專利名稱：篩選耐熱性奶牛的HSP70AlA基因SNP位點、應用及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選耐熱性奶牛的SNP位點，具體地說是利用HSP70A1A基因第 6400位、6600位和6601位堿基多態性預測奶牛耐熱性，屬于家畜分子生物學技術領域。
背景技術：
奶牛熱應激指當奶牛受到超過本身體溫調節能力的過高溫度剌激時，作用于垂 體_腎上腺皮質系統引起機體的非特異性防御反應和特異性障礙的全身性適應癥。我國 飼養的奶牛品種大多是來源于北歐的荷斯坦牛，此品種產奶性能高，體型大，相對散熱面積 小，汗腺機能不發達，不能很好地利用皮膚散熱，在產乳和新陳代謝過程中的熱量大，且該 品種奶牛的采食量大，飼料在瘤胃中發酵而產生大量熱量。溫度、品系、泌乳階段、胎次等對 奶牛耐熱性也有一定的影響。隨著全球氣候變暖，我國夏季高溫時間逐漸加長，使牛特別是 奶牛夏季容易發生熱應激。奶牛機體長時間處在熱應激的環境中，可導致機體的免疫力下 降。高溫不同程度地降低了機體細胞免疫和體液免疫的能力，有利于病原微生物的孳生繁 殖，使奶牛對疾病抵抗力降低。因而，乳腺炎、胎衣不下和子宮內膜炎增加。熱應激可導致 奶牛新陳代謝紊亂，采食量減少，生產性能下降，繁殖力降低，免疫力降低，易感染乳腺炎、 胎衣不下、子宮內膜炎等疾病，嚴重時可導致中暑，甚至死亡。奶牛熱應激已成為目前困擾
我國奶牛養殖業的頭號難題。奶牛的最適生活溫度是-rc-i5t:。在2rc以上，氣溫每升 高o.et:奶牛采食量下降1.4kg，致使機體營養攝入量不足，此時溫度每升高rc，產奶量下
降0. lSkg-O. 68kg。據報道，按持續高溫90天計算， 一頭產奶量中等的萬頭牛場，因熱應激 造成的經濟損失就達36. 5萬元(屈軍梅，李文平.2005)。 目前，紅細胞鉀是比較公認的評定奶牛耐熱性指標。紅細胞鉀的研究工作源于綿 羊，Evans (Evans. 1954)首次發現了英國品種綿羊個體間的差異，并劃分為高鉀(HK)和低 鉀(LK)兩個類型，隨后，證明成年牛同一個體在不同時期中紅細胞鉀含量相對恒定，且LK 型容易適應酷暑和干旱的環境(Evans， Mounib. 1957)。 Evans(1963)在這一啟示下開始研 究婆羅門公牛、短角牛、南非瘤牛和海福特牛等及其雜種，發現耐熱性最強的南非瘤牛和婆 羅門公牛紅細胞鉀含量最低，故認為其可作為牛耐熱性的可靠指標。Comberg(1969)用3 對同卵荷斯坦孿生犢牛證明了這一結果，并闡明孿生對內差異不顯著，而各對間存在差異。 穆玉云(1993)等在南京的試驗驗證了相同環境條件下耐熱奶牛和不耐熱奶牛紅細胞鉀含 量差異顯著。近年來研究表明，紅細胞鉀與耐熱性呈負相關，不受性別與年齡的限制，遺傳 力高，測定簡單，重復率高，可作為耐熱性遺傳標記物(史彬林等.1993)。荷斯坦牛不同場 別、不同胎次、不同產犢月份紅細胞鉀含量差異不顯著，證明紅細胞鉀含量基本穩定，不受 營養、生理和環境因素影響，是由遺傳因素決定的(穆玉云.1990)。這與曹靖寶(1997)、賴 登明(1997)、劉玉慶(1997)等的研究結果一致。 1962年Ritossa首次發現在熱環境中基因轉錄增強，1974年Tissiereso利用 SDS-PAGE分離得到熱應激反應產生的一組新蛋白質-HSP。隨后，研究發現HSP70是HSP 家族最重要的一組蛋白質。熱休克蛋白70(Heat shock protein 70， HSP70)作為最為重要的分子伴侶參與動物的熱應激反應，通過其分子伴侶作用參與新生蛋白質折疊、轉運、損 傷蛋白質的修復、異常聚集蛋白質的降解，抗原呈遞等許多重要體內過程，從而在生物體 正常和應激條件下發揮重要作用。大量研究表明，HSP70家族與耐熱性的獲得有關，其能 使熱誘導的變性蛋白盡快恢復自然狀態(Bosch等，1988 ;Morimoto等，1990 ;Sanchez等， 1993 ;Maloyan等，1999)。