專利名稱：解淀粉芽胞桿菌ch-2菌株的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，特別是解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株的制備方法和應用。本專利用的解淀粉芽胞桿菌CH-2(Bacillus amyloliquetaciens CH-2)，已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期是2003年6月16日，保藏號是CCTCC NOM 203055。
背景技術：
核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一種重要的植物病原真菌，可寄生450多種植物，包括油菜、大豆、向日葵等重要的油料作物，由其引起的菌核病是一種世界性分布的毀滅性病害。核盤菌以菌核的形式在土壤中越冬越夏，當溫度以及濕度條件適宜時，菌核萌發產生子囊盤，散發的子囊孢子侵染植物。核盤菌對一些重要的經濟作物如油菜、大豆、向日葵等的產量和品質構成了極大的威脅。在歐洲春油菜發病嚴重，一般可使油菜減產5～10％，嚴重時可減產50％。在中國所有油菜產區的油菜生產都受核盤菌危害，其中尤以長江流域和東南沿海地區最為嚴重，發病率為10～80％，可導致減產5～30％，且油菜籽含油量銳減，已成為制約我國油菜生產、提高油菜產量的主要限制因素。特別是近年來雙低油菜的大規模推廣種植，硫甙的降低使油菜更容易感染核盤菌。
在油菜菌核病的防治方面，由于油菜對菌核病不表現垂直抗性，目前還沒有有效的抗病品種問世。長期以來，對油菜菌核病的防治主要采用化學方法，如苯并咪唑類殺菌劑。但采用化學防治不僅污染環境，而且殺菌劑的長期使用可以導致抗藥性菌株的產生，目前已經在多個油菜種植區分離到具有抗藥性的毒力菌株。由于目前還沒有克隆針對菌核病的有效的抗性基因，通過基因工程的方法防治也沒有理想的效果。
通過有益微生物防治油菜菌核病不僅可以彌補常規油菜育種存在的缺陷，還可以有效降低化學農藥的使用及抗藥性菌株的產生。在目前研究的菌核病生防菌中，國外有通過真菌盾殼霉(Coniothyrium minitans)進行防治的報道(Whipps and Gerlagh，1992)，該菌通過寄生核盤菌菌核，使其喪失產生子囊盤的能力，近年來，一些盾殼霉商品制劑已經在國外登記，如德國登記的CONTANS和匈牙利登記的KONI。在我國，中國農業科學院植物保護研究所分離出一株編號為2-16的菌株，定名為不吸水鏈霉菌黃山變種(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)，該菌對油菜菌核病具有一定的防治效果。從油菜抗病品種中油821分離的一株產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)對核盤菌菌絲擴展具有一定的阻礙作用。草酸降解菌對菌核病的防治也有一定的效果。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株，該菌株不僅能夠防治菌核病，而且可抑制核盤菌的生長，從而可作為油菜、大豆、向日葵等經濟作物的有效的生物防治手段，使其產量和品質提高。同時，制備該菌菌株的方法簡單，適于工業化生產。
本發明解決其技術問題的方案是用于制備防治由核盤菌引起的經濟作物菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)的生物制品。
解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株的制備方法，包括如下步驟a.病原菌的活化與培養
核盤菌菌核經0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養基于28～30℃培養至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養基生長待用。
b.芽孢桿菌的培養從不同來源的土壤樣品中分離出若干株芽孢桿菌菌株，然后將其接種到LB或PDA培養基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養。
c.培養24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養基，過夜培養的芽孢桿菌菌液接種1環于平皿中央，28～30℃培養48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小。
d.從中篩選能夠抑制核盤菌菌絲生長的菌株，該菌株即為解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株。
本發明具有如下優點其一.具有很強的抑制核盤菌生長的能力，其抑菌圈直徑為30mm。可消除油菜減產5～30％的危害因素，并能提高油菜籽含油量，對于大豆、向日葵等經濟作物來說，也能提高其產量和品質。
其二.具有抑制菌核形成的能力，可作為防治油菜菌核病的有效的生物防治手段。
其三.利于雙低油菜的大規模推廣種植。
其四.可消除因化學防治所帶來的環境污染的問題，以及長期使用化學殺菌劑所導致的抗藥性菌株的產生。
其五.制備方法簡單，操作方便，適于工業化生產，具有開發利用的潛在價值。


