損傷2、因SPA可與多種IgG抗體以高親和力，非共價迅速結合，故只要制備出SPA-PLL，就可以將任何IgG抗體與任何預導入的基因片段結合構建抗體靶向的非病毒基因導入系統進行基因導入，故該導入系統具有通用性。
3、相對于抗體，SPA的成本很低，且SPA-PLL穩定性很好，易保存，易標準化。

圖1為SPA-PLL交聯物的洗脫曲線圖。
圖2為SPA-PLL交聯物在200～400nm波長范圍內吸收光度圖。
圖3為非還原型及還原型SPA-PLL交聯物的SDS-PAGE電泳圖譜。
圖4為酶聯法檢測包被的SPA-PLL交聯物(10μg/ml)與多種IgG的結合二抗為HRP標記的山羊抗兔、山羊抗人、山羊抗小鼠或山羊抗牛IgG圖。
圖5為SPA-PLL交聯物結合pEGFP-C1質粒的凝膠移動阻滯實驗圖。
圖6為SPA-PLL交聯物結合骨調素反義寡核苷酸的凝膠移動阻滯實驗圖。
圖7為CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物處理NRK52E細胞40h后，pEGFP-C1質粒表達綠色熒光蛋白從而在紫外線激發下發出熒光圖。
圖8為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物與NRK52E細胞結合的熒光顯微鏡圖(×200)。
圖9為CD44抗體靶向的反義、順義或錯義寡核苷酸復合物影響NRK52E細胞骨調素mRNA表達的斑點雜交圖。
ADot blot圖。B相對積分密度值分析。
圖10為不同形式的骨調素AS-ODN影響NRK52E細胞OPNmRNA表達的斑點雜交(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示細胞經CD44抗體預先處理60 min后再經CD44/SPA-PLL/AS-ODN處理)圖。ADot blot圖。B相對積分密度值分析。
圖11為AS-ODN濃度為30μmol/L的CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物對NRK52E細胞在膠原凝膠表面粘附能力的抑制作用(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示細胞經CD44抗體預先處理60min后再經CD44/SPA-PLL/AS-ODN處理)圖。
圖12為不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物和SPA-PLL交聯物等對NRK52E細胞存活率的影響圖。
圖13為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物和SPA-PLL交聯物作用不同時間對NRK52E細胞存活率的影響圖。
圖14為不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物和SPA-PLL交聯物等對SMMC-7721細胞存活率的影響圖。
圖15為CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物和SPA-PLL交聯物作用不同時間對SMMC-7721細胞存活率的影響圖。下面對本發明作較詳盡的描述。內容包括SPA-PLL交聯物的構建；SPA-PLL交聯物的一些理化特性及其與多種IgG抗體，基因片段的結合特性(體現SPA-PLL交聯物的核心作用和通用性)；抗體靶向非病毒型基因導入系統的組裝及其用于細胞靶向轉染的舉例說明；SPA-PLL交聯物及其基因導入系統的毒性作用。
一、PA-PLL交聯物的制備及純化。
1、主要材料(1)蛋白A(SPA，MW20000 D)，Sigma公司產品；(2)多聚賴氨酸(PLL，MW25700D)，Sigma公司產品；(3)異型雙功能交聯劑SPDP(3-[2-吡啶乙基]丙酸-N-琥珀酰亞胺酯，N-succinimidy[3-(2-pyridyldithio)proponate])，Sigma公司產品；(4)二硫蘇糖醇(DTT)，Roche公司產品；(5)SephadexG50分子篩(fine)，Pharmacia公司產品；(6)透析袋，Serva公司產品。
2、主要方法(1)SPA與PLL的化學交聯1)PLL-PDP，SPA-PDP的制備取10mg PLL或SPA用1ml 0.1M的PBS(pH7.5)溶解，置于透析袋中于4℃對0.1M的PBS(pH7.5)透析過夜，取出PLL或SPA按PLL或SPA與SPDP的1∶2摩爾比加入SPDP溶液(無水乙醇溶解，濃度20mM)50ul，緩慢攪拌加入，于室溫下作用60min，再次置于透析袋中于4℃對0.1M的PBS(pH7.5)透析過夜，其間換透析液使其充分透析去除未反應的SPDP等小分子物質，獲得純化PLL-PDP或SPA-PDP，于4℃保存。(2)PLL-PDP還原生成PLL-SH將10mg PLL-PDP置于透析袋中于4℃對0.1M醋酸緩沖液(pH4.5)透析過夜，使PLL-PDP的pH值為4.5，取出PLL-PDP加入1M DTT，使DTT終濃度為50mM，于室溫下作用30min后轉入透析袋中于4℃對0.1M的PBS(pH7.5)透析過夜，獲得純化的PLL-SH。透析期間充入氮氣以避免PLL-SH氧化！(3)PLL-SH與SPA-PDP反應生成SPA-PLL交聯物將等量PLL-SH與SPA-PDP混合于室溫下攪拌22h(期間充入氮氣以避免PLL-SH氧化)，獲得含有SPA-PLL交聯物的混合物。
(2)SPA-PLL交聯物的純化常規方法處理SephadexG50，裝層析柱，按下列條件進行層析，收集合并第一峰液體即為純化SPA-PLL交聯物，將合并的液體置于透析袋中用聚乙二醇濃縮至適當體積，過濾除菌，于4℃保存。層析條件檢測波長226nm；洗脫液0.1M的PBS(pH7.5)；柱長62cm；柱直徑10mm；柱體積50ml；進樣量0.9ml(＜2％)；流速≤0.5ml/min；1.5ml/管。
3結果SPA-PDP與PLL-SH反應后的混合物中除SPA-PLL交聯物外，還有未反應的SPA-PDP與PLL-SH及其它反應產物，故需將SPA-PLL交聯物分離純化出來。我們采用SephadexG50分子篩分離洗脫，獲得3個蛋白峰(參閱圖1所示)，首峰應是SPA-PLL交聯物。