動物在熱應激時，機體內HSP70迅速被誘導(鮑恩東等，2004)， 隨著HSP70表達增強，機體對熱的耐受能力增強(Krobitsch etal. ，2000);給正常細胞轉 入HSP70基因，細胞耐熱力增強。Zhen等(2006)研究發現，基因的突變影響動物的耐熱性， 具有某些特定基因型的動物的耐熱性高。 隨著分子數量遺傳學的發展，關聯分析成為研究功能候選基因的一種可靠方法， 即利用候選基因多態性與能夠說明某一性狀的指標建立相關模型進行統計分析，從而找到 顯著影響某一性狀的分子標記。如奶牛的體細胞評分(SCS)可作為奶牛乳腺炎水平的可靠 指標，因此人們通過功能基因多態性與SCS進行關聯分析就可得到顯著影響奶牛乳腺炎抗 性的分子標記。利用這種方法，人們在奶牛中得到了大量的乳蛋白、乳脂以及產奶量的分子 標記。劉慶華、梁學武(2006)利用PCR-SSCP技術研究發現HSP70A1A基因5'側翼區AC基 因型耐熱性能高于其他基因型。陳強(2007)推測HSP70A1A基因的A基因可能是耐熱基因， B基因為不耐熱基因。因此，我們進一步研究HSP70A1A基因SNP與奶牛耐熱性狀的關系，確 定HSP70A1A基因耐熱單倍型組合。
發明內容
本發明的目的提出一種用于篩選耐熱性奶牛的HSP70A1A基因的SNP位點；
本發明的第二目的在于提出利用上述HSP70A1A基因SNP位點單倍型組合篩選耐 熱性奶牛的方法； 本發明的第三目的在于，通過上述單倍型組合與奶牛耐熱性狀的關系，進而提供 一種新的篩選耐熱性奶牛的試劑盒，為奶牛的標記輔助選擇提供新的分子標記，可進行奶 牛的早期篩選。 為實現上述目的，本發明的發明思路為提出的一個新的奶牛HSP70A1A基因的單 倍型組合H2H3 (GCG/CTA)，是檢測奶牛自GenBank Accession NoAY149619. 1中第6400位脫 氧核糖核苷酸是G還是C，第6600位脫氧核糖核苷酸是C還是T，第6601位脫氧核糖核苷 酸是G還是A，確定所述奶牛在這3個位點的單倍型組合，然后通過單倍型組合確定耐熱性 狀。 本發明具體技術方案如下 —種篩選耐熱性奶牛的SNP位點，所述SNP位點為奶牛HSP70A1A基因第6400位、 第6600位和第6601位堿基。所述奶牛HSP70A1A基因第6400位為G/C、第6600位為C/T和第6601位為G/A。
—種篩選耐熱性奶牛的方法，所述方法為提取奶牛基因組DNA，測定奶牛 HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位堿基多態性，根據奶牛第6400位、6600位和 6601位的單倍型組合預測奶牛的耐熱性。 所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位基因單倍型組合為GCG/CTA 基因型時，奶牛耐熱性最強。所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、660Q位和6601位基因單倍型組合為GCG/CTG基因型時，奶牛耐熱性最差。 所述單倍型組合按照如下方法確定如果自GenBank Accession NoAY149619. 1中 第6400位脫氧核糖核苷酸是G，其純合體的基因型為GG ;如果第6400位脫氧核糖核苷酸 是C，其純合體的基因型為CC ;它們的雜合體基因型為GC。如第6600位脫氧核糖核苷酸是 C，其純合體的基因型為CC ;如第6600位脫氧核糖核苷酸是T，其純合體的基因型為TT ;它 們的雜合體基因型為CT。如第6601位脫氧核糖核苷酸是G，其純合體的基因型為GG ;如第 6601位脫氧核糖核苷酸是A，其純合體的基因型為AA ;它們的雜合體基因型為GA。 3位點 組合后發現6單倍型組合，即H1H1 (GCA/GCA) 、 H1H2 (GCA/GCG) 、 H2H2 (GCG/GCG) 、 H2H3 (GCG/ CTA)、 H2H4 (GCG/CTG)和H4H4(CTG/CTG)。 上述篩選耐熱性奶牛的引物具有序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的堿基 序列。所述引物可以特異性擴增出含HSP70A1A基因的SEQ ID NO. l所示序列。
