一種靶向沉寂cdk2基因的重組腺相關病毒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學與生物醫藥技術領域，具體涉及一種靶向沉寂⑶K2基因 的重組腺相關病毒。 技術背景
[0002] 肝癌由于發病率高、治療困難、死亡率高等特點在我國惡性腫瘤疾病中居第二位 死因，每年死于肝癌的人數占全世界肝癌年死亡總數的53 %，其發病機制至今仍不明了，治 療方法主要包括放化療、手術及肝移植，然而，80%以上的肝癌患者病情已到晚期，無法應 用上述治療方法，即使能夠實施手術切除，術后的復發率也比較高，而且術后的長期預后不 能令人滿意，因此尚需盡快找到有效的早期診斷方法和治療靶點。
[0003] 研究發現細胞的失控性增殖是惡性腫瘤細胞侵襲性生長及轉移的最基本特征，而 其根本原因就是細胞周期調控機制的破壞，已發現的與細胞周期調控密切相關的分子主要 有細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase，Q)Ks)、細胞周期蛋白（Cyclin) 以及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)三大 類。CDK2是細胞周期過程關鍵的限速因子，在整個細胞周期中表達水平保持不變，如果單 獨存在是沒有活性的，只有在不同的細胞周期進程中，與相應的Cyclin結合后才會呈現出 蛋白激酶的活性，磷酸化不同的底物，從而啟動或調控細胞周期的主要事件，驅動細胞周期 進程。在細胞周期中主要有兩個檢查點：G1/S期和G2/M期，這些檢查點對細胞周期起著 監控作用，其中，G1/S檢查點是細胞周期中的主要限制點（restrictionpoint)，而CDK2/ CyclinE復合物在此過程中起關鍵性作用。CyclinE是⑶K2的調節亞基，調節著⑶K2的 活性，當細胞由Gl期進入S期，首先⑶K2會與CyclinE結合成復合物，激活⑶K2,使視 網膜母細胞瘤基因（retinoblastoma，Rb)磷酸化，高磷酸化后的Rb會完全釋放出游離的 轉錄因子E2F，啟動DNA的合成，加速細胞從Gl期進入S期。當細胞進入S期后，⑶K2/ CyclinE復合體降解，⑶K2轉而與CyclinA結合成新的復合體，從而推進細胞周期由S期 越過限制點進入G2期；因此CDK2活性增高，可以促進細胞的增殖和分化，是細胞周期的正 調節因子，可通過抑制相應的CDK或CDK/Cyclin復合物的活性，阻止細胞周期進程（詳見 文南犬：[1]KusumotoK.Structuralfeaturesofglutamate-basedlipidicmaterials forsmallinterferingRNAdeliverysystem[J].JBiomedMaterResA,2009,89(3)： 739-750 ； [2]YangX，ZuX，TangJ，etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2 andE2F4inlivercancercellsimplicationsfortheroleofZbtb7incellcycle regulation[J].MolMedReport，2012,5 (6) :1475_1480)〇
[0004] 大量研究表明腫瘤的發生與CDK2和其它細胞周期相關因子的異常表達有關， CDK2基因表達異常，會引起細胞周期紊亂、細胞增殖失控，最終導致癌癥。張桂東等研究證 實，CDK2蛋白的異常表達會引起早期胃癌的發生，為臨床上胃癌早期診斷提供實驗依據。 此外還發現肺癌、結直腸癌、鼻咽癌等腫瘤細胞中CDK2都呈高表達狀態。新近研究發現， 靶向⑶K2的shRNA能夠抑制肝癌細胞的增殖，因此，通過⑶K2基因的深入研究，不僅有助 于揭示腫瘤的發生機理，還能為腫瘤的預防和治療提供新的思路和手段，由此將CDK2作為 腫瘤治療祀點是一種可行的方法（詳見文獻：[3]KusumotoK.Structuralfeaturesof glutamate-basedlipidicmaterialsforsmallinterferingRNAdeliverysystem[J]. JBiomedMaterResA,2009,89(3) :739-750 ； [4]YangX,ZuX,TangJ,etal.Zbtb7 suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercellsimplications fortheroleofZbtb7incellcycleregulation[J].MolMedReport，2012,5(6)： 1475-1480 ； [5]GaoJJ，FengXB，YoshinoriI，etal.Des-y-carboxyprothrombinand c-Metwereconcurrentlyandextensivelyexpressedinhepatocellularcarcinoma andassociatedwithtumorrecurrence[J].BiosciTrends，2012,6 (4) :153-159; [6]JangKY，NohSJ，LehwaldN，etal.SIRTlandc_Mycpromotelivertumorcell survivalandpredictpoorsurvivalofhumanhepatocellularcarcinomas[J].PLOS 0ne，2012,7(9) :e45119)。
