專利名稱：大口黑鱸快速生長基因及親本篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種基因，特別涉及一種與大口黑鱸快速生長有關的基因。本發明還涉及使用該基因進行快速生長大口黑鱸親本的篩選方法。
背景技術：
大口黑鱸(Micropterus salmoides L.)，俗名加州鱸，原產于北美洲，具有生長快、耐低溫、肉質鮮美和易捕撈等特點，是重要的淡水養殖魚類之一。1983年從臺灣引種到廣東省，現在全國大部分地區均有養殖。然而，目前我國養殖的大口黑鱸是由野生種家養馴化而成的，缺少定向選育，在親本留種時經常選擇個體小，性成熟早的個體作為親本，致使我國大口黑鱸種質的下降，主要表現在生長速度下降、性成熟年齡普遍提前、餌料轉化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生長速度關系到大口黑鱸產量的高低，養殖效益的大小。大口黑鱸小型化的趨勢直接制約著大口黑鱸養殖業的發展。因此，改良大口黑鱸生長速度的工作勢在必行。挑選優質親魚是提高養殖魚類生長速度的主要方法之一，其目的是為了改變養殖群體的遺傳結構，使后代獲得更快的生長速度、更好的抗病能力的遺傳特點。在生產中，其傳統方法是挑選個體較大、身體健壯的魚作為留種親本，即根據表型來決定親魚是否留種。 這種方法方便、快捷、簡單，但受人為因素影響很大，加上大口黑鱸屬于肉食性為主的魚類， 掠食性強，餌料不足是會互相殘食，致使其生長懸殊較大。如此可見，僅從表型判斷大口黑鱸親本質量往往達不到理想的效果。隨著分子生物學和遺傳學的發展，已涌現出很多種遺傳標記，如AFLP、RAPD, SSR、SNP等標記，其中，SNP標記因分布廣泛，適宜高通量自動化分析，遺傳穩定，日益成為遺傳育種研究中首選的遺傳標記。若這些遺傳標記能與生產性狀相關聯在一起，即可實現從DNA水平上進行選擇育種，克服了傳統方法受人為因素影響大的不利因素，提高了選擇的準確性，并且可實現在早期鑒定出具有優良性狀的個體，篩選出優良的后備親本，從而縮短育種周期，加快育種進程。但是，現在未發現與大口黑鱸快速生長有關的基因，這大大影響親本的篩選效果。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與大口黑鱸快速生長有關的基因。本發明的另一個目的在于提供一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法。本發明所采取的技術方案是
大口黑鱸垂體特異性轉錄因子啟動子，其序列如SEQ ID NO. 1所示。一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，包括以下步驟檢測大口黑鱸親本中的大口黑鱸垂體特異性轉錄因子啟動子的序列，選擇序列如SEQ ID NO. 1所示的純合體作為親本。包括如下步驟
1)從待測親本中剪取鰭條樣品，提取DNA;2)以提取得到的DNA為模板，
Pl :5，-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3，(SEQ ID NO. 2) P2 :5，-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3，(SEQ ID NO. 3) 為引物，進行初次PCR擴增，得到初次PCR產物；
3)以初次PCR產物為模板，
P3 :5，-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3，(SEQ ID NO. 4) P4 5' -CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3，(SEQ ID NO. 5) 為引物，進行二次PCR擴增，得到二次PCR產物；
4)對二次PCR產物進行分析，確定待測親本的垂體特異性轉錄因子啟動子的是否為 SEQ ID NO. 1所示序列的純合體。使用內切酶BsrB I對二次PCR產物進行單酶切，之后對酶切產物進行電泳分析確定待測親本的啟動子的是否為SEQ ID NO. 1所示序列的純合體。初次PCR擴增的反應體系為
ddH20 14. 8μ ；
IOXbuffer 2. 0 μ ；
MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；
dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；
上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；
DNA 模板1.0 μ ；
Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。初次PCR擴增的程序為94°C預變性4 min ；94°C變性30秒，53 °C退火90秒，72 °C 延伸30秒，32個循環；72°C延伸10 min。二次PCR擴增的反應體系為
ddH20 14. 8μ ,
IOXbuffer 2.0 μ ,
MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；
dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；
上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；
初次PCR擴增產物1.0 μι;
Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。二次PCR擴增的程序為94°C預變性4 min ；94°C變性30秒，50°C退火15秒，72°C 延伸30秒，32個循環；72°C延伸10 min。申請人:研究發現，在大口黑鱸垂體特異性轉錄因子(pituitary specific transcription factorl, P0UIFI)啟動子序列的-183位置發現一個SNP，用限制性內切酶 BsrA I酶切后有210bp和187bp兩條帶，定為等位基因A和B。在檢測的隨機群體實驗中發現，這個SNP對體重、體長、全長、體高、體寬有顯著影響，其基因型AA和AB的個體的生長性狀明顯優于基因型為BB的個體。因此，根據大口黑鱸啟動子序列設計引物，建立了有效地鑒定具有優良生長性狀且遺傳穩定的親本。利用本方法將生產中BB和AB基因型大口黑鱸親本去除，保留AA基因型的大口黑鱸親本，便可快速獲得生長速度快且遺傳穩定的大口黑鱸的品種。該方法與傳統的方法相比，具有目的性強，作用效果直接的優點，且操作簡單、檢測快速、檢測成本低，便于廣泛推廣使用。本發明的方法，大大降低了大口黑鱸親本篩選的盲目性，可以快速獲得生長速度快且遺傳穩定的大口黑鱸品種。通過酶切之后分析，既保證了檢測結果的可靠性，無需使用專用儀器對PCR產物進行測序分析，提高了處理效率。
具體實施例方式研究發現，在大口黑鱸垂體特異性轉錄因子(pituitary specific transcription factorl, P0UIFI)啟動子序列的-183位置發現一個SNP，用限制性內切酶 Bsr^ I酶切后有210bp和187bp兩條帶，定為等位基因A和B。等位基因A的序列如SEQ ID NO: 1所示，SEQ ID NO: 1所示序列的第_183bp的T突變為G即得到等位基因B。本實驗用于關聯分析的樣本數為1 的隨機群體M為同一批繁殖、同池養殖，且采樣時間一致，因此在建立模型時不考慮時間、環境及人工飼養條件的差異。不同基因型個體間生長性狀的多重比較結果見表3-3，關聯分析結果表明，兩個SNPs所構成的單倍型對體重、體長、全長、體高、體寬有顯著影響(/X0. 05)，基因型為AA和AB的個體的生長性狀明顯優于基因型為BB的個體。
權利要求
1.大口黑鱸垂體特異性轉錄因子啟動子，其序列如SEQID NO. 1所示。
2.一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，包括以下步驟檢測大口黑鱸親本中的大口黑鱸垂體特異性轉錄因子啟動子的序列，選擇序列如SEQ ID NO. 1所示的純合體作為親本。
3.根據權利要求2所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，包括如下步驟1)從待測親本中剪取鰭條樣品，提取DNA；2)以提取得到的DNA為模板，Pl :5，-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3，(SEQ ID NO. 2) P2 :5，-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3，(SEQ ID NO. 3) 為引物，進行初次PCR擴增，得到初次PCR產物；3)以初次PCR產物為模板，P3 :5，-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3，(SEQ ID NO. 4) P4 :5，-CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3，(SEQ ID NO. 5) 為引物，進行二次PCR擴增，得到二次PCR產物；4)對二次PCR產物進行分析，確定待測親本的垂體特異性轉錄因子啟動子的是否為 SEQ ID NO. 1所示序列的純合體。
4.根據權利要求3所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，其特征在于使用內切酶BsrB I對二次PCR產物進行單酶切，之后對酶切產物進行電泳分析確定待測親本的啟動子的是否為SEQ ID NO. 1所示序列的純合體。
5.根據權利要求3所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，其特征在于初次 PCR擴增的反應體系為ddH20 14. 8μ ；IOXbuffer 2. 0 μ ；MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；DNA 模板1.0 μ ；Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。
6.根據權利要求3或5所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，其特征在于 初次PCR擴增的程序為94°C預變性4 min ；94°C變性30秒，53°C退火90秒，72°C延伸30 秒，32個循環；72°C延伸10 min。
7.根據權利要求3所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，其特征在于二次 PCR擴增的反應體系為ddH20 14. 8μ ,IOXbuffer 2.0 μ ,MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；上下游引物(20 Mmol/L)各 0. 4 μ ； 初次PCR擴增產物1.0 μι;Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。
8.根據權利要求3或7所述的一種快速生長大口黑鱸親本的篩選方法，其特征在于 二次PCR擴增的程序為94°C預變性4 min ；94°C變性30秒，50°C退火15秒，72°C延伸30 秒，32個循環；72°C延伸10 min。
全文摘要
本發明公開了大口黑鱸快速生長基因及親本篩選方法，生長基因其序列如SEQIDNO.1所示。該基因對大口黑鱸的體重、體長、全長、體高、體寬有顯著影響。通過檢測這一基因在大口黑鱸中是否為純合，可以快速、準確地篩選出生長性狀優異的親本。該方法與傳統的方法相比，具有目的性強，作用效果直接的優點，且操作簡單、檢測快速、檢測成本低，便于廣泛推廣使用。
文檔編號C12N15/113GK102242121SQ20111013700
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者于凌云, 李勝杰, 李镕, 杜芳芳, 樊佳佳, 白俊杰, 馬冬梅 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所