—種篩選耐熱性奶牛的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為100頭牛檢測劑量，試 劑盒的保存溫度為-2(TC，所述引物具有序列表SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3所示的堿基序
列；試劑盒組成如下 120ii L IOXPCR緩沖液； 24ii L 10mM dNTP ; 10 ii L 5unit/ ii L Taq DNA聚合酶; 10mM的上下游引物各24ii L ; 25,1/L MgCl2 75 u L ; 1ml純水。 所述試劑盒還包括與HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位突變結合的探針
和識別HSP70A1A基因中第6400位、6600位和6601位突變的限制性內切酶。 所述的突變選自以下單核苷酸多態性 6400位G — C ;6600位C — T ;6601位G — A ; 其中，核苷酸位置編號基于No.AY149619. 1。 本發明提出了 HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位SNP堿基位點用 于制備篩選耐熱性奶牛的試劑盒的新應用。 在實際應用中，本發明確定的耐熱性狀可作為奶牛育種的輔助選擇標記。 H2H3 (GCG/CTA)單倍型組合個體的耐熱性高于所述其他單倍型組合個體，H2H4 (GCG/CTG) 單倍型組合個體的耐熱性低于所述其他單倍型組合個體。 本發明提供的檢測奶牛HSP70A1A基因的H2H3 (GCG/CTA)單倍型組合包括如下步 驟 (1)利用常規的苯酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，DNA樣品被稀釋成50ng/ii1備 用。 (2)PCR-SSCP技術檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性 6400位G — C ;6600位C — T ;6601位G — A ; 其中，核苷酸位置編號基于GenBank索引號AY149619. 1。 (3)針對3個突變設計奶牛HSP70A1A基因特異性引物，進行PCR反應，得到特定片 段(如序列表SEQ ID NO :1所示)的擴增產物，所述的擴增產物長度為549bp。
(4) PCR-SSCP技術檢測擴增產物6400位單核苷酸多態位點G/C、6600位單核苷酸 多態位點C/T和6601位單核苷酸多態位點G/A的多態性。PCR-SSCP的電泳圖譜若得到條 帶1、3，其單倍型組合為H1H1 ;若得到條帶1、2、3和4，其單倍型組合為H1H2 ;若得到條帶2、 4，其單倍型組合為H2H2 ;若得到條帶1、3、5和6，其單倍型組合為H2H3 ;若得到條帶2、4、5 和6，其單倍型組合為H2H4 ;若得到條帶5、6，其單倍型組合為H4H4。 (5)共分離鑒定出6種單倍型組合，對于本領域普通技術人員來說，單倍型的構建
方法可以根據需要而改變，只要適合檢測本發明的單倍型即可。 本發明的優點及有益效果 (1)在奶牛HSP70A1A基因6400位、6600位和6601位鑒定出3個突變位點，并分 離鑒定出一個單倍型組合H2H3，經國際基因組數據庫和文獻專利檢索，證明為新的SNP和 單倍型組合。 (2)經將上述的單倍型組合與奶牛群549頭中國荷斯坦牛個體的耐熱性狀進行相 關性分析，新分離鑒定出的一個單倍型組合H2H3與奶牛耐熱性狀顯著相關，可以用于奶牛 的早期篩選，從而減低飼養成本，增加產品的附加值。 (3)所發明的試劑盒只用一次SSCP電泳就可檢測3個突變位點，簡單方便，可用于 早期檢測以提高檢測效率，降低檢測成本。