二，SPA-PLL交聯物主要的理化性質1、主要材料(1)30％丙烯酰胺/0.8％亞甲雙丙烯酰胺，4×Tris·Cl/SDS(pH8.8)，4×Tris·Cl/SDS(pH6.8)，自配；(2)過硫酸銨(AP)，TEMED(四甲基乙烯基二胺)，Sigma公司產品；(3)3×SDS蛋白加樣緩沖液，1×SDS電泳緩沖液，自配；(4)考馬斯亮藍R-250(Coomssia BrilliantR-250)，Sigma公司產品；(5)DTT，同前；(6)BCA-100 proteinQuantitation Kit，上海博彩生物科技有限公司產品。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯物的波長掃描將SPA-PLL交聯物的PBS(0.1M，pH7.5)溶液于200～400nm波長范圍內測定吸收光度(A值)，觀察其最大吸收光度。
(2)PA-PLL交聯物的濃度測定采用BCA法測定。按BCA-100protein Quantitation Kit說明書進行。大致過程將SolutinA和SolutionB按比例混合成Mix(A+B)液；將標準的牛血清白蛋白(BSA)用0.1M的PBS(pH7.5)稀釋成以下不同濃度(μg/ml)50，100，200，400，500；在BSA溶液或SPA-PLL樣品中加入Mix(A+B)液，混勻后于37℃保溫30min，待液體冷至室溫后于波長562nm處測吸收光度(A值)(以0.1M的PBS pH7.5調零)，繪制BSA的標準曲線，從標準曲線計算出SPA-PLL交聯物的濃度。
(3)SDS-PAGE電泳按照精編分子生物學實驗指南方法進行。大致過程組裝凝膠模具，先配制10％的分離膠加入模具中，待膠凝固后在其表面加入5％的層析膠同時放入樣品梳以形成樣品槽，待膠凝固后上樣，于1×SDS電泳緩沖液中電泳(100V，恒壓)，待溴酚藍指示劑接近分離膠底部停止電泳；將凝膠置于考馬斯亮藍R-250染色液中室溫振蕩3～4h后，在脫色液中脫色，觀察結果。樣品的處理采用非還原型和還原型方法非還原型法即樣品與非還原型的3×SDS蛋白加樣緩沖液混合即可；還原型法即樣品先經過量的DTT作用10min，再與非還原型的3×SDS蛋白加樣緩沖液混合。
3、結果(1)SPA-PLL交聯物的最大吸收波長將SPA-PLL交聯物在200～400nm波長范圍內測定吸收光度(A)，在210nm處有最大光吸收值，這是因為含有大量肽鍵所致(圖2)，并且在280nm處有一小吸收峰，可能是SPA所致。
(2)SPA-PLL交聯物的濃度測定采用BCA法建立起蛋白的濃度測定的直線回歸方程Y＝0.009783+0.000615x(r＝0.9995)，于562nm波長處比色可知SPA-PLL交聯物的平均A562為0.182，經計算可得SPA-PLL交聯物的濃度為280μg/ml(3)SPA-PLL交聯物的純度未經還原劑DTT處理的SPA-PLL交聯物，SDS PAGE電泳后染色無條帶出現(圖3)，說明SPA-PLL交聯物純度較高，無游離的SPA等其它組份存在；SPA-PLL交聯物經DTT處理后電泳染色，可見在分子量約20000處出現一蛋白條帶(欄4)，該蛋白應是SPA，說明SPA是以-S-S-鍵結合在SPA-PLL交聯物中，DTT的處理能使SPA被還原出來。游離SPA是否經DTT還原處理，電泳后染色均在分子量約20000處出現條帶，而游離PLL是否經DTT還原處理則電泳染色后均無條帶出現(參閱圖3所示1、單抗Hab18+DTT2、蛋白分子量marker.3、SPA-PLL交聯物.4、SPA-PLL交聯物+DTT.5、游離PLL+DTT.6，游離SPA+DTT)。游離PLL及未經DTT處理的SPA-PLL交聯物經電泳后染色無條帶出現，這可能由于PLL及SPA-PLL交聯物帶強大正電荷，在從負極向正極的電泳過程中未能泳動而仍停留在加樣孔中所致。
結論所制備的SPA-PLL交聯物純度較高，確實由SPA和PLL構成。
三、PA-PLL交聯物的結合性質所制備的SPA-PLL交聯物應是一種抗體和核酸片段的連接物，也即既能良好結合多種IgG抗體，又能良好結合多種核酸片段或基因片斷，從而組裝成抗體靶向非病毒型基因導入系統用于細胞的特異性轉染。
(一)SPA-PLL交聯物結合IgG能力(SPA活性)
1、主要材料(1)SPA，PLL同前；(2)酶標條板NUNC公司產品；(3)包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)，酶聯洗滌液(PBST即PBS-Tween20)，自配；(4)正常山羊血清，武漢博士德公司產品；(5)多種IgG兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，武漢博士德公司產品；正常兔血清IgG，正常山羊血清IgG，正常人血清IgG，正常小牛血清IgG，均為華美生物工程公司產品；(6)小鼠抗人肝癌單抗HAb18，第四軍醫大學病理教研室產品；(7)HRP(辣根過氧化物酶)標記的兔抗山羊IgG，HRP標記的山羊抗兔IgG，HRP標記的山羊抗人IgG，HRP標記的山羊抗牛IgG，HRP標記的山羊抗小鼠IgG，均為華美生物工程公司產品；(8)酶聯底物(鄰苯二胺，OPD)，Sigma公司產品。(9)Dynex-24100，酶標儀，美國生產。
2、主要方法(1)樣品的包被按常規酶聯包被方法進行。大致過程用包被緩沖液將SPA-PLL交聯物或PLL，SPA稀釋成終濃度10μg/ml，將稀釋的樣品加入酶聯板中(100μl/孔)于4℃過夜即可。
(2)酶聯法檢測包被的SPA-PLL交聯物與多種IgG的結合按常規酶聯方法進行。大致過程取已包被的酶聯板去上清，加入酶聯洗滌液洗1次；用正常山羊血清(200μl/孔)于37℃封閉60min；同上洗滌3次，加入各自的IgG(100μl/孔)，于37℃孵育45min；同上洗滌3次，加入各自對應的HRP標記的山羊抗IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗滌液洗滌4次后盡量摔盡孔中余液，加入酶聯底物液(100μl/孔)，避光顯色10～30min，加入終止液(2N硫酸)終止顯色反應，于490nm波長處測吸收光度(A值)，以比值(樣品孔A490/空白對照孔A490)大于或等于2.0為陽性。