圖1是解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株抑制核盤菌的效果示意圖。
圖2是解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株培養液稀釋后的抗菌效果比較示意圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
在進行油菜生防菌的分離與篩選研究中，從不同來源的土壤樣品中分離出若干株(例如17株)芽孢桿菌菌株，并檢測了這些菌株抑制核盤菌的效果，其中4株對油菜核盤菌表現出不同程度的抑制。這些菌株包括2株枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis，F10，L5)，1株地衣芽孢桿菌(B.licheniformis AJH-1)，1株解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株(B.amyloliquetaciens)。其中解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株不僅具有很強的抑制核盤菌生長的能力，而且還能夠抑制菌核的形成。
一.實施例實驗一.抗性菌株的篩選1.病原菌的活化與培養核盤菌菌核(由中國農業科學院油料作物研究所提供)經0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養基于28～30℃培養至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養基生長待用。
2.芽孢桿菌的培養將不同芽孢桿菌接種到LB或PDA培養基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養。
3.抑制菌絲效果培養24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養基。過夜培養的芽孢桿菌菌液接種1環于平皿中央，28～30℃培養48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小。經檢測，有4株能夠抑制核盤菌菌絲的生長。從表1可以看出，不同芽孢桿菌菌株抑制的效果差別較大，其中解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株(以下簡稱CH-2菌株)和地衣芽孢桿菌菌株AJH-1的抑制效果最好。但這2種菌株的抑菌方式明顯不同。AJH-1雖然能夠抑制油菜核盤菌菌絲的生長，但菌絲最后仍能夠形成菌核。而CH-2菌株不僅能夠抑制菌絲的生長，還具有強烈抑制油菜核盤菌菌核形成的能力(見圖1)；因此CH-2菌株的這種抑制菌核形成的能力在該菌的實際應用過程中可能具有重要的意義。其它2株枯草芽孢桿菌菌株具有一定的抑制效果，但沒有CH-2菌株的效果顯著。
實驗二.不同菌株不同培養時間上清液抗菌活性比較為了證實抑菌物質是否為胞外分泌型，選取具有抑制菌絲生長的4株芽孢桿菌，在LB(AJH-1，F10，L5)或PDA(CH-2)培養基搖床培養72、96、120h，于8000rpm離心2min，上清液加入100mg/L抗菌素特美汀(Timentin)，取100μl加入打孔的PDA培養基中央，48h后觀察抑菌圈大小，結果見表2。可以看出，4種菌株的抑菌物質均為胞外分泌型，但隨著培養時間的延長，CH-2菌株的抑菌效果有所降低，而其它3種菌株則變化不大。
實驗三.上清液粗蛋白的抗菌效果為了檢測上清液抑菌物質是否為抗菌蛋白，在不同培養基培養的CH-2(PDA培養基)以及AHJ-1(LB培養基)培養48h的菌液于4℃、8000rpm離心10min，上清液加入60％的(NH4)2SO4至飽和，置4℃18-20h，再于10000rpm離心10min。棄上清液，沉淀加入原體積10％的5mM磷酸緩沖液(pH7.0)，經Milipore細菌過濾器(0.2μm)過濾，采用實驗二的打孔法測定抗菌效果，結果見表3。可以看出經硫酸銨沉淀后的上清液仍具有抗菌效果，因此兩種拮抗菌分泌的抗菌物質的主要成分可以認為是抗菌蛋白。
實驗四.CH-2菌株在不同培養基培養后過濾液抗菌活性比較為了提高CH-2菌株抗菌蛋白的含量，在PDA培養基中加入0.5％的牛肉膏，酵母膏或蛋白胨，培養48h后上清液經細菌過濾器過濾，通過打孔法測定抗菌效果，結果見表4。結果表明加入不同氮源的培養基降低了抗菌效果，而且CH-2菌株在M32培養基上培養不表現出抗菌效果。
實驗五.CH-2菌株培養液稀釋后的抗菌效果比較在PDA培養基培養培養48h的CH-2菌液按實驗三的方法經(NH4)2SO4沉淀，加入原體積10％的磷酸緩沖液(1X)，在此基礎上再用磷酸緩沖液稀釋10倍或100倍，通過打孔法測定稀釋后的抑菌效果(見圖2)，結果見表5。CH-2菌株培養液稀釋100倍后仍然具有抗菌活性。
二.附表表1.不同芽孢桿菌菌株對油菜核盤菌的抑制效果

表2，不同菌株不同培養時間上清液抗菌活性比較

表3.上清液經硫酸銨沉淀后的抗菌效果

表4.CH-2菌株在不同培養基培養后過濾液抗菌活性比較

表5.CH-2菌株硫酸銨沉淀稀釋后的抗菌效果比較

權利要求
1.一種解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株(Bacillus amyloliquetaciens)CCTCC M203055，其特征在于用于制備防治由核盤菌引起的經濟作物菌核病的生物制品。
2.根據權利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株CCTCC M203055，其特征在于所述的經濟作物是油菜，或大豆，或向日葵。
3.解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株CCTCC M203055的制備方法，包括如下步驟a.病原菌的活化與培養核盤菌菌核經0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養基于28～30℃培養至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養基生長待用，b.芽孢桿菌的培養從不同來源的土壤樣品中分離出若干株芽孢桿菌菌株，然后將其接種到LB或PDA培養基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養，c.培養24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養基，過夜培養的芽孢桿菌菌液接種1環于平皿中央，28～30℃培養48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小，d.從中挑出能夠抑制核盤菌菌絲生長的菌株，該菌株即為解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株。
全文摘要
本發明涉及解淀粉芽胞桿菌CH－2菌株(Bacillusamyloliquetaciens)CCTCC M203055的制備方法和應用。該菌株用于防治油菜、大豆、向日葵等經濟作物菌核病或核盤菌病的生物制品。該菌株的制備方法包括病原菌的活化與培養、芽孢桿菌的分離、培養及篩選步驟。本發明獲得的解淀粉芽胞桿菌CH－2菌株具有很強的抑制核盤菌生長的能力和抑制菌核形成的能力，利于雙低油菜的大規模推廣種植，同時還具有制備方法簡單、操作方便等優點，并且適于工業化生產，開發利用潛在價值大。
文檔編號C12N1/20GK1526813SQ0312544
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月23日 優先權日2003年9月23日
發明者陳士云, 楊寶玉, 宋冬林, 王瑤, 高梅影, 戴順英 申請人:中國科學院武漢病毒研究所