圖1為奶牛HSP70A1A基因不同單倍型組合PCR-SSCP分型結果；
圖2為奶牛HSP70A1A基因不同單倍型組合測序結果。
具體實施例方式
本發明針對中國荷斯坦牛HSP70A1A基因進行了深入的研究，發現3個新的SNPs 位點，針對這3個SNPs位點組成的單倍型組合進行分析，其中統計分析結果顯示，奶牛 HSP70A1A基因的單倍型組合H2H3的紅細胞鉀濃度顯著低于H2H4，單倍型組合H2H3為耐 熱單倍型組合，H2H3單倍型組合個體的耐熱系數顯著高于H2H4和H4H4單倍型組合(P < 0. 05)，其產奶量下降率顯著低于不耐熱的H2H4單倍型組合個體，進一步說明其為耐熱 單倍型。因此這個單倍型組合可作為檢測奶牛耐熱性狀的特異性單倍型組合，用于奶牛的 標記輔助選種和選配。在此基礎上完成了本發明。 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
實施例1單倍型組合及突變位點的確定 本發明采用PCR-SSCP和PCR測序技術對奶牛HSP70A1A基因突變進行篩查，通過 SSCP電泳條帶分析及測序結果比對，確定了 6400位、6600位和6601位3個突變位點，6種
單倍型組合。 1. 1采集奶牛頸靜脈血液(本發明所使用的荷斯坦牛頸靜脈血液取自山東省規 模化牛場，包括濟南佳寶、青島奧新苑、泰安金蘭。即本發明所用血樣的直接來源和原始來源)，ACD抗凝，利用常規的苯酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，DNA樣品被稀釋成50ng/ y L 備用。實驗牛共540頭，來自山東省內的規模化奶牛場。
1.2引物設計根據Genbank登錄號為AY149619. 1的HSP70A1A的基因序列，用 PrimerPremier5. 0軟件設計引物，所設計引物的序列、擴增產物的片段長度見表1。
表1PCR擴增所用的引物
引物名稱序列(5' -3')起止位置長度
上游引物TAAAGCCACCACGATGTTbp
下游引物TGAAGGTTCCACCGCAAT 1.3PCR擴增 12 ii L的反應體系模板(50ng/ yl) 1 y L， 10mM的dNTP 0. 24 ii L， lOXPCRbuffer 1. 2 ii L， 10 ii mol/L上下游引物各0. 24 ii L， 25,1/1 MgCl20. 75 ii L， Taq酶0. 5U。
PCR反應條件95。C變性5min， 94。C變性30s， 61。C退火30s， 72。C延伸30s， 35個循 環;72。C延伸7min， 16"C保存。
1. 4SSCP分析及測序 PCR產物95。C變性10min后，立即置冰盒上放入-20°〇冰箱中10min后進行點樣， 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1XTBE， 150V， 12h，銀染顯色，觀察PCR-SSCP電泳 圖譜并拍照，判斷分析HSP70A1A基因的多態性。 如圖1所示，為奶牛HSP70A1A基因不同單倍型組合PCR-SSCP分型結果。PCR-SSCP 的電泳圖譜共發現6種單倍型組合，分別為H1H1 (具有電泳條帶1、3) 、H1H2 (具有電泳條帶 1、2、3和4) 、 H2H2 (具有電泳條帶2、4) 、 H2H3 (具有電泳條帶1、3、5和6) 、 H2H4(具有電泳 條帶2、4、5和6)和H4H4(具有電泳條帶5、6)。 每種單倍型組合分別取3頭個體的PCR產物經純化后，用ABI 3770 DNA測序儀 進行序列的判讀和SNP確認。如圖2所示，為HSP70A1A基因不同單倍型組合測序結果，測 序分析表明，這6種單倍型組合在3個位點的單核苷酸情況為H1H1 :GCA/GCA、 H1H2 :GCA/ GCG、H2H2 :GCG/GCG、H2H3 :GCG/CTA、 H2H4 :GCG/CTG和H4H4 :CTG/CTG。在HSP70A1A基因共 發現4種單倍型，分別是Hl (GCA) 、 H2 (GCG) 、 H3 (CTG)和H4 (CTA)，單倍型頻率分別0. 2787、 0. 4065、0. 1361和0. 1787。本領域普通技術人員已知，上述單倍型的構建方法可以根據需 要而改變，只要適合檢測本發明的單倍型即可。