(3)中和抑制實驗按常規中和抑制酶聯方法進行。大致過程先將1∶1000稀釋的HRP標記的兔抗小鼠IgG與不同濃度的SPA-PLL交聯物混合于4℃過夜；取SPA包被的酶聯板去上清，同上封閉，洗滌，加入以上混合物，同上孵育，洗滌，加入酶聯底物液顯色，測定A490，觀察結果。
3、結果用SPA-PLL交聯物或SPA或PLL包被酶聯板，兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，正常兔血清IgG，正常人血清IgG及小鼠單抗(HAb18)均能與包被的SPA-PLL交聯物或SPA結合，且具有IgG濃度依賴性，不與包被的PLL結合；而正常山羊IgG，牛IgG與包被的SPA-PLL結合陰性(參閱圖4所示，表1)，表現為其A490僅為0.3左右，與培養基對照孔(均值0.28)接近，提示SPA-PLL交聯物可與多種IgG抗體良好結合，但與山羊，牛等一些動物來源的IgG抗體不結合；用SPA包被酶聯板，SPA-PLL交聯物預先處理能抑制HRP標記的兔抗小鼠IgG與包被的SPA的結合，且具有SPA-PLL濃度依賴性(表2)，提示SPA-PLL交聯物與IgG結合具有SPA特異性。這些結果表明，SPA-PLL交聯物能良好地結合多種IgG抗體，保持較好的SPA活性，交聯過程對SPA的結合特性無明顯影響。
表1酶聯法檢測HRP標記的兔IgG與包被的SPA-PLL交聯物等結合包被物 A492(X±SD)SPA-PLL交聯物1.022±0.15游離PLL 0.117±0.01游離SPA 1.607±0.22表2酶聯法檢測SPA-PLL交聯物抑制HRP標記的兔IgG與包被SPA的結合
SPA-PLL交聯物(μg/m1) A492(X±SD)0 3.287±0.223501.274±0.156100 0.579±0.122200 0.224±0.116結論SPA-PLL交聯物具有結合多種IgG抗體的活性(二)SPA-PLL交聯物結合核酸片斷的能力(PLL活性)質粒和寡核苷酸是常用于基因轉染的核酸片斷，SPA-PLL交聯物均能良好地結合質粒或寡核苷酸SPA-PLL交聯物與質粒結合1、主要材料(1)綠色熒光蛋白質粒(pEGFP-C1)，按常規細菌轉化實驗將pEGFP-C1質粒轉化感受態TG1細菌，篩選，擴增質粒，采用Qiagenplasmid mega kit質粒提取純化試劑盒提取pEGFP-C1質粒，紫外分光光度法測定質粒DNA含量；(2)HEPES平衡鹽溶液(HEPES BanlancedSolution，HBS)，自配；(3)電泳緩沖液(0.5×TBE)，自配；(4)DNA上樣緩沖液(6×)，華美生物工程公司產品；(5)DNA分子量Marker(221～4058bp)，上海博彩生物科技有限公司產品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物制備將pEGFP-C1質粒用HEPES平衡鹽溶液稀釋成濃度0.125μg/μl，取5μl與不同濃度等體積SPA-PLL交聯物混合，于室溫下作用60min即制備成SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物；(2)質粒DNA凝膠阻滯實驗參照文獻方法進行。具體步驟制備1％的瓊脂糖凝膠，將凝膠置于電泳緩沖液中，在樣品孔中加入SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物，DNA分子量Marker等，于70V恒壓下電泳，待溴酚藍指示劑遷移至離加樣孔4cm左右時停止電泳，于320nm紫外線處觀察，凝膠成像系統中成像。
3、結果pEGFP-C1質粒分子量約4.7kb左右，經瓊脂糖凝膠電泳時有多種條帶出現，這是由于pEGFP-C1質粒存在多種構型所致；當280μg/ml，140μg/ml的SPA-PLL交聯物與等體積pEGFP-C1質粒混合后電泳，無pEGFP-C1質粒條帶出現；當70μg/ml的SPA-PLL交聯物與等體積pEGFP-C1質粒混合后電泳，有部分質粒條帶出現；200μg/ml的游離PLL與等體積pEGFP-C1質粒混合后電泳，無pEGFP-C1質粒條帶出現；1000μg/ml游離SPA與等體積pEGFP-C1質粒混合后電泳，有pEGFP-C1質粒條帶出現[參閱圖5所示1DNAmarker；2游離pEGFP質粒；3pEGFP質粒+SPA-PLL交聯物(280μg/ml)；4pEGFP質粒+SPA-PLL交聯物(140μg/ml)；5pEGFP質粒+SPA-PLL交聯物(70μg/ml)；6pEGFP質粒+游離PLL(200μg/ml)；7pEGFP質粒+游離SPA(1000μg/ml)]。
這些結果表明，帶正電荷的SPA-PLL交聯物及游離PLL均能很好地中和帶負電荷的質粒的負電荷，形成電中性或帶正電荷的SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物，從而仍存在于加樣孔中不能在電場中的移動，且這種電荷中和作用具有SPA-PLL交聯物濃度依賴性，顯示SPA-PLL交聯物具有良好地結合質粒的能力，保持較好的PLL活性，交聯過程對PLL的結合特性無明顯影響。
