Gspe在治療細胞鈣超載損傷靶向藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種GSPE在治療細胞鈣超載損傷靶向藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]已知鈣離子通道Orai 1介導的鈣池可控性鈣通道或鈣離子釋放活化鈣通道(store-operated calcium/calcium release activated calcium, SOC/CRAC)是非興奮性細胞鈣離子內流的主要機制。革蘭氏陰性細菌及其釋放的內毒素造成的菌血癥、內毒素血癥直接作用于血管內皮細胞，導致血管內皮細胞損傷及功能障礙，毛細血管通透性增加，炎癥介質釋放，啟動膿毒癥的發生，因此血管內皮細胞受損是膿毒癥發生的始動信號，居于中心環節。在此背景基礎上，我們創新的發現:0rail介導的鈣池可控性鈣離子內流機制(store-operated calcium entry, S0CE)直接造成全身毛細血管內皮細胞|丐超載損傷，啟動膿毒癥的發生。而針對Orai 1的靶向性藥物可以有效的阻斷Orai 1介導的S0CE機制，從而逆轉血管內皮細胞鈣超載損傷，有效的治療膿毒癥。葡萄籽原花青素提取物GSPE(grapeseed procyanidin extract, GSPE)的主要作用具有抗氧化和抗炎癥反應，但對細胞|丐離子代謝的作用沒有報道。

【發明內容】

[0003]針對現有技術對治療膿毒癥存在的技術難題，本發明的目的在于提供一種GSPE在治療血管細胞鈣超載損傷靶向藥物中的應用。
[0004]本發明具體通過以下技術方案實現:
本發明提供了 GSPE在治療細胞鈣超載損傷靶向藥物中的應用。
[0005]本發明所述細胞鈣超載損傷為致膿毒癥血管內皮細胞鈣超載損傷。
[0006]本發明所述GSPE預處理的Orail表達正常的小鼠膿毒癥模型，發現Orail顯著被抑制，膿毒癥小鼠的血管內皮細胞鈣超載被顯著逆轉，從而證明GSPE是Orai 1的天然的特異性抑制劑，能阻斷Orail介導的S0CE信號，逆轉膿毒癥Orail介導的細胞鈣超載損傷。
[0007]本發明所述GSPE對LPS經典的信號通路TLR4、NFkB沒有影響，特異性阻斷Orail信號，實現阻斷鈣超載信號的目的。
[0008]本發明首次提供了Orai 1介導的S0CE機制是GSPE阻斷小鼠肺血管內皮細胞鈣超載損傷的藥物作用靶點。
[0009]所述的GSPE在制備治療膿毒癥靶向藥物中的應用，以治療膿毒癥血管內皮細胞鈣超載損傷。
[0010]本發明所述的GSPE還可加入其它治療膿毒癥的藥物中，起到靶向作用，其中所述的其它治療藥物為抗感染類藥物或重組人活化蛋白C，所述抗感染類藥物為抗生素類、抗真菌類、抗病毒類、抗支原體類、抗腫瘤類或免疫抑制劑;其中所述抗生素類為β-內酰胺類、氨基糖甙類、四環素類、酰胺醇類或大環內脂類，所述抗真菌類為多烯類、三唑類、嘧啶類或棘白菌素類。
[0011]本發明所述GSPE可和適量藥學上可以接受的載體制備成藥物制劑，其中所述藥用載體可以是pH緩沖系統，滲透壓調節劑，防腐劑，穩定劑等輔助成分，優選自:磷酸鈉(Sodium Phosphate)、琥泊酸鈉(SodiumSuccinate)、組氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯 20/80(Polysorbate20/80)、氯化鈉(30(1;[1111101101^(16)、鹿糖(Sucrose)、三輕甲基氨基甲燒(Trometamol)和乳糖等。
[0012]本發明所述的藥物制劑為溶液制劑或干粉制劑，所述藥物制劑的給藥形式為靜脈給藥，皮下注射，腹腔內注射或肌肉注射。