實施例2HSP70A1A基因單倍型組合與奶牛耐熱性的相關 紅細胞鉀濃度的測定牛尾靜脈采血5ml，3000r/min離心10min棄去血漿。向紅細 胞中加入5ml生理鹽水，7000r/min離心8min，重復洗三遍，準確吸0. 5ml紅細胞，注入小試 管，標號冷藏，然后送山東省農科院中心實驗室用原子吸收分光光度計測定紅細胞鉀含量。
耐熱系數是Rhoad(1944)創立測定的，公式如下耐熱系數=100-18 (BT-38. 3°C) 其中BT為試驗時測得的平均體溫，38. 3t:為牛的正常體溫，18為體溫變化改變為基本單位 的系數，100為維持體溫在正常體溫的完全效率。 最小二乘方差分析采用SAS8. 2 (Statistical Analysis System)軟件的ANOVA-Linear Models程序，建立下列模型，對紅細胞鉀離子濃度與基因型和單倍型進行最
小二乘分析和顯著性檢驗，其模型為
Yijkl = +Gi+Ej+Sk+P1+eijkl 公式中Yijkl為第i個個體表型的記錄值，P為群體平均值，&為第i個個體的基 因效應值，Ej為環境效應值，Sk為季節的固定效應，^為胎次的固定效應，eijk為隨機位差。 如表2所示。 表2奶牛HSP70A1A基因單倍型組合與耐熱性各項指標的最小二乘分析(最小二
乘均值±標準誤，LSM士SE)
單倍型組合個體數紅細胞鉀濃度耐熱系數產奶量下降率
GenotypeNumber(mg/L)(%)
H皿80599. 66±20. 1867. 00±2. 7326. 37±1. 93a
H1H2141594. 35±47. 7573. 07±9. 5834. 62±4. 91
H2H3147577. 68±31. 41 "84. 11±5. 6T25. 25±4. 17A
H2H231659. 01±39. 5166. 14±1. 9738. 76±2. 56
H2H489714. 12±67. 27h64. 50土8. 68 h44. 58±7. 89hB
H4H452698. 46±52. 8563. 08±7. 00 h33. 39±4. 75 注同一位點不同字母間的差異水平，a， b : (P < 0. 05) ;A， B : (P < 0. 01)。 由表2可知，奶牛HSP70A1A基因H2H3單倍型組合個體的紅細胞鉀濃度顯著低于 H2H4 (P < 0. 05)，有研究表明奶牛血鉀濃度與耐熱性能成顯著負相關，紅細胞鉀濃度越低 耐熱性能越強，H2H3為耐熱單倍型組合。H2H3單倍型組合個體的耐熱系數顯著高于H2H4 和H4H4單倍型組合(P < 0. 05) ， H2H3單倍型組合個體的產奶量下降率顯著低于不耐熱的 H2H4單倍型組合個體(P < 0. 01)，進一步說明H2H3為耐熱單倍型組合。這在奶牛選育和 品種改良上具有潛在的應用價值。據此，育種工作者可以指導牛的早期篩選，從而降低飼養 成本，增加產品的附加值。可見，奶牛HSP70A1A基因單倍型組合在奶牛的標記輔助選種和 選配中有重要的應用前景。因此這個單倍型組合可作為檢測奶牛耐熱性狀的特異性單倍型 組合。 實施例3檢測試劑盒 基于HSP70A1A基因單倍型組合標記篩選奶牛的試劑盒，如實施例1所述， AY149619. 1中的6400位G — C、6600位C — T和6601位G — A突變構建的單倍型組合與 奶牛的耐熱性狀密切相關。因此，可基于這3個SNP位點設計HSFl基因特異性引物進行擴 增和檢測。 制備檢測奶牛耐熱性的試劑盒(100次)，組成如下表3所示 表3名稱
序列(5' -3')
濃度
PI引物
Forward: GCCATGAAGCAGTAGGTC
lOOti mol/L
Reverse: GGGGTAAGTCTGGTTACGAC
PCR反應液