結論SPA-PLL交聯物具有良好地結合質粒的能力SPA-PLL交聯物與寡核苷酸片段的結合1、主要材料(1)大鼠骨調素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，其堿基序列與OPN mRNA上游部分(含起始密碼)堿基互補，序列為5‘AAC CAC TGC CAG TCT CAT 3‘，所有堿基均經硫代修飾，由上海Sangon公司經亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量。(2)HEPES平衡鹽溶液，自配；(3)電泳緩沖液(1×TBE)，自配；(4)DNA上樣緩沖液(6×)，華美生物工程公司產品；(5)DNA分子量Marker(100～1500bp)，上海博彩生物科技有限公司產品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/AS-ODN復合物制備將AS-ODN用HEPES平衡鹽溶液稀釋成濃度0.58μg/μl，取5μl與不同濃度等體積SPA-PLL交聯物混合，于室溫下作用60min即制備成SPA-PLL/AS-ODN復合物；(2)制備2％的瓊脂糖凝膠，在樣品孔中加入SPA-PLL/AS-ODN復合物，DNA分子量Marker等，用1×TBE為電泳緩沖液，于70V恒壓下電泳15min，立即于320nm紫外線處觀察，凝膠成像系統中成像。
3、結果AS-ODN含18個核苷酸，分子量很小，在2％瓊脂糖凝膠電泳中泳動速度較快，且易擴散，故電泳時間應很短；SPA-PLL交聯物能抑制AS-ODN的泳動，且具有濃度依賴性，游離PLL(200μg/ml)及較高濃度(280μg/ml，140μg/ml)SPA-PLL交聯物能完全抑制AS-ODN的泳動[參閱圖6所示1DNA marker；2游離AS-ODN；3AS-ODN+PLL(200μg/ml)；4AS-ODN+SPA-PLL交聯物(280μg/ml)；5AS-ODN+SPA-PL交聯物L(140μg/ml)；6AS-ODN+SPA-PLL交聯物(70μg/ml)；7AS-ODN+SPA-PLL交聯物(35μg/ml)；8AS-ODN+SPA-PLL交聯物(17.5μg/ml)；7AS-ODN+SPA(1000μg/ml))]，而游離SPA無抑制作用，提示SPA-PLL交聯物具有良好地結合寡核苷酸片斷能力，該能力由PLL而非SPA賦予。
結論SPA-PLL交聯物具有良好地結合寡核苷酸片斷的能力四、抗體靶向非病毒型基因導入系統的組裝及應用舉例SPA-PLL交聯物顯示出既可良好地結合多種IgG又可良好結合質粒和寡核苷酸片段的特性即該復合物與IgG抗體和核酸片斷結合即可組裝成抗體靶向非病毒型基因導入系統，該組裝也即SPA-PLL交聯物與IgG抗體和預導入的基因的結合過程極其簡便，且為非共價結合，即將SPA-PLL交聯物與IgG抗體和預導入的基因混合，在室溫下靜置30～60分鐘即可。下面列舉實例說明幾種抗體靶向非病毒型基因導入系統的組裝及靶向轉染細胞情況。
大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞在細胞因子EGF作用下能表達CD44分子及骨調素(osteopontin，OPN)，將能識別NRK52E細胞表面受體CD44的抗體為配體，通過SPA-PLL交聯物的非共價結合，與綠色熒光蛋白質粒或骨調素反義寡核苷酸組裝抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1或CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)，期望該導入系統能特異性或靶向性將綠色熒光蛋白質粒或骨調素反義寡核苷酸導入大鼠腎小管上皮細胞中并使核酸片斷發揮作用。
(一)將綠色熒光蛋白質粒(pEGFP-C1)靶向導入表達CD44分子的大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞中CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質粒導入系統的組裝1、主要材料(1)HEPES平衡鹽溶液，自配；(2)綠色熒光蛋白質粒(pEGFP-C1)，本室純化；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，武漢博士德公司產品；(4)SPA-PLL交聯物，同前制備。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯物與pEGFP-C1質粒結合的適宜質量比的確定同上采用質粒DNA凝膠阻滯實驗，可得SPA-PLL交聯物與pEGFP-C1質粒適宜質量比1∶0.89。
(2)SPA-PLL交聯物與CD44抗體結合的適宜質量比的確定按常規中和抑制酶聯方法進行。大致過程一定濃度的兔抗大鼠CD44抗體(20μg/ml)與不同濃度的SPA-PLL交聯物混合于4℃過夜；取SPA包被的酶聯板去上清，同上節法封閉，洗滌，加入SPA-PLL/CD44抗體混合物，同上節孵育，洗滌，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗滌液洗滌4次后盡量摔盡孔中余液，加入酶聯底物液顯色，測定A490，按下式計算SPA-PLL交聯物抑制CD44抗體與包被SPA結合的抑制率。以達到最大抑制率時所需最小的SPA-PLL交聯物的量與CD44抗體的質量比即為SPA-PLL交聯物與抗體適宜質量比。
抑制率＝(1-實驗孔A490/對照孔A490)×100％(實驗孔指在固定濃度CD44抗體中混合0～200μg/ml濃度的SPA-PLL交聯物；對照孔指在固定濃度CD44抗體中混合PBS)。經計算可得SPA-PLL交聯物與CD44抗體結合的合適質量比1∶0.5。
(3)CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物即CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質粒導入系統的組裝將SPA-PLL交聯物，質粒pEGFP-C1分別用HEPES平衡鹽溶液溶解，按SPA-PLL交聯物與pEGFP-C1質粒適宜質量比1∶0.89混合，室溫靜置60min；按SPA-PLL交聯物與抗體適宜質量比1∶0.5再將該混合物與抗體混合，室溫靜置60min即獲得CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物，過濾。
結論將SPA-PLL交聯物與CD44抗體和pEGFP-C1質粒混合，于室溫下分別靜置60min即組裝成CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質粒導入系統，組裝過程簡單方便，為非共價結合。
CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質粒導入系統靶向轉染表達CD44分子的大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞1、主要材料(1)CD44/SPA-PLL/PEGFP-C1質粒復合物，同上制備；(2)綠色熒光蛋白質粒(pEGFP-C1)，本室純化；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(4)RPMI1640培養基，Gibco公司產品；(5)小牛血清，杭州四季青公司產品；(6)小鼠表皮生長因子(EGF)，Gibco公司產品；(7)6孔細胞培養板，Corning Costar公司產品；(8)大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細胞的培養將NRK52E細胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數后加入直徑35cm的6孔板中(5×105/孔)，用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養基培養至細胞密度為60～70％的融合度。
(2)細胞轉染實驗將細胞去上清分別加入下列復合物CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物，SPA-PLL/pEGFP-C1質粒復合物，游離pEGFP-C1質粒，CD44抗體+pEGFP-C1質粒混合物，同時設置含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養基對照。這些復合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養基稀釋，其中pEGFP-C1質粒量均為2.5μg/ml，于37℃，5％CO2條件下培養16h，用無血清1640培養基洗滌2次后換含10％小牛血清的1640培養基，繼續培養24h，用PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達和在細胞中的定位。同時先將細胞預先經CD44抗體(50μg/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，再按上述方法進行實驗以觀察該復合物轉染的特異性。
3、結果CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物處理細胞40h后，熒光顯微鏡下觀察可見部分細胞發出綠色熒光，且熒光主要分布于細胞核中(參閱圖7所示)，表明pEGFP-C1質粒轉染進入細胞核內，并進行了有效的轉錄，翻譯生成了綠色熒光蛋白從而在紫外線激發下發出熒光；然而游離pEGFP-C1質粒，SPA-PLL/pEGFP-C1復合物或CD44抗體+pEGFP-C1質粒的混合物處理細胞40h，未觀察到細胞綠色熒光陽性(表3)，提示CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物轉染細胞的有效性。將NRK52E細胞預先經CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物處理細胞40h觀察，則未觀察到細胞綠色熒光陽性，表明CD44抗體能阻斷該復合物與細胞的結合，提示CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1復合物轉染細胞具特異性或靶向性。
表3pEGFP-C1質粒的不同形式轉染NRK52E細胞40h后表達綠色熒光蛋白的情況pEGFP-C1形式 熒光CD44抗體/SPA-PLL/pEGFP-C1 +SPA-PLL/pEGFP-C1 -游離pEGFP-C1 -CD44抗體+pEGFP-C1 -完全1640培養基 -結論CD44抗體靶向的綠色熒光蛋白質粒導入系統能將綠色熒光蛋白質粒靶向導入大鼠腎小管上皮細胞中，并使該質粒在細胞獲得有效表達。
(二)將骨調素反義寡核苷酸靶向導入表達CD44分子的大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞中CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導入系統的組裝1，主要材料(1)HEPES平衡鹽溶液，自配；(2)大鼠骨調素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，同前；(3)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同前；(4)SPA-PLL復合物，同前制備。
2、主要方法(1)SPA-PLL交聯物與AS-ODN結合的適宜質量比的確定同前采用寡核苷酸凝膠阻滯實驗，可得SPA-PLL交聯物與AS-ODN適宜質量比1∶4.1；(2)SPA-PLL交聯物與CD44抗體結合的適宜質量比的測定同前方法測定，SPA-PLL交聯物與CD44抗體結合的適宜質量比為1∶0.5；(3)CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物即CD44抗體靶向反義寡核苷酸的導入系統的組裝將SPA-PLL交聯物，AS-ODN分別用HEPES平衡鹽溶液溶解，按SPA-PLL交聯物與AS-ODN適宜質量比1∶4.1混合，室溫靜置60min；按SPA-PLL交聯物與抗體適宜質量比1∶0.5再將該混合物與抗體混合，室溫靜置60min即獲得CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，過濾。
結論將SPA-PLL交聯物與CD44抗體和OPN反義寡核苷酸混合，于室溫下分別靜置60min即組裝成CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導入系統，組裝過程簡單方便，為非共價結合。
CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導入系統靶向轉染表達CD44分子的大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞的觀察1、主要材料(1)FAM標記的AS-ODN，5’端經熒光素(FAM)標記，由上海Sangon公司經亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量；(2)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，同上制備；(3)SPA-PLL/AS-ODN復合物，自制；(4)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(5)CD44抗體+AS-ODN混合物；(6)RPMI1640培養基，Gibco公司產品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產品；(8)小鼠表皮生長因子(EGF)，Gibco公司產品；(9)6孔細胞培養板，Corning Costar公司產品；(10)大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細胞的培養同前；(2)細胞轉染實驗將細胞去上清分別加入下列復合物CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，SPA-PLL/AS-ODN復合物，游離AS-ODN，CD44抗體+AS-ODN混合物。同時設置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養基對照。這些復合物或混合物均用含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養基稀釋，其中AS-ODN量均為52μg/ml，于37℃，5％CO2條件下培養2h，用冷PBS洗滌細胞2次后于熒光顯微鏡下觀察。同時先將細胞預先經CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，再按上述方法進行實驗以觀察該復合物轉染的特異性。
3、結果CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物與NRK52E細胞孵育后能較好地與細胞結合，表現為復合物結合在細胞周圍發出黃綠色熒光(參閱圖8所示)，而SPA-PLL/AS-ODN復合物，游離AS-ODN，CD44抗體+AS-ODN混合物與細胞孵育2h后經洗滌則未見細胞發出熒光，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物能特異性結合在靶細胞表面；當細胞預先用CD44抗體處理再與CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物孵育則未見該復合物結合在細胞周圍，進一步提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物能特異性或靶向性結合NRK52E細胞。
結論CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導入系統能將OPN反義寡核苷酸靶向導入大鼠腎小管上皮細胞中。CD44抗體靶向的反義寡核苷酸導入系統靶向轉染表達大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)細胞對OPN mRNA表達及粘附活性的影響1、主要材料(1)大鼠骨調素(osteopontin，OPN)反義寡核苷酸(AS-ODN)，同前；順義寡核苷酸(S-ODN)堿基序列5’ATG AGA CTG GCA GTG GTT3’；錯義寡核苷酸(MS-ODN)堿基序列5’CTC TCA CAC TAA AGC GTC3’；以上片斷所有堿基均經硫代修飾，由上海Sangon公司經亞磷酰胺法合成，PAGE純化，紫外分光光度法定量；(2)兔抗大鼠CD44抗體(IgG)，同上；(3)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復合物，CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復合物，SPA-PLL/AS-ODN復合物，CD44抗體+AS-ODN混合物均按上述CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物制備方法制備；(4)RPMI1640培養基，Gibco公司產品；(5)小牛血清，杭州四季青公司產品；(6)小鼠表皮生長因子(EGF)，Gibco公司產品；(7)Vitrogen100，Celtrix公司產品(8)6孔細胞培養板，Corning Costar公司產品；(9)大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)細胞的培養同前；(2)細胞轉染實驗將細胞去上清分別加入1ml不同濃度的下列復合物(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物(2)CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復合物(3)CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復合物(4)SPA-PLL/AS-ODN復合物(5)游離AS-ODN(6)CD44抗體+AS-ODN混合物，這些復合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培養基稀釋，同時設置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培養基對照，于37℃，5％CO2條件下培養2h，用無血清1640培養基洗滌3次，再繼續培養48h，收集細胞提取總RNA。