[0013]本發明的有益效果為:首次發現Orai 1介導的S0CE機制是GSPE阻斷小鼠肺血管內皮細胞鈣超載損傷的藥物作用靶點，經試驗證明，GSPE預處理的膿毒癥小鼠肺血管內皮細胞Or a i 1表達被顯著抑制，而T L R4、NF kB表達則沒有被抑制，因此證明G S PE特異性抑制Orail，阻斷Orail介導的S0CE機制，抑制細胞外鈣離子內流，從而逆轉細胞鈣超載損傷。
【附圖說明】
[0014]以下結合附圖所示實施例的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。
[0015]圖1為GSPE對膿毒癥小鼠肺血管內皮細胞表達0ra1、TLR4、NFkB水平的影響。
[0016]圖2為GSPE對膿毒癥小鼠肺血管內皮細胞鈣離子內流的影響。
[0017]圖3為GSPE對膿毒癥小鼠的死亡率的影響。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0019]本研究采用基因敲除的方法構建Orai1基因表達缺陷的BALB/c小鼠模型，采用盲腸結扎穿孔CLP方法復制BALB/c小鼠腹腔感染膿毒癥模型。應用鈣成像及分子生物學的方法確定Orail介導的S0CE是參與膿毒癥細胞鈣超載損傷的主要機制。LPS通過識別和活化TLR4信號、NFkB信號，進一步活化Orail信號，啟動Orail介導的S0CE，引發細胞外鈣離子內流機制，導致膿毒癥血管內皮細胞鈣超載損傷。應用GSPE預處理的Orail表達正常的小鼠膿毒癥模型，發現Orai 1顯著被抑制，膿毒癥小鼠的血管內皮細胞鈣超載被顯著逆轉，從而證明GSPE是Orail的天然的特異性抑制劑，能阻斷Orail介導的S0CE信號，逆轉膿毒癥Orail介導的細胞鈣超載損傷。
[0020](一)實驗材料:
1、構建Orai 1基因敲除小鼠模型:采用RNA干擾技術原理，成功敲除的Orai 1基因，制備Orail基因表達沉默小鼠，并獲得子代，通過鑒定符合Orail基因表達缺陷。
[0021]2、構建Or a i 1基因表達缺陷的膿毒癥小鼠模型:采用CLP法(盲腸結扎穿孔)構建Orai 1表達缺陷的膿毒癥動物模型。
[0022]3、獲得原代血管內皮細胞(HUVEC細胞)、以及原代腹腔巨噬細胞:摘取膿毒癥小鼠肺組織分離小鼠肺血管內皮細胞;采用腹腔灌洗法獲取小鼠腹腔巨噬細胞。
[0023]4、葡萄籽原花青素提取物GSPE，濃度200mg/kg，具有抗氧化和抗炎癥的功效。
[0024]5、0rai 1、TLR4、NFkB抗體，鈣離子熒光探針，鈣成像儀等。
[0025](二)實驗原理:
l、0rail基因缺陷表達的膿毒癥小鼠原代肺微血管內皮細胞和腹腔巨噬細胞的獲得原理:
A)獲得Orai 1基因敲除小鼠:利用基因打靶技術和RNA干擾技術構建BAB/c小鼠Orai 1純合子表達缺陷小鼠，委托廣州賽業有生物技術有限公司給予構建和鑒定。Orail基因缺陷的小鼠的特點是肺血管內皮細胞膜S0C鈣離子通道被關閉，細胞外鈣離子無法通過S0C進入細胞內從而完成細胞鈣內流。
[0026]B)0rail表達缺陷小鼠膿毒癥模型建立:采用盲腸結扎穿孔(CLP)實驗的原理，在麻醉狀態下給予Orail表達缺陷小鼠開腹手術，暴露盲腸，對盲腸用4號注射器針頭進行穿刺打孔，并橫向貫穿盲腸，并使適量腸內容物流出，結扎盲腸，還納經過穿孔并結扎的盲腸于腹腔，逐層關腹，手畢腹腔注射500ul無菌生理鹽水進行液體復蘇，然后正常飼養，觀察小鼠的死亡率。CLP模型小鼠的死亡率為90%以上。
[0027]C)獲得膿毒癥小鼠肺血管內皮細胞:采用酶消化、免疫磁珠二次分選法分離純化小鼠原代肺微血管內皮細胞。根據Orai 1是否被敲除，分離Orai 1基因敲除小鼠肺微血管內皮細胞，以及Orail基因表達正常的小鼠肺微血管內皮細胞。
[0028]D)獲得膿毒癥小鼠腹腔巨噬細胞:采用腹腔灌洗的方法收集獲得膿毒癥小鼠原