含7s。酶、dNTP、鎂離子、PCR反應緩沖液 具體組成及用量為120ii L 10XPCR緩沖液，24ii L 10mM dNTP， 10 ii L(5unit/ iiL)Taq DNA聚合酶，10mM的上下游引物各24 ii L， 25mmol/L MgCl275 ii L， lml純水。
采集牛血液，提取總DNA，按實施例1所述方法進行反應。將試劑盒中的PCR引物 稀釋到1 ii mol/L，以所提取的DNA為模板用上述試劑盒進行PCR反應。PCR反應條件95°C 變性5min，94。C變性30s，61。C退火30s，72。C延伸30s，35個循環；72。C延伸7min，16。C保 存。按實施例1所述方法對擴增產物單倍型組合進行確認。 應用檢測試劑盒對100頭奶牛進行檢測，有28頭牛為H2H3單倍型，而這28頭牛 中有27頭牛為耐熱型(耐熱系數> 80，產奶量下降率低于25% )，因此本發明試劑盒準確 性可達96%以上。根據本發明提供的標記方法，如果用AY149619. 1中的6400位C、6600位和6601 位突變結合的探針或直接測序也可以檢測出AY149619. 1中第6400位G —C、6600位C —T 和6601位G —A突變。
本發明具有實用性的例證 1)本發明的HSP70A1A基因多態性的檢測方法可用于分析牛23號染色體的 HSP70A1A基因上的3個SNPs位點，應用于牛耐熱性的早期診斷，以利于培育耐熱牛品種。
2)本發明建立的檢測HSP70A1A基因多態性的核苷酸序列和耐熱性相關位點，可 高靈敏度、特異性地應用于牛耐熱性基因診斷的試劑盒。 如上所述，得出結論，HSP70A1A基因在第6400位C、6600位和6601位堿基的多態 性與牛耐熱性具顯著相關性。因此，根據本發明，測定此多態性可用于進行基因診斷。
本發明敘述了 HSP70A1A基因耐熱性相關的新突變位點，并提供了 一種測定 HSP70A1A基因多態性的方法。而且，根據本發明，只需要少量DNA樣品就足以測定HSP70A1A 基因3個位點多態性。結果，本發明提供了一種測定牛耐熱性相關單倍型組合的基因診斷 方法。 序列表 〈110〉山東奧克斯生物技術有限公司 〈120〉 一種用于篩選奶牛耐熱性的HSP70A1A基因單倍型組合及其應用
〈160>3
〈210>1
〈211>549
〈212>DNA 〈213>牛(Bos Ta訓s， bovine)
〈400〉 1TAAAGCCACC ACGATGTTTC AGCCAAAGTT GAGAAAAACC ACTGTACCAG AGGCTATTCC 60
TGATTATTTTTTAGAGGTATGGGGACAAGAGAGAGGGAGGAGAGGAAGGTGTTAGTGCTT120CCAGGAGCAGCAGCTGGTGGCAAGGGATTTTCTGCTGTGAATCAAAGCTGGAAAGGCCTT180AAAGTGTTGATTCACTGGCAGCAGTAGTAATGCTAAACTTTAGGGAAATTGCCACCAACA240GCTTAATAGGCCAAAAAAGAGAATTCCTGAAGCTGGGTCAATTAATTTCATGAGTCCTCA300CTAGGGAAATGGCTCATTAGAAAGCAACATCAGGGCGTCATTTCCTGGCCCTCCAGCGGT360TAGGACTCAGTGCTTTCATTGCCAGGGCCTGGGTTCGATCCCTGGTGGAAGTAAAATCCC420ACAAGCAGTGAGGCTTAGCCAAAGTAATTAACACAGAACTTACAAAAAAAAGATATGAGC■CATGGAGGAGTTCGCTTGCTTAGGAGCCTTGCCCATGGAGAATTGTGGATGATTGCGGTG540GAACCTTCA549〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>2TAAAGCCACCACGATGTT18〈210>3 [o川]〈211>20 〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>3GGGGTAAGTCTGGTTACGAC20