(3)細胞總RNA的提取按Trizol試劑盒說明書操作，同前。(4)RNA的斑點雜交按“The Dig System User’sGuide for Filter Hybridization”說明書(Boehringer Mannheim公司)操作；(5)膠原凝膠的制備將Vitrogen100與此1×和10×M199培養基混合，使膠原的終濃度為2mg/ml，調pH值為7.4，加入到6孔板中于37℃過夜使膠凝固；(6)細胞粘附實驗將經處理的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來計數(細胞濃度2.5×105/ml)，取200μl加在膠原凝膠表面，于37℃，5％CO2條件下培養，于不同時間點用培養基沖洗凝膠表面計數未貼附的細胞和已貼附的細胞，按下式計算細胞在凝膠中的貼附率(％)。貼附率(％)＝貼附細胞數/加入細胞數×100％3、結果(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物對NRK52E細胞OPN mRNA表達的抑制作用RNA斑點雜交結果表明，當同CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物共培養48h，NRK52E細胞OPN-mRNA水平較低，明顯低于未加藥物的1640培養基對照，且具有AS-ODN一定的濃度依賴性，其最低抑制濃度為10μmmol/L；而經CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復合物或CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復合物處理的細胞OPN-mRNA水平仍然較高，即使30μmmol/L濃度也未表現出明顯抑制作用(參閱圖9所示)，提示AS-ODN能特異性抑制大鼠小管上皮細胞OPN mRNA表達也即AS-ODN具有基因水平的特異性反義抑制作用。如將細胞預先經CD44抗體(50ug/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理，或經SPA-PLL/AS-ODN復合物，CD44抗體+AS-ODN混合物，游離AS-ODN處理則NRK52E細胞OPN-mRNA水平無明顯降低(參閱圖10所示)，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物對NRK52E細胞OPN mRNA表達的抑制作用也具有細胞特異性或靶向性。CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物對NRK52E細胞OPN mRNA表達具有細胞和基因水平的雙重抑制作用。
(2)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物對NRK52E細胞粘附能力的影響在膠原凝膠板上培養時，經CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理的細胞很容易被洗滌下來，而經CD44抗體/SPA-PLL/S-ODN復合物，CD44抗體/SPA-PLL/MS-ODN復合物，SPA-PLL/AS-ODN復合物，CD44抗體+AS-ODN混合物處理的細胞及1640培養基對照處理的細胞仍緊緊地貼附于板上(參閱圖11所示)，提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物可通過抑制OPN的表達從而在細胞水平，基因水平特異性地抑制NRK52E細胞的粘附功能；當將細胞預先經CD44抗體(50μg/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理，則該細胞不容易被洗滌下來而是較緊密貼附于板上(參閱圖11所示)，進一步提示CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合。
結論CD44抗體靶向的OPN反義寡核苷酸導入系統能將OPN反義寡核苷酸靶向導入大鼠腎小管上皮細胞中，該反義寡核苷酸在細胞中發揮出反義抑制作用。
五、抗體靶向非病毒型基因導入系統的毒性作用由于抗體靶向非病毒型基因導入系統能選擇性或者說特異性將目的基因導入靶細胞中，讓目的基因在細胞中發揮作用，故一般希望該導入系統無或低毒性。該導入系統的關鍵組成部分是SPA-PLL復合物，因此SPA-PLL復合物毒性大小決定著抗體靶向非病毒型基因導入系統的毒性作用，下面實驗以抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)和SPA-PLL交聯物對培養的兩種細胞存活率的影響來說明抗體靶向非病毒型基因導入系統對轉染細胞的毒性作用。
(一)SPA-PLL交聯物和抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)對大鼠腎小管上皮細胞(NRK52E)的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，SPA-PLL交聯物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑藍(MTT)，Sigma公司產品；(3)二甲基亞砜(DMSO)，分析純，Sigma公司產品；(4)大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)，同前；(5)96孔細胞培養板，公司產品；(6)RPMI1640培養基，Gibco公司產品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產品。