[0005] 基因治療是通過一定的載體，將外源基因導入靶細胞，并可有效的進行表達，達到 治療疾病的目的。腺相關病毒（AAV)因其可以長期穩定表達目的蛋白以及高度的安全性得 到了越來越多的關注。作為基因治療載體AAV有如下優點=(I)AAV感染范圍比較廣，能感 染分裂期細胞和非分裂期細胞；（2)AAV引起的免疫反應低，致病性低；(3)定點整合，避免 了隨機整合導致的宿主細胞發生突變的危險性；(4)攜帶的外源基因可持續穩定表達；（5) AAV理化性質穩定，抗酸堿性和熱穩定性好，便于保存。基于這些特性，使AAV成為基因轉移 最為理想的載體之一。
[0006] 8型腺相關病毒（AAV8)屬于"雜合"載體，將AAV8的cap基因與攜帶r印基因、 ITR結構的AAV2組合可得到重組AAV2/8,簡稱rAAV8。AAV8對肝臟的轉染效率較其它血 清型高出10~100倍，因其在肝臟組織顯示了高效穩定的基因轉染而備受關注。重組 AAV8(rAAV8)現已廣泛應用于腫瘤、遺傳性疾病、自身免疫性疾病以及抗病毒的基因治療 研究中。Nakai等研究發現通過小鼠尾靜脈注射給藥，rAAV8在體內的轉染率及表達水平 和給藥量成線性關系，轉染效果可以達到100%，并且可持續至少1年以上的時間（詳見 文南犬：[7]NakaiH，FuessS，StormTA，etal.Unrestrictedhepatocytetransduction withadeno-associatedvirusserotype8vectorsinmice[J].JVirol，2005,79(I)： 214-224 ； [8]SarkarR，TetreaultR，GaoG，etal.Totalcorrectionofhemophilia AmicewithcanineFVIIIusinganAAV8serotype[J].Blood,2004,103 (4)： 1253-1260 ； [9]Lvfeta.Adeno-associatedvirus-mediatedanti-DR5chimericantibody expressionsuppresseshumantumorgrowthinnudemice[J] ?Cancerlett，2011，302 : 119-127 ； [10]SimonelliF，MaguireAM,TestaF，etal.GenetherapyforLeber's congenitalamaurosisissafeandeffectivethroughI. 5yearsaftervector administration[J] ?MolTher，2010,18 (3) :643-650)。但是，關于針對CDK2 基因的重組腺 相關病毒用于體內靶向治療肝癌的應用目前尚未見文獻報道。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相關病毒。
[0008] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相 關病毒是由下列方法構建得到的：
[0009] a根據人肝癌細胞⑶K2基因序列，設計針對⑶K2特異性的SiRNA序列，構建重組 質粒pAKD-shRNA-CDK2,利用菌落PCR技術進行DNA測序分析；
[0010] b將重組質粒pAKD-shRNA-CDK2、包裝質粒PAAV-RC和輔助質粒pHelper用磷酸鈣 法共轉染AAV-293細胞，收獲重組腺相關病毒rAAV-shRNA-⑶K2,采用定量PCR方法對病毒 進行滴度測定。
[0011] 所述的步驟a中針對CDK2特異性siRNA序列為：GACCCTAACAAGCGGATTTCG。
[0012] 所述的步驟a中在選定的靶點序列基礎上添加KpnI (-GTAC-)和BgI II (-GATC-) 內切酶的酶切位點序列與轉錄終止序列，合成完整的shDNA序列：
[0013] shDNA-1-GATCCCCCGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCGCTTGTTAGGGTCTTTTT TTGTAC-
[0014] shDNA-2-AAAAAAAGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCGCTTGTTAGGGTCGGGG-
[0015] 本發明的優點在于：
[0016] 1.本發明構建了一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相關病毒rAAV-shRNA-⑶K2,采 用可以長期穩定表達目的蛋白以及高度的生物安全性的8型腺相關病毒（AAV8)為轉導載 體，利用AAV8對肝細胞的高度親嗜性感染肝癌細胞，使其在體內長期穩定表達，從而起到 沉寂⑶K2基因、抑制肝癌細胞生長的作用。
[0017] 2.通過建立人肝癌IfepG2細胞裸鼠皮下移植瘤模型實驗證實重組腺相關病毒 rAAV-shRNA-CDK2具有抑制肝癌細胞增值的作用，建立了一種有效治療肝癌的手段和方法。
【附圖說明】
[0018]附圖1是質粒載體pAKD-CMV/bGlobin-eGFP-Hl-shRNA。
[0019] 附圖2是質粒載體的酶切鑒定結果：1.質粒載體；2.DNA Marker。
[0020] 附圖3是菌落PCR鑒定結果：N為陰性對照組，M為Marker DL2000,第1-10泳道 為轉化子樣本。
[0021] 附圖4是DNA全序列測序報告：寡核苷酸片段位于測序圖中177位至241位（65 個堿基）。
[0022] 附圖5是測序比對報