權利要求
一種篩選耐熱性奶牛的SNP位點，其特征在于，所述SNP位點為奶牛HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位堿基。
2. 根據權利要求l所述的篩選耐熱性奶牛的SNP位點，其特征在于，所述奶牛HSP70A1A基因第6400位為G/C、第6600位為C/T和第6601位為G/A。
3. —種篩選耐熱性奶牛的方法，其特征在于，所述方法為提取奶牛基因組DNA，測定奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位堿基多態性，根據奶牛第6400位、6600位和6601位的單倍型組合預測奶牛的耐熱性。
4. 根據權利要求3所述的篩選耐熱性奶牛的方法，其特征在于，所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位基因單倍型組合為GCG/CTA基因型時，奶牛耐熱性最強。
5. 根據權利要求3或4所述的篩選耐熱性奶牛的方法，其特征在于，所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位基因單倍型組合為GCG/CTG基因型時，奶牛耐熱性最差。
6. —種篩選耐熱性奶牛的引物，其特征在于，所述引物具有序列表SEQ ID N0.2和SEQID NO. 3所示的堿基序列。
7. 根據權利要求6所述的篩選耐熱性奶牛的引物，其特征在于，所述引物可以特異性擴增出含HSP70A1A基因的SEQ ID NO. 1所示序列。
8. —種篩選耐熱性奶牛的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為IOO頭牛檢測劑量，試劑盒的保存溫度為_201:，試劑盒包括120 ii L IOXPCR緩沖液；24 ii L 10mM d證；10 ii L 5unit/ ii L Taq DNA聚合酶；lOmM的上下游引物各24iiL;25,1/L MgCl2 75 ii L ;lml純水。所述引物具有序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。
9. 根據權利要求8所述的篩選耐熱性奶牛的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括與HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位突變結合的探針和識別HSP70A1A基因中第6400位、6600位和6601位突變的限制性內切酶。
10. HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位SNP堿基位點用于制備篩選耐熱性奶牛試劑盒的應用。
全文摘要
本發明涉及一種篩選耐熱性奶牛的SNP位點及檢測方法，所述SNP位點為奶牛HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位堿基。通過提取奶牛的基因組DNA，測定奶牛熱休克蛋白70A1A(HSP70A1A)基因單倍型組合，預測奶牛的耐熱性HSP70A1A基因單倍型組合為H2H3時，奶牛的耐熱性最強；HSF1基因單倍型組合為H2H4時，奶牛的耐熱性最差。本發明的優點是首次闡明了HSP70A1A基因3個多態性位點組合與奶牛耐熱性的相關性，提供了一種預測奶牛耐熱性的方法，還提供了用于該方法的試劑盒，為奶牛的標記輔助選種和選配提供了新的分子標記方法。
文檔編號C12N15/11GK101693923SQ20091021077
公開日2010年4月14日 申請日期2009年11月9日 優先權日2009年11月9日
發明者仲躋峰, 李建斌, 李秋玲, 王長法 申請人:山東奧克斯生物技術有限公司;