2、主要方法(1)細胞的培養同前；(2)，MTT比色分析將NRK52E細胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數后加入96孔板(5×104/孔)。待細胞貼壁后加入不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，SPA-PLL交聯物，SPA，PLL(每個濃度均作4復孔)，于37℃，5％CO2條件下培養不同時間，加入MTT(5mg/ml，12μg/孔)，繼續培養4-8h，吸棄上清，加入DMSO(120μl/孔)，混勻后于570nm波長處測吸收光度(A)，按下式計算細胞存活率存活率＝(實驗孔A570/對照孔A570)×100％3、結果(1)不同濃度SPA-PLL交聯物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物對細胞的毒性作用當與NRK52E細胞共同孵育72h，SPA-PLL交聯物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物在低濃度范圍內(0～62.5μg/ml)對細胞毒性作用較小(細胞存活率＞85％)，在高濃度時(＞125μg/ml)對細胞毒性作用顯著增強(參閱圖12所示)；游離PLL對細胞的毒性作用明顯，且呈濃度依賴性；而游離SPA對細胞無毒性作用，細胞存活良好(＞90％)。
(2)同一濃度SPA-PLL交聯物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理不同時間對細胞的毒性作用濃度為31.3μg/ml的SPA-PLL交聯物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理的細胞存活率較高(＞85％)，無時間依賴性，游離SPA處理對NRK52E細胞無任何毒性作用，然而PLL的處理能明顯降低細胞存活率，且具有時間依賴性(參閱圖13所示)。
結論抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交聯物對大鼠腎小管上皮細胞在常用濃度內無毒性作用。
(二)SPA-PLL交聯物和抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)對人肝癌SMMC-7721細胞的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，SPA-PLL交聯物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑藍(MTT)，Sigma公司產品；(3)二甲基亞砜(DMSO)，分析純，Sigma公司產品；(4)人肝癌SMMC-7721細胞株，四川大學基礎醫學院免疫學教研室惠贈；(5)96孔細胞培養板，Corning Costar公司產品；(6)RPMI1640培養基，Gibco公司產品；(7)小牛血清，杭州四季青公司產品。
2、主要方法(1)細胞的培養同前；(2)，MTT比色分析將SMMC-7721細胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數后加入96孔板(5×104/孔)。待細胞貼壁后加入不同濃度CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN復合物，SPA-PLL交聯物，SPA，PLL(每個濃度均作4復孔)，于37℃，5％CO2條件下培養不同時間，加入MTT(5mg/ml，12μl/孔)，繼續培養4～8h，吸棄上清，加入DMSO(120μl/孔)，混勻后于570nm波長處測吸收光度(A)，按下式計算細胞存活率存活率＝(實驗孔A570/對照孔A570)×100％3、結果(1)不同濃度SPA-PLL交聯物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物對細胞的毒性作用當與SMMC-7721細胞共同孵育72h，SPA-PLL交聯物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物在低濃度范圍內(0～62.5ug/ml)對細胞毒性作用較小(細胞存活率＞85％)，在高濃度時(＞125μg/ml)對細胞毒性作用顯著增強(參閱圖14所示)；游離PLL對細胞的毒性作用明顯，且呈濃度依賴性；而游離SPA細胞無毒性作用，細胞存活良好。
(2)同一濃度SPA-PLL交聯物和SPA-PLLCD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理不同時間對細胞的毒性作用濃度為31.3μg/ml的SPA-PLL交聯物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN復合物處理的細胞存活率較高(85％以上)，無時間依賴性，游離SPA處理對SMMC-7721細胞無任何毒性作用；然而游離PLL的處理能明顯降低細胞存活率，且具有時間依賴性(參閱圖15所示)。
結論抗體靶向非病毒型基因導入系統(CD44抗體/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交聯物對人肝癌細胞在常用濃度內無毒性作用。
權利要求
1.一種通用的抗體靶向非病毒型基因導入系統，其特征在于由金黃色葡萄球菌A蛋白與多聚賴氨酸共價結合形成A蛋白-多聚賴氨酸交聯物，將該A蛋白-多聚賴氨酸交聯物與IgG抗體和質粒或寡核苷酸經混合組裝成細胞靶向結合的基因導入系統用于基因轉染，該基因導入系統為非病毒導入系統。
全文摘要
本發明公開了一種通用的抗體靶向非病毒型基因導入系統。該基因導入系統由三部分構成IgG抗體，蛋白A－多聚賴氨酸交聯物(SPA－PLL)和預導入的核酸片段(包括基因)，其中核心部分為SPA－PLL交聯物，SPA－PLL交聯物能與多種IgG抗體及多種預導入的核酸片段經過混合即可組裝成多種不同的抗體靶向非病毒型基因導入系統，故該系統具有通用性；該基因導入系統具有良好的細胞靶向性或特異性。
文檔編號C12N15/87GK1478898SQ03126650
公開日2004年3月3日 申請日期2003年5月23日 優先權日2003年5月23日
發明者劉曉波, 余學清 申請人:中山大學附屬第一醫院