本發明涉及生物(wu)技術領域，特(te)別(bie)涉及一(yi)種漢坦病毒S基因克隆、表達(da)、單克隆抗體(ti)的制備方(fang)法(fa)，及單克隆抗體(ti)的應用。

背景技術：

漢坦(tan)(tan)(tan)病毒(du)(du)(du)(du)(Hantavirus，HV)屬布尼亞病毒(du)(du)(du)(du)科，是一種分(fen)(fen)節段(duan)的(de)(de)(de)(de)單股負鏈RNA病毒(du)(du)(du)(du)，其會(hui)引起(qi)漢坦(tan)(tan)(tan)病毒(du)(du)(du)(du)肺(fei)綜合征(HPS)和(he)漢坦(tan)(tan)(tan)病毒(du)(du)(du)(du)腎綜合征出血(xue)熱(HFRS)等疾病，人和(he)嚙齒類動物(特(te)別是鼠)均(jun)(jun)可(ke)(ke)(ke)被感(gan)(gan)染(ran)(ran)，其L、M、S基(ji)因(yin)(yin)分(fen)(fen)別編碼依賴RNA的(de)(de)(de)(de)RNA聚合酶、包膜糖蛋(dan)(dan)白(bai)(G1、G2)、及(ji)(ji)核衣殼蛋(dan)(dan)白(bai)(NP)。NP又稱核蛋(dan)(dan)白(bai)，是病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)主要(yao)結構(gou)蛋(dan)(dan)白(bai)，免疫(yi)原性(xing)強，刺激機體(ti)(ti)產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)滴(di)度(du)高、維(wei)持時(shi)間長，在(zai)抗(kang)(kang)(kang)(kang)病毒(du)(du)(du)(du)免疫(yi)中(zhong)起(qi)重要(yao)作用(yong)，不(bu)同株、型的(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)(du)(du)NP氨基(ji)酸序列(lie)保守，均(jun)(jun)攜(xie)帶有T細(xi)胞(bao)(bao)和(he)B細(xi)胞(bao)(bao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原決定(ding)簇，能誘導機體(ti)(ti)產(chan)生(sheng)特(te)異性(xing)體(ti)(ti)液免疫(yi)應(ying)答和(he)細(xi)胞(bao)(bao)免疫(yi)應(ying)答，可(ke)(ke)(ke)直接與體(ti)(ti)外轉錄病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)RNA及(ji)(ji)被感(gan)(gan)染(ran)(ran)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)器結合，起(qi)著調節病毒(du)(du)(du)(du)復制的(de)(de)(de)(de)作用(yong)，常用(yong)作為HV感(gan)(gan)染(ran)(ran)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)診(zhen)(zhen)斷蛋(dan)(dan)白(bai)。目(mu)(mu)前，漢坦(tan)(tan)(tan)病毒(du)(du)(du)(du)感(gan)(gan)染(ran)(ran)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)血(xue)清學診(zhen)(zhen)斷通常采用(yong)病毒(du)(du)(du)(du)感(gan)(gan)染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)等天然抗(kang)(kang)(kang)(kang)原，由(you)于其敏(min)感(gan)(gan)性(xing)、特(te)異性(xing)和(he)可(ke)(ke)(ke)操作性(xing)不(bu)是十分(fen)(fen)理想(xiang)，故考慮(lv)是否可(ke)(ke)(ke)通過基(ji)因(yin)(yin)克隆(long)與表達來獲取具(ju)有良(liang)好的(de)(de)(de)(de)免疫(yi)原性(xing)和(he)免疫(yi)反應(ying)性(xing)的(de)(de)(de)(de)重組(zu)NP，以替代(dai)天然抗(kang)(kang)(kang)(kang)原用(yong)于HV感(gan)(gan)染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)實驗(yan)室診(zhen)(zhen)斷。同時(shi)，在(zai)漢坦(tan)(tan)(tan)病毒(du)(du)(du)(du)感(gan)(gan)染(ran)(ran)后(hou)(hou)鼠組(zu)織(zhi)器官(guan)標(biao)本(ben)中(zhong)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原檢(jian)(jian)測(ce)方面，目(mu)(mu)前尚(shang)沒有高特(te)異性(xing)和(he)高敏(min)感(gan)(gan)性(xing)的(de)(de)(de)(de)單克隆(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)實際應(ying)用(yong)于實驗(yan)室檢(jian)(jian)測(ce)，絕(jue)大部分(fen)(fen)均(jun)(jun)是采用(yong)的(de)(de)(de)(de)多克隆(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，檢(jian)(jian)測(ce)結果存(cun)在(zai)一定(ding)的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing)或(huo)假陰性(xing)，影響(xiang)檢(jian)(jian)測(ce)結果的(de)(de)(de)(de)準(zhun)確(que)性(xing)。

技術實現要素：

鑒于上述狀(zhuang)況，有必要提供一種(zhong)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒S基因克隆、表達、單(dan)克隆抗(kang)體的(de)(de)(de)制備(bei)方法，以(yi)獲得具有良好的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原性和(he)免(mian)疫(yi)反(fan)應性的(de)(de)(de)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒核(he)蛋白(bai)，同時(shi)制備(bei)一種(zhong)高特異(yi)性和(he)高敏感性的(de)(de)(de)抗(kang)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒核(he)蛋白(bai)的(de)(de)(de)單(dan)克隆抗(kang)體而便于檢(jian)測應用。

本(ben)發明(ming)提供一(yi)種漢坦(tan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)S基(ji)因克(ke)(ke)隆(long)、表達(da)、單克(ke)(ke)隆(long)抗體(ti)的(de)制(zhi)備方法(fa)，所述方法(fa)包括：設計一(yi)對擴(kuo)增(zeng)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)S基(ji)因完整開放閱讀框的(de)特異性(xing)引物，通過(guo)RT－PCR擴(kuo)增(zeng)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)S基(ji)因；將擴(kuo)增(zeng)的(de)漢坦(tan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)S基(ji)因克(ke)(ke)隆(long)到pGM－T載體(ti)，轉化Ecoli.TOP10感受(shou)態(tai)細(xi)胞，得到TA克(ke)(ke)隆(long)陽性(xing)質粒；TA克(ke)(ke)隆(long)陽性(xing)質粒克(ke)(ke)隆(long)到pGEX－6p－2原核表達(da)載體(ti)，得到重(zhong)組(zu)質粒pGEX－6P－2/S；將重(zhong)組(zu)質粒pGEX－6P－2/S轉化Ecoli.BL21菌體(ti)中，在經(jing)IPTG誘導表達(da)，得到包涵體(ti)；包涵體(ti)經(jing)溶解與(yu)復性(xing)，得到GST－NP重(zhong)組(zu)蛋白(bai)；GST－NP重(zhong)組(zu)蛋白(bai)免疫Balb/c小鼠；小鼠脾細(xi)胞與(yu)骨髓(sui)瘤(liu)細(xi)胞融(rong)合，選擇性(xing)培養；陽性(xing)克(ke)(ke)隆(long)篩選；以(yi)及單克(ke)(ke)隆(long)抗體(ti)制(zhi)備、亞(ya)型鑒定以(yi)及效價檢(jian)測。

進一步地，所述特異性引物包括上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’和下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’。

進一步(bu)地，所述將擴(kuo)增的(de)漢坦病(bing)毒S基因克(ke)隆(long)(long)到pGM－T載(zai)體(ti)，再轉化(hua)Ecoli.TOP10感(gan)受(shou)態細胞，得(de)到TA克(ke)隆(long)(long)陽性質粒(li)步(bu)驟包(bao)括：擴(kuo)增的(de)漢坦病(bing)毒S基因與pGM－T載(zai)體(ti)以(yi)1：3的(de)比例于22℃下(xia)進行(xing)(xing)連(lian)接反應(ying)(ying)，取(qu)一定(ding)量連(lian)接產(chan)物轉化(hua)Ecoli.TOP10感(gan)受(shou)態細胞，挑選(xuan)陽性克(ke)隆(long)(long)，抽提質粒(li)，應(ying)(ying)用試劑盒進行(xing)(xing)PCR鑒(jian)定(ding)，應(ying)(ying)用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃進行(xing)(xing)雙酶切鑒(jian)定(ding)，以(yi)確定(ding)得(de)到TA克(ke)隆(long)(long)陽性質粒(li)。

進(jin)一(yi)步地，所述TA克(ke)隆(long)陽性質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)克(ke)隆(long)到(dao)pGEX－6p－2原核表達載體，得到(dao)重(zhong)(zhong)組質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S步驟包括：TA克(ke)隆(long)陽性質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)與pGEX－6P－2空質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)在37℃條件下(xia)進(jin)行(xing)EcoRⅠ、XhoⅠ雙(shuang)酶(mei)切(qie)、電泳、目的(de)片(pian)段回收純化，二者在1：5比例下(xia)應用(yong)(yong)T4 DNA連接酶(mei)于22℃連接反應20min，取一(yi)定(ding)量的(de)連接產(chan)物轉化Ecoli.TOP10感(gan)受態細(xi)胞，涂布100μg/mL氨芐青(qing)霉素的(de)LB平板，37℃倒(dao)置培養過夜，挑(tiao)選單克(ke)隆(long)菌落，抽提質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)，取1μl進(jin)行(xing)PCR鑒(jian)定(ding)，應用(yong)(yong)EcoRⅠ、XholⅠ對(dui)重(zhong)(zhong)組質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S進(jin)行(xing)雙(shuang)酶(mei)切(qie)，PCR產(chan)物及(ji)酶(mei)切(qie)產(chan)物于1.0％瓊脂糖凝膠(jiao)電泳，對(dui)重(zhong)(zhong)組質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S進(jin)行(xing)序列測定(ding)。

進一步地，所述包涵體(ti)經(jing)溶解與復性，得(de)到GST－NP重組蛋(dan)白(bai)步驟，還包括GST－NP重組蛋(dan)白(bai)純(chun)化、Western blot鑒定、濃(nong)度(du)測定步驟。

進(jin)一步地，所述(shu)GST－NP重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)，免(mian)疫(yi)Balb/c小(xiao)鼠(shu)步驟(zou)，包括：以重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)GST－NP為免(mian)疫(yi)原(yuan)免(mian)疫(yi)小(xiao)鼠(shu)，初次免(mian)疫(yi)采用(yong)(yong)1mg/ml濃(nong)度(du)的(de)重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)GST－NP0.1ml與(yu)等(deng)(deng)體積完(wan)全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)(zhu)射(she)器混(hun)勻，皮(pi)內(nei)多點注(zhu)(zhu)射(she)；21天(tian)(tian)后(hou)采用(yong)(yong)0.5mg/ml濃(nong)度(du)的(de)重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)GST－NP0.1ml與(yu)等(deng)(deng)體積不完(wan)全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)(zhu)射(she)器混(hun)勻，皮(pi)內(nei)多點注(zhu)(zhu)射(she)，第(di)(di)(di)二次免(mian)疫(yi)；之(zhi)后(hou)每隔14天(tian)(tian)采用(yong)(yong)0.5mg/ml濃(nong)度(du)的(de)重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)GST－NP0.1ml與(yu)等(deng)(deng)體積不完(wan)全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)(zhu)射(she)器混(hun)勻，腹腔直接注(zhu)(zhu)射(she)，第(di)(di)(di)三次、第(di)(di)(di)四次免(mian)疫(yi)；小(xiao)鼠(shu)第(di)(di)(di)四次免(mian)疫(yi)后(hou)第(di)(di)(di)7天(tian)(tian)眼眶處采血待(dai)用(yong)(yong)，即免(mian)疫(yi)小(xiao)鼠(shu)血，并分離(li)血清。

進(jin)一步(bu)(bu)地(di)，所述小鼠(shu)脾細(xi)(xi)胞(bao)與骨髓瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)融合，選擇(ze)(ze)性培(pei)養的步(bu)(bu)驟，包(bao)(bao)括：包(bao)(bao)括：小鼠(shu)脾細(xi)(xi)胞(bao)的制(zhi)備(bei)、脾細(xi)(xi)胞(bao)與骨髓瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)融合以及選擇(ze)(ze)性培(pei)養雜交瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)，重組蛋白GST－NP融合檢測。

本發明還(huan)提供一種漢坦(tan)(tan)病(bing)(bing)毒S基因單克隆(long)抗(kang)體(ti)的應用，所述應用為異硫氰酸熒(ying)光(guang)素標記所制備的單克隆(long)抗(kang)體(ti)，對漢坦(tan)(tan)病(bing)(bing)毒感染陽(yang)性(xing)標本檢測。進一步(bu)地，所述漢坦(tan)(tan)病(bing)(bing)毒感染陽(yang)性(xing)標本采用漢坦(tan)(tan)病(bing)(bing)毒感染的鼠肺組織。

進(jin)一(yi)步地，所(suo)述應(ying)用(yong)為用(yong)PBS調整單克隆細胞株(zhu)的(de)(de)(de)單抗(kang)濃度(du)為10mg/ml，取1mg FITC溶于0.2mlDMSO，滴加于單克隆細胞株(zhu)的(de)(de)(de)單抗(kang)液(ye)內，室溫避(bi)光作用(yong)2h進(jin)行(xing)(xing)交(jiao)聯反應(ying)，交(jiao)聯混合物經葡聚(ju)糖凝膠Sephadex G25柱進(jin)行(xing)(xing)純化，純化后的(de)(de)(de)單克隆抗(kang)體用(yong)含1％FBS的(de)(de)(de)PBS進(jin)行(xing)(xing)1：100稀釋(shi)，常(chang)規IFA法對漢坦病(bing)毒感染的(de)(de)(de)鼠肺組織進(jin)行(xing)(xing)檢(jian)(jian)測，與1：50稀釋(shi)的(de)(de)(de)漢坦病(bing)毒多克隆抗(kang)體檢(jian)(jian)測效果(guo)進(jin)行(xing)(xing)比較。

本(ben)發(fa)明還提供一種漢坦(tan)病(bing)毒S基因單克隆抗體(ti)的(de)應用(yong)，所(suo)述應用(yong)為(wei)用(yong)異硫氰酸熒光素標(biao)記所(suo)制備的(de)單克隆抗體(ti)，對(dui)漢坦(tan)病(bing)毒感染的(de)陽性動物臟器標(biao)本(ben)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

進一(yi)步地，所述(shu)漢坦(tan)(tan)病毒感染(ran)陽性標本(ben)采用漢坦(tan)(tan)病毒感染(ran)的鼠肺組織。

進一步(bu)地(di)，所述(shu)應(ying)用(yong)為用(yong)PBS調整(zheng)單克隆細胞(bao)株單抗濃度(du)為10mg/ml，取1mg FITC溶(rong)于0.2mlDMSO，滴加于單抗液內，室溫避光作用(yong)2h進行(xing)(xing)交(jiao)(jiao)聯(lian)(lian)反應(ying)，交(jiao)(jiao)聯(lian)(lian)混合(he)物經葡聚糖(tang)凝(ning)膠Sephadex G25柱進行(xing)(xing)純(chun)化(hua)，純(chun)化(hua)后(hou)的(de)單克隆抗體用(yong)含1％FBS的(de)PBS進行(xing)(xing)1：100稀釋，常規IFA法對漢(han)坦病毒感染的(de)鼠(shu)肺組(zu)織進行(xing)(xing)檢測，與(yu)1：50稀釋的(de)漢(han)坦病毒多克隆抗體檢測效果進行(xing)(xing)比較。

本發明實施例的技術(shu)方案帶(dai)來的有益(yi)效果是(shi)：上述漢坦病(bing)毒(du)S基(ji)因克隆(long)與表達方法，分離到了(le)純度(du)較(jiao)高(gao)的目的蛋(dan)白(bai)，最大程度(du)地(di)恢復了(le)變性(xing)(xing)后重(zhong)組蛋(dan)白(bai)的生物(wu)活性(xing)(xing)，重(zhong)組蛋(dan)白(bai)GST－NP具有較(jiao)好(hao)的免疫原(yuan)性(xing)(xing)和免疫反應性(xing)(xing)，獲得雜交瘤細胞株(zhu)能穩定(ding)分泌高(gao)效價的單克隆(long)抗(kang)體，經與FITC進行交聯，建(jian)立的IFA試驗能用于(yu)漢坦病(bing)毒(du)感染后鼠組織器官標本中病(bing)毒(du)抗(kang)原(yuan)的檢測。

附圖說明

圖1是本發明實施例的S基(ji)因原核重組(zu)質粒pGEX－6P－2/S構建(jian)結果的瓊脂糖凝膠電泳圖。

其(qi)中：M.1kb DNA ladder；1.PCR陰性(xing)對照；2.RT－PCR；3.重組(zu)(zu)質粒(li)pGEX－6P－2/S為模板的PCR產物；4.空質粒(li)pGEX－6P－2；5.重組(zu)(zu)質粒(li)pGEX－6P－2/S；6.重組(zu)(zu)質粒(li)pGEX－6P－2/S經EcoR I、Xho I雙酶(mei)切；7.重組(zu)(zu)質粒(li)pUCm－T/S經EcoR I、Xho I雙酶(mei)切。

圖(tu)2是本發(fa)明實施例的重組(zu)質粒pGEX－6P－2/S在大(da)腸桿菌中(zhong)的誘導表達結果的SDS－PAGE電(dian)泳圖(tu)。

其中：M：蛋白Marker；1－6：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/LIPTG誘導pGEX－6P－2/S；7：空pGEX－6P－2/S；8：空菌Ecoli.BL21Star(DE3)；9：pGEX－6P－2/S未經IPTG誘導。

圖(tu)3是漢坦病毒核蛋白純(chun)化效果的(de)SDS－PAGE電泳圖(tu)。

其中(zhong)：M：蛋(dan)白Marker；1：pGEX－6P－2/S未經(jing)IPTG誘導(dao)；2：pGEX－6P－2/S經(jing)1.0mmol/LIPTG誘導(dao)；3：過(guo)GST蛋(dan)白純(chun)化柱(zhu)前(qian)；4：過(guo)GST蛋(dan)白純(chun)化柱(zhu)后；5：第一次洗(xi)脫液；6：第二次洗(xi)脫液。

圖4是本(ben)發明實施例的(de)免疫小鼠血清Western Blot檢測(ce)結果的(de)SDS－PAGE電泳(yong)圖。

其中：1249－6至1249－10：分別是(shi)5只免疫小鼠血(xue)清Western Blot的檢測結果。

圖5是(shi)本發明(ming)實施例(li)的(de)多克(ke)隆細胞株篩選階段陽性Western Blot檢測結(jie)果的(de)SDS－PAGE電泳圖。

圖6是本發(fa)明實施例(li)的(de)sub后單克隆細胞株上清(qing)液Western Blot檢(jian)測結果的(de)SDS－PAGE電泳圖。

圖(tu)7是本發明實施例(li)的單克隆細(xi)胞株腹水(shui)效價結(jie)果柱狀圖(tu)。

其中：A：單克(ke)隆細(xi)胞株C3－E8；B：單克(ke)隆細(xi)胞株2－F11。

圖8是(shi)本發明實施例的單克隆抗體的Western blot分析的SDS－PAGE電(dian)泳圖。

其中：1：2－F11株經(jing)1：100稀(xi)釋(shi)(shi)；2：2－F11株經(jing)1：500稀(xi)釋(shi)(shi)；3：C3－E8株經(jing)1：100稀(xi)釋(shi)(shi)；4：C3－E8株經(jing)1：500稀(xi)釋(shi)(shi)。

圖9是本發明實施例的單克隆細胞株腹水純化蛋白檢測儀(yi)吸光(guang)率峰(feng)圖。

其中：A：單克隆細(xi)胞(bao)(bao)株2－F11；B：單克隆細(xi)胞(bao)(bao)株C3－E8。

圖(tu)10是本發明(ming)實施(shi)例的(de)Western Blot方法檢(jian)測純化后抗(kang)體檢(jian)測結果的(de)SDS－PAGE電泳圖(tu)。

其中：1：C3－E8；2：2－F11。

圖11是本發(fa)明(ming)實施例的單克隆抗體對(dui)漢(han)坦病毒(du)感(gan)染(ran)鼠(shu)肺組織(zhi)進行(xing)檢(jian)測(ce)的對(dui)照(zhao)結果圖。

其中：A：C3－E8；B：2－F11；C：1：50稀(xi)釋(shi)的多(duo)克隆抗體；D：陰性對照(zhao)。

具體實施方式

為使(shi)本發(fa)明的目的、技術(shu)方案和優點更加清楚，下面(mian)將結合附圖對本發(fa)明實施例作進一步地詳(xiang)細描述。

一種漢坦病毒(du)S基因克隆(long)、表(biao)達及單克隆(long)抗體制備方法，包括(kuo)如下步驟：

S101：設計一對擴增漢坦病毒(Genbank No.JN712306)S基(ji)因(yin)完(wan)整開(kai)放閱讀框(ORF)的特異性引(yin)物，通過RT－PCR擴增漢坦病毒S基(ji)因(yin)。

其中，擴增漢坦病毒(Genbank No.JN712306)S基因的特異性引物為：上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’(5’端下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)；下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’(5’端下劃線部分為(wei)XholⅠ酶切位點)。

S102：將擴增的漢坦病毒S基因(yin)克(ke)隆(long)到(dao)pGM－T載(zai)體，再轉化Ecoli.TOP10感受態(tai)細胞，得到(dao)TA克(ke)隆(long)陽(yang)性質(zhi)粒。

擴增(zeng)的(de)漢(han)坦病毒S基因(即(ji)PCR產物(wu))與pGM－T載體以1：3的(de)比例于(yu)22℃進行(xing)(xing)(xing)連接反應，取一定量(liang)連接產物(wu)轉化Ecoli.TOP10感(gan)受態細胞，挑選陽性克(ke)隆，抽(chou)提質粒，應用(yong)試劑盒進行(xing)(xing)(xing)PCR鑒定，應用(yong)EcoRⅠ、XhoⅠ于(yu)37℃進行(xing)(xing)(xing)雙酶(mei)切(qie)鑒定，以確(que)定得(de)到TA克(ke)隆陽性質粒。

S103：TA克(ke)隆(long)陽性(xing)質粒(li)克(ke)隆(long)到pGEX－6p－2原核表(biao)達載體，得到重(zhong)組(zu)質粒(li)pGEX－6P－2/S。

TA克(ke)隆陽(yang)性質(zhi)粒(li)與pGEX－6P－2空質(zhi)粒(li)在37℃條件下，同時(shi)進(jin)(jin)行(xing)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切、電(dian)泳(yong)、目的(de)片段回收純化，二(er)者在1：5比例下應(ying)用T4 DNA連接(jie)酶于22℃連接(jie)反應(ying)10min，取一定量的(de)連接(jie)產物轉化Ecoli.TOP10感受態(tai)細胞(bao)，涂(tu)布100μg/mL氨芐青霉素(su)的(de)LB平板，37℃倒置培養過(guo)夜，挑選單克(ke)隆菌落，抽提(ti)質(zhi)粒(li)，取1μl進(jin)(jin)行(xing)PCR鑒定，應(ying)用EcoRⅠ、XholⅠ對重組(zu)(zu)質(zhi)粒(li)進(jin)(jin)行(xing)雙酶切，PCR產物及(ji)酶切產物于1.0％瓊脂糖凝膠電(dian)泳(yong)，對重組(zu)(zu)質(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S進(jin)(jin)行(xing)序列測定。

S104：將重(zhong)組質粒pGEX－6P－2/S轉化Ecoli.BL21菌體(ti)中，在經(jing)IPTG誘導表達，得到包涵體(ti)。

將pGEX－6P－2/S重組質粒轉化工程菌Ecoli.BL21Star(DE3)感受(shou)態細胞，37℃培(pei)(pei)養24h，挑單克隆菌落于含(han)100ug/mL氨芐青霉素的LB培(pei)(pei)養液(ye)中培(pei)(pei)養至OD值為(wei)0.6左右，加(jia)入不(bu)同(tong)濃(nong)度IPTG(0.2mmol/L￣1.2mmol/L)，37℃水浴誘導(dao)培(pei)(pei)養3h－8h，離心(xin)收集菌體。

S105：包涵體經溶解(jie)與復性，得到(dao)GST－NP重組蛋白(bai)。

收(shou)集的菌(jun)體(ti)經冰浴超(chao)聲(sheng)裂解(jie)，應用(yong)洗(xi)液Ⅰ(60mmol/L EDTA，4％Triton X－100，1.5mol/LNaCl，pH7.0)，洗(xi)液Ⅱ(0.1mol/L Tris－Cl，20mmol/L EDTA，2mol/L Urea，pH7.0)洗(xi)滌，收(shou)集上清和包涵體(ti)，12％SDS－PAGE電泳，包涵體(ti)應用(yong)溶(rong)解(jie)液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris－Cl，1mmol/L EDTA，6mmol/L DTT，pH8.0)溶(rong)解(jie)過夜后裝入含GST融合蛋白復(fu)性液(20mmol/LTris－Cl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0，0.9mmol/L GSH，0.1mmol/L GSSG)的透析袋(dai)中復(fu)性48h。

S106：GST－NP重組蛋(dan)白純化、Western blot鑒定(ding)(ding)、濃度測定(ding)(ding)。

將10mL Glutathione Sepharose 4B加(jia)入GST蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)純(chun)化(hua)柱(zhu)，PBS洗滌至柱(zhu)平(ping)衡，以一定(ding)流速加(jia)入10mL的(de)復性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，使蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)充分(fen)(fen)吸(xi)附，PBS洗滌層析柱(zhu)至重新平(ping)衡，超(chao)純(chun)水(shui)洗脫目(mu)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)。洗脫的(de)GST－NP融(rong)合蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)經12％SDS－PAGE電泳分(fen)(fen)離，電轉移至PVDF膜，以抗(kang)GST McAb為一抗(kang)、HRP標記的(de)羊抗(kang)鼠(shu)抗(kang)體為二(er)抗(kang)，ECL顯影(ying)，Western blot鑒定(ding)。在核酸蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)分(fen)(fen)析儀上，采用A280紫外分(fen)(fen)光光度法(fa)，應用BSA蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)濃度標準(zhun)品繪(hui)制標準(zhun)曲線，測定(ding)純(chun)化(hua)后GST－NP濃度。

S107：Balb/c小鼠免疫(yi)。

以重組蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)GST－NP為免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)原免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)小(xiao)鼠(shu)，初次(ci)(ci)(ci)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)采(cai)用(yong)(yong)(yong)1mg/ml濃度(du)(du)的重組蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)GST－NP0.1ml與等體積完(wan)全佐劑注(zhu)射(she)器(qi)混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，皮內(nei)多點注(zhu)射(she)；21天后(hou)(hou)(hou)采(cai)用(yong)(yong)(yong)0.5mg/ml濃度(du)(du)的重組蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)GST－NP0.1ml與等體積不完(wan)全佐劑注(zhu)射(she)器(qi)混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，皮內(nei)多點注(zhu)射(she)，第(di)二(er)次(ci)(ci)(ci)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)；之后(hou)(hou)(hou)每隔14天采(cai)用(yong)(yong)(yong)0.5mg/ml濃度(du)(du)的重組蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)GST－NP0.1ml與等體積不完(wan)全佐劑注(zhu)射(she)器(qi)混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，腹(fu)腔(qiang)直接注(zhu)射(she)，第(di)三次(ci)(ci)(ci)、第(di)四(si)次(ci)(ci)(ci)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)；小(xiao)鼠(shu)第(di)四(si)次(ci)(ci)(ci)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)后(hou)(hou)(hou)第(di)7天眼眶處采(cai)血待用(yong)(yong)(yong)，即免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)小(xiao)鼠(shu)血，并分(fen)離(li)血清。

S108：細胞融合。

將(jiang)末次(ci)免疫后7天的(de)小鼠處死，無菌條件下(xia)取脾臟，制備(bei)脾細胞懸液，按8：1的(de)比例與SP2/0進行融合(he)(he)，融合(he)(he)后的(de)第107用(yong)HAT選擇培養(yang)(yang)(yang)基培養(yang)(yang)(yang)，15天后改換HT培養(yang)(yang)(yang)，20天后用(yong)含10％FCS(Fetal Calf Serum，胎(tai)牛血(xue)清)的(de)DMEM培養(yang)(yang)(yang)。

S109：雜交瘤細胞(bao)株篩選和亞(ya)克隆。

以(yi)純化后1μg/ml的重組核(he)蛋(dan)白包板(ban)，50ul/孔，4℃過夜，間接ELISA法(fa)檢測(ce)雜(za)交瘤細胞培養(yang)上清(qing)，有限(xian)稀(xi)釋法(fa)進(jin)行(xing)亞克隆(long)。

S110：單克(ke)隆細胞株(zhu)腹水(shui)抗(kang)體(ti)制備、純化、亞型鑒定、以(yi)及效價檢測。

小鼠腹腔注射誘導劑Pristane(0.5ml/只)，7天后腹腔注射8×10⁵個雜(za)交(jiao)瘤細胞/只，7天(tian)后收集腹水，1500rpm/m離心，去(qu)油狀物(wu)及沉(chen)淀，通過(guo)Protein G親和層析(xi)柱(zhu)對小(xiao)鼠單克(ke)隆細胞株進行(xing)純(chun)化(hua)，－20℃保存。

以1μg/ml純(chun)化后的重組核蛋(dan)白包(bao)板，50μl/孔，4℃過夜，以1％BSA稀釋(shi)1：4000后的HRP標記的分型(xing)抗體為二(er)抗，ELISA法(fa)對(dui)1：1000稀釋(shi)的小鼠單(dan)克隆細胞株(zhu)腹水進行亞(ya)型(xing)檢(jian)測(ce)。

以(yi)1μg/ml純(chun)化后的重組(zu)核(he)蛋白包板，50μl/孔，4℃過夜，對1：200、1：1000、1：5000、1：10000、1：20000、1：60000、1：240000稀(xi)釋(shi)的小鼠(shu)單克隆(long)細(xi)胞株(zhu)腹水應用ELISA法進行效價檢測。

S111：單(dan)克隆(long)抗體的Western blot分析(xi)。

重組核蛋(dan)白經SDS－PAGE電泳，120mA恒流轉膜2.5h，以(yi)純化后1：100、1：500稀釋(shi)的(de)C3－E8、2－F11為一抗(kang)，以(yi)1：10000稀釋(shi)的(de)HRP標記的(de)羊抗(kang)鼠(shu)IgG為二抗(kang)，通過封閉反(fan)應、抗(kang)體孵育、底物(wu)反(fan)應、曝光顯影，獲得(de)Western blot結果(guo)。

本發明還提(ti)供(gong)一(yi)種漢坦病(bing)毒S基因單克隆抗體的應用(yong)，所述應用(yong)為異(yi)硫氰酸熒光(guang)素標記單克隆抗體，再對漢坦病(bing)毒感染(ran)陽性標本檢測。

用(yong)PBS(PH9.0)調整C3－E8、2－F11單抗(kang)濃度為10mg/ml，取(qu)1mg FITC溶(rong)于(yu)0.2mlDMSO，滴加(jia)于(yu)抗(kang)體液內，室溫避光作用(yong)2h進(jin)(jin)行(xing)交聯(lian)反應，交聯(lian)混(hun)合物經葡(pu)聚糖凝膠Sephadex G25柱(zhu)進(jin)(jin)行(xing)純化。對純化后的C3－E8、2－F11單克(ke)隆(long)抗(kang)體應用(yong)含1％FBS的PBS進(jin)(jin)行(xing)1：100稀(xi)釋(shi)(shi)，建立常規IFA法對漢坦(tan)(tan)病毒感染的鼠肺(fei)組織(zhi)(經IFA、PCR和測序鑒定)進(jin)(jin)行(xing)檢測，與1：50稀(xi)釋(shi)(shi)的漢坦(tan)(tan)病毒多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體(第四軍醫(yi)大)檢測效果進(jin)(jin)行(xing)比(bi)較。

實施例：

1漢(han)坦病(bing)毒S基因克隆(long)、表(biao)達及單克隆(long)抗(kang)體制備方法

1.1質(zhi)粒、菌(jun)株與試劑

質粒(li)pGEX－6P－2(GE Healthcare，USA)，Glutathione Sepharose 4B蛋(dan)白純化柱(GE Healthcare，USA)，抗(kang)GST McAb(Cell Signaling Technology Inc，USA)，Ecoli.BL21Star

(DE3)、JM109(TIANGEN，北(bei)京)，Trizol、One－step RT－PCR System withTaq High Fidelity、PCR Super Mix、Kit(Invitrogen，USA)、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ限(xian)制性(xing)內(nei)切酶、1000bp DNA Marker、低分子量(liang)蛋白Marker(Fermentas，Canada)，膠回收(shou)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒、小量(liang)質粒提取試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒(Axygen，USA)，福氏完全佐劑(ji)(ji)、福氏不(bu)完全佐劑(ji)(ji)、HAT、HT(Sigma，USA)，PEG1500、Isostrip、Pristane(Roche，USA)；DMEM、胎牛血清(Gibco，USA)；Protein G親(qin)和層析柱(zhu)(四季青，中國)；ECL蛋白印跡法檢測試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒(Pierce)；其余(yu)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)均為(wei)國產分析純。

1.2引物設(she)計(ji)與合(he)成

根據前期研究上傳至Genbank的漢坦病毒Hunan03株(Genbank No.JN712306)S基因編碼區序列及質粒pGEX－6P－2多克隆位點，應用Primer Premier 6.0設計一對擴增S基因編碼區全長的特異性引物，為了便于克隆與表達，在引物兩端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點及保護性堿基。上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’(5’端下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)；下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’(5’端下劃(hua)線部(bu)分(fen)為XholⅠ酶切位(wei)點)，委托Invitrogen公司(si)合成。

1.3RNA提(ti)取、cDNA合(he)成及PCR產物純(chun)化回收

Trizol法提取HV鼠肺組織Hunan03株陽性標本總RNA，在引物pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R作用下，應(ying)(ying)用One－step RT－PCR System withTaq High Fidelity試劑(ji)盒對S基(ji)因(yin)ORF區域進行一步法逆(ni)轉錄及擴(kuo)(kuo)增。擴(kuo)(kuo)增產(chan)物經(jing)1.0％瓊脂糖凝膠電(dian)泳，應(ying)(ying)用Axygen膠回收(shou)試劑(ji)盒對產(chan)物進行純化(hua)回收(shou)。

1.4TA克隆與鑒定(ding)

PCR產物(wu)純化回收后，參照(zhao)TA Cloning Kit說明書按照(zhao)PCR產物(wu)與pGM－T載體1：5的比例于22℃進行(xing)連接反應(ying)，取10ul連接產物(wu)轉(zhuan)化Ecoli.TOP10，挑選陽性克隆(long)抽(chou)提質粒，應(ying)用PCR Super Mix試劑(ji)盒進行(xing)PCR鑒定(ding)，應(ying)用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃進行(xing)雙酶切鑒定(ding)。

1.5重組質粒(li)pGEX－6P－2/S的構建與鑒定

擴增的(de)漢坦(tan)病(bing)毒S基因(即(ji)PCR產(chan)物)與pGM－T載體以1：3的(de)比(bi)例(li)于(yu)22℃進(jin)行連接反應，取(qu)一定(ding)量連接產(chan)物轉化Ecoli.TOP10感受(shou)態細胞，鑒定(ding)后的(de)TA克隆陽性質(zhi)粒與pGEX－6P－2空質(zhi)粒在37℃條件下同時進(jin)行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶(mei)切、電泳、目(mu)的(de)片段回收純化。

在1：5比例下(xia)應用T4 DNA連(lian)接酶(mei)于(yu)22℃連(lian)接反應10min，取連(lian)接產物10μl轉化感受態細胞TOP10，涂布100μg/mL氨(an)芐青霉素的LB平(ping)板(ban)，37℃倒置培養(yang)過夜(ye)。挑選單克(ke)隆(long)菌落，抽提(ti)質(zhi)粒，取1μl進行PCR鑒定。應用EcoRⅠ、XholⅠ對重組質(zhi)粒進行雙酶(mei)切，PCR產物及(ji)酶(mei)切產物于(yu)1.0％瓊脂糖凝膠(jiao)電泳，對pGEX－6P－2/S重組質(zhi)粒送Invitrogen公(gong)司(si)進行序列測定。

1.6S基因的表達

將(jiang)pGEX－6P－2/S重組質粒(li)轉化工(gong)程菌Ecoli.BL21Star(DE3)感(gan)受態細胞，37℃培(pei)養(yang)24h，挑(tiao)單克(ke)隆菌落于含100ug/mL氨(an)芐青霉素的(de)LB培(pei)養(yang)液中(2mL)培(pei)養(yang)至OD值(zhi)為(wei)0.6左右，加入不(bu)同濃度(du)IPTG(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L)，37℃水(shui)浴誘導培(pei)養(yang)3h－8h，離心收集(ji)菌體。

1.7包涵體的溶解與復性

收集的菌體(ti)經冰浴(yu)超聲(sheng)裂解，應用(yong)洗(xi)(xi)液Ⅰ(60mmol/L EDTA，4％Triton X－100，1.5mol/LNaCl，pH7.0)，洗(xi)(xi)液Ⅱ(0.1mol/L Tris－Cl，20mmol/L EDTA，2mol/L Urea，pH7.0)洗(xi)(xi)滌，收集上清(qing)和包涵體(ti)，12％SDS－PAGE電(dian)泳。包涵體(ti)應用(yong)溶解液(8mol/L Urea，20mmol/L Tris－Cl，1mmol/L EDTA，6mmol/L DTT，pH8.0)溶解過夜(ye)后裝(zhuang)入含GST融合(he)蛋白(bai)復性(xing)液(20mmol/L Tris－ClpH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0，0.9mmol/L GSH，0.1mmol/L GSSG)的透析(xi)袋中復性(xing)48h。

1.8GST－NP重組(zu)蛋白(bai)純化、Western Blot(蛋白(bai)質(zhi)免疫印跡)

將10mL Glutathione Sepharose 4B加(jia)入GST蛋白(bai)純化柱，PBS洗(xi)滌至(zhi)(zhi)柱平衡，以0.1mL/min流速加(jia)入10mL的復性蛋白(bai)，使蛋白(bai)充分吸(xi)附，PBS洗(xi)滌層析柱至(zhi)(zhi)重新平衡，超純水洗(xi)脫(tuo)目的蛋白(bai)，具(ju)體操作參考GST蛋白(bai)純化柱說明進行。洗(xi)脫(tuo)的GST－NP融(rong)合蛋白(bai)經12％SDS－PAGE電泳分離，電轉移至(zhi)(zhi)PVDF膜，以抗GST McAb為(wei)一抗、HRP標記的羊抗鼠抗體為(wei)二抗，ECL顯影，Western Blot鑒定。

1.9GST－NP重組蛋(dan)白濃度測(ce)定

在核(he)酸蛋白(bai)分(fen)析儀上，采(cai)用A280紫外(wai)分(fen)光光度法，應(ying)用BSA蛋白(bai)濃(nong)(nong)度標準品(pin)繪制標準曲線(xian)，測定(ding)純化(hua)后GST－NP濃(nong)(nong)度。

1.10S基因的PCR擴增(zeng)及TA克(ke)隆鑒定

Trizol提取(qu)后的(de)(de)RNA經pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R引物進行(xing)(xing)一步法RT－PCR擴增(zeng)S基因，1.0％瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠電泳顯示(shi)擴增(zeng)條帶約1306bp，與預(yu)期(qi)大(da)小一致(zhi)，提示(shi)擴增(zeng)的(de)(de)DNA為目的(de)(de)片段。以抽提后的(de)(de)TA克隆質粒為模(mo)板，用pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R引物對(dui)S基因進行(xing)(xing)PCR擴增(zeng)，產物經1.0％瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠電泳，可(ke)見一約1306bp的(de)(de)目的(de)(de)條帶(見圖1)，與預(yu)期(qi)值一致(zhi)。

1.11pGEX－6P－2/S的構建與鑒定

以抽提后的(de)質粒(li)pGEX－6P－2/S為模板，以pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R為引物(wu)進行(xing)PCR擴增(zeng)，可見一約1306bp的(de)目(mu)(mu)的(de)條(tiao)帶(見圖(tu)2)，與(yu)預(yu)期值(zhi)一致(zhi)。用(yong)限制性(xing)(xing)內切酶EcoRⅠ、XholⅠ對重組質粒(li)pGEX－6P－2/S進行(xing)雙(shuang)酶切，得到與(yu)目(mu)(mu)的(de)基(ji)因(1306bp)及載(zai)體(4985bp)相同大(da)小的(de)2個片(pian)段(duan)(見圖(tu)1)。挑取含插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)pGEX－6P－2/S的(de)陽性(xing)(xing)克隆，用(yong)小量質粒(li)提取試(shi)劑(ji)盒提取質粒(li)測序(xu)，結果表明S基(ji)因片(pian)段(duan)已經(jing)成功的(de)插(cha)入(ru)pGEX－6P－2載(zai)體，且(qie)插(cha)入(ru)方向正確。

1.12測序結果分析(xi)

核蛋(dan)白基(ji)因編碼區(qu)以起始密(mi)碼ATG開(kai)始，以終(zhong)止密(mi)碼子(zi)TAA結(jie)尾，ORF長1290個核苷(gan)酸殘基(ji)，包括堿基(ji)A423個(32.79％)，堿基(ji)C244個(18.91％)，堿基(ji)G325個(25.19％)，堿基(ji)T298個(23.10％)，GC含量(liang)為44.11％，AT含量(liang)為55.89％，單(dan)鏈分(fen)子(zi)量(liang)約為391.41kDa，編碼429個氨基(ji)酸(20種)，平均分(fen)子(zi)量(liang)為48.13kDa，含量(liang)最(zui)高的氨基(ji)酸為Leu(亮氨酸)，占(zhan)總蛋(dan)白含量(liang)的9.79％(42/429)，含量(liang)最(zui)低的為Cys(半胱氨酸)和Trp(色氨酸)，僅各占(zhan)1.17％(5/429)。

1.13pGEX－6P－2/S的表達與鑒定

含重組質粒pGEX－6P－2/S的E.coli Star BL21(DE3)菌(jun)(jun)株(zhu)應用不(bu)同濃度IPTG進行誘導，SDS－PAGE凝(ning)膠電(dian)泳(yong)圖上均顯示特異性條(tiao)帶(dai)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)分子量與(yu)理論值一(yi)致(zhi)，約為74kDa。菌(jun)(jun)株(zhu)在(zai)IPTG終(zhong)濃度1.0mmol/L、37℃條(tiao)件下(xia)誘導3h條(tiao)件下(xia)，表(biao)達量最大(da)(見圖2)。菌(jun)(jun)體經超聲(sheng)波破菌(jun)(jun)，包(bao)(bao)涵體經8mol/L尿素溶(rong)解后(hou)過GST親和層析柱，SDS－PAGE凝(ning)膠電(dian)泳(yong)顯示單一(yi)的目的蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)條(tiao)帶(dai)，分子量與(yu)預(yu)期大(da)小一(yi)致(zhi)，約74kDa，融合蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)主要存在(zai)于(yu)不(bu)溶(rong)性的包(bao)(bao)涵體中。

1.14NP蛋白的純化與Western blot鑒定(ding)

A280紫(zi)外分(fen)光光度法測(ce)得蛋(dan)白濃度為(wei)1.80mg/mL。蛋(dan)白復性(xing)后經GST蛋(dan)白純化(hua)柱純化(hua)，SDS－PAGE凝(ning)膠電泳顯示(shi)蛋(dan)白分(fen)子量約74kDa(見圖3)；以(yi)抗(kang)GST McAb為(wei)一抗(kang)、HRP標記的(de)羊抗(kang)鼠IgG為(wei)二抗(kang)的(de)Western blott在相應位置出現特異性(xing)條帶。

1.15實(shi)驗(yan)動(dong)物免(mian)疫

1.15.1免疫操作(zuo)

以鑒定的重(zhong)組(zu)(zu)蛋白(bai)GST－NP為免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原免(mian)(mian)疫(yi)(yi)小(xiao)鼠(5只)，設置BSA對照組(zu)(zu)。初次免(mian)(mian)疫(yi)(yi)采用(yong)(yong)1mg/ml濃度的重(zhong)組(zu)(zu)蛋白(bai)GST－NP0.1ml與等體積(0.1ml)完全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)射(she)(she)(she)器混勻，皮內(如四(si)肢(zhi)、腹(fu)腔皮下、及(ji)腹(fu)腔)多點注(zhu)射(she)(she)(she)；21天后(hou)采用(yong)(yong)0.5mg/ml濃度的重(zhong)組(zu)(zu)蛋白(bai)GST－NP0.1ml與等體積(0.1ml)不完全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)射(she)(she)(she)器混勻，皮內(如四(si)肢(zhi)、腹(fu)腔皮下、及(ji)腹(fu)腔)多點注(zhu)射(she)(she)(she)，第(di)(di)二次免(mian)(mian)疫(yi)(yi)；之后(hou)每(mei)隔(ge)14天采用(yong)(yong)0.5mg/ml濃度的重(zhong)組(zu)(zu)蛋白(bai)GST－NP0.1ml與等體積(0.1ml)不完全佐(zuo)劑(ji)注(zhu)射(she)(she)(she)器混勻，腹(fu)腔直接注(zhu)射(she)(she)(she)，第(di)(di)三次、第(di)(di)四(si)次免(mian)(mian)疫(yi)(yi)。小(xiao)鼠第(di)(di)四(si)次免(mian)(mian)疫(yi)(yi)后(hou)第(di)(di)7天眼(yan)眶處(chu)采血(xue)(xue)待用(yong)(yong)，即(ji)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)小(xiao)鼠血(xue)(xue)，將(jiang)血(xue)(xue)液37℃處(chu)理(li)30min后(hou)，4℃冰(bing)浴1h，10000rpm離心10min，分(fen)離收集上層(ceng)血(xue)(xue)清備(bei)用(yong)(yong)。

1.15.2實(shi)驗動物血清效價檢測

1.15.2.1通過ELSIA方法對免疫小鼠血清效(xiao)價進(jin)行檢(jian)測和鑒定

實驗方法(fa)：間接(jie)法(fa)ELISA

試劑配方：

Coating buffer(1L、pH＝9.6)：NaHCO₃ 2.93g，Na₂CO₃ 1.59g，加去離子(zi)水(shui)至1L，4℃貯存。

1％BSA：稱1g BSA溶于(yu)100ml TBS。

2M H₂SO₄：100ml濃硫酸+800ml水。

10×TBS：Tris 48.4g NaCl 116.8g，用HCl調(diao)節(jie)pH＝7.4，加去離子水定容(rong)至2L，常(chang)溫保存(cun)。

1×TBST：取(qu)10×TBS 2L，Tween 20ml，加去離子水至20L，常溫保存。

TMB顯色液配方：A液與B液以體積比1：1混合，臨用前混合。A液：0.2M Na₂HPO₄25.7ml，0.1M檸檬酸24.3ml，H₂O₂ 0.1％，H₂O 50ml。B液：TMB 3.9g，檸檬酸10.52g，EDTA 1.86g，甘油2000ml，DMSO 300ml，溶解后加H₂O至10000ml(注(zhu)意TMB先(xian)用DMSO溶(rong)解)。

操作步驟：

1)包板：用包被緩沖液(ye)將組(zu)蛋白GST－NP抗(kang)原稀釋至1μg/ml，ELSIA板的96孔板中加50μl，4℃過夜，次日，棄去(qu)孔內溶液(ye)，用1xTBST洗滌(di)緩沖液(ye)以(yi)每孔180μl洗1次，拍干。

2)封閉(bi)：每(mei)孔加(jia)60μl的(de)1％BSA進行封閉(bi)，置37℃孵育1h，之(zhi)后(hou)棄封閉(bi)液。

加(jia)樣(yang)：加(jia)免疫小鼠(shu)血清(qing)稀釋(shi)樣(yang)品(小鼠(shu)血清(qing)按照1：200、1：1000、1：5000、1：10000、1：20000、1：60000、1：240000的比例(li)稀釋(shi))50μl于上(shang)述已封閉的反應孔(kong)。同時(shi)設置(zhi)好陰性對(dui)照孔(kong)(不(bu)加(jia)小鼠(shu)血清(qing)而加(jia)1％BSA)。置(zhi)37℃孵育1h，之后棄液(ye)，用1xTBST洗滌緩(huan)沖液(ye)以(yi)每孔(kong)180μl洗2次，拍(pai)干。

3)加(jia)(jia)酶標(biao)抗體：加(jia)(jia)稀釋的羊抗鼠二(er)抗－HRP(1：10000稀釋，用(yong)1％BSA進行稀釋)，以(yi)50μl/孔加(jia)(jia)入酶標(biao)板(ban)孔中，置(zhi)37℃孵育45min，之后棄液(ye)(ye)，用(yong)1xTBST洗滌緩沖液(ye)(ye)以(yi)每孔180μl洗3次，拍(pai)干。

4)加底物(wu)液(ye)顯色：于各反(fan)應(ying)孔(kong)中(zhong)加入(ru)配(pei)(pei)(pei)制(zhi)的TMB底物(wu)溶液(ye)100μl(A液(ye)與B液(ye)以1：1配(pei)(pei)(pei)制(zhi)，現配(pei)(pei)(pei)現用)，置37℃反(fan)應(ying)5min。

5)終(zhong)止反應(ying)：于各反應(ying)孔中(zhong)加入(ru)2M硫(liu)酸100μl，終(zhong)止反應(ying)。

6)讀(du)板：將酶標板置于預(yu)熱過的(de)酶標儀(yi)中進行(xing)讀(du)數(shu)，保存數(shu)據，進行(xing)分(fen)析。

1.15.2.2通過Western Blot方法對小鼠(shu)B4血(xue)清(qing)效價進行檢(jian)測和鑒定

試劑(ji)配方：同前述ELSIA方法(fa)。

操作步驟：

1)裁膜

2)一抗反應：加(jia)樣槽(cao)中(zhong)用5％的脫(tuo)脂奶粉稀釋小鼠血(xue)清樣品(1：50稀釋)，反應體(ti)積(ji)為1ml，把泡于TBST中(zhong)的膜條分別用鑷子夾入對應加(jia)樣槽(cao)中(zhong)，室溫搖床上反應1h。

3)洗(xi)膜(mo)：先用(yong)1×TBST以(yi)每道1ml的用(yong)量連續洗(xi)8遍(bian)，接著水平搖床10min×3遍(bian)。

4)二(er)(er)抗反應(ying)：用5％的脫脂奶(nai)粉按照每(mei)條(tiao)膜1ml的用量稀釋(shi)羊抗鼠二(er)(er)抗，1：5000稀釋(shi)使用，保證(zheng)二(er)(er)抗充分混勻。之后將經(jing)過一(yi)抗處(chu)理后的膜夾(jia)入(ru)裝有二(er)(er)抗的對應(ying)槽(cao)內(nei)，室溫(wen)搖床上反應(ying)1h。

5)洗膜：先用1×TBST以(yi)每道(dao)1ml的(de)用量連續(xu)洗8遍(bian)，接(jie)著(zhu)水(shui)平搖床10min×3遍(bian)。

6)底(di)物(wu)(wu)反應：底(di)物(wu)(wu)需提(ti)前30min從4℃冰箱拿出(chu)(chu)平衡至室溫。底(di)物(wu)(wu)分為A液(ye)與(yu)B液(ye)，以每(mei)條膜(mo)200ul的(de)(de)總體(ti)積來計(ji)算用(yong)量(liang)，根據所需用(yong)量(liang)以1：1的(de)(de)比例臨(lin)用(yong)前混合配置。將(jiang)配好的(de)(de)底(di)物(wu)(wu)用(yong)1ml移(yi)液(ye)器均勻地加于所有膜(mo)上(shang)，靜置反應3min。再將(jiang)塑料(liao)墊片(pian)豎立(li)起(qi)來，在吸(xi)水紙上(shang)倒去底(di)物(wu)(wu)液(ye)，用(yong)鑷子排布好膜(mo)，兩個(ge)項目(mu)(mu)之間留出(chu)(chu)1cm以上(shang)的(de)(de)空(kong)(kong)隙，同一個(ge)項目(mu)(mu)的(de)(de)膜(mo)與(yu)膜(mo)之間留出(chu)(chu)2－3mm空(kong)(kong)隙，之后(hou)用(yong)塑料(liao)膜(mo)封蓋，準備曝(pu)光。

7)曝光(guang)：曝光(guang)時間按照條(tiao)帶(dai)熒光(guang)強弱而不同(tong)，一(yi)般肉眼(yan)能看(kan)到比較明亮(liang)的(de)熒光(guang)條(tiao)帶(dai)曝光(guang)1min；肉眼(yan)隱約能看(kan)到熒光(guang)曝光(guang)2min；肉眼(yan)看(kan)不到任何(he)熒光(guang)曝光(guang)3min。曝光(guang)完畢后(hou)將(jiang)膠(jiao)(jiao)片(pian)立(li)即放入(ru)顯(xian)影(ying)(ying)液中(zhong)，先反應2min左右，之(zhi)后(hou)用手不時地拿起膠(jiao)(jiao)片(pian)觀察，直(zhi)到條(tiao)帶(dai)清晰為(wei)止。顯(xian)影(ying)(ying)過度可(ke)能出現多余的(de)雜帶(dai)并(bing)且加深背景。之(zhi)后(hou)將(jiang)膠(jiao)(jiao)片(pian)放入(ru)清水(shui)中(zhong)漂洗，接著放入(ru)定影(ying)(ying)液中(zhong)，定影(ying)(ying)2min以上。將(jiang)定影(ying)(ying)結(jie)束后(hou)的(de)膠(jiao)(jiao)片(pian)取出放在水(shui)盆中(zhong)，帶(dai)出暗室。膠(jiao)(jiao)片(pian)在自來(lai)水(shui)下(xia)沖(chong)洗干凈，干燥，記(ji)錄結(jie)果。

8)結果處理：在(zai)完(wan)全干燥后的(de)膠(jiao)片上標注檢(jian)(jian)測(ce)內容，項目編(bian)號，分子(zi)量，膜(mo)的(de)名稱，制膜(mo)日期(qi)，曝光時間，檢(jian)(jian)測(ce)日期(qi)。

1.16細胞融合

以ELISA和Western Blot篩(shai)選出含高效價血清的免疫(yi)小(xiao)鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進(jin)行體外(wai)融合。

1.16.1融合及檢測(ce)操(cao)作步驟(zou)：

小鼠(shu)脾細(xi)胞的(de)制備、細(xi)胞融合、以(yi)及選擇性培養雜交瘤(liu)細(xi)胞。

1.16.1.1脾細胞的制備：

1)抓住免疫后的小鼠尾巴(ba)，拉緊小鼠頸部皮(pi)膚保持其頭(tou)部無法自(zi)由(you)轉動(dong)的同(tong)時，使其眼珠向外突出(chu)。

2)用(yong)彎(wan)頭鑷子將突出(chu)的(de)眼(yan)(yan)球摘下，收集從(cong)眼(yan)(yan)眶中流出(chu)血液。

3)待血流(liu)完后，斷頸處(chu)死小鼠，并(bing)放入盛有75％酒精的燒杯中消毒。

4)將(jiang)燒(shao)杯連同小鼠和酒精一并帶入(ru)無(wu)菌(jun)室(shi)內。

5)用鑷子將小(xiao)鼠從酒精中取出，瀝(li)干(gan)酒精后，放(fang)入超凈(jing)臺上。

6)用鑷子(zi)將(jiang)(jiang)小鼠腹部(bu)毛(mao)皮層提起(qi)，用無菌眼科剪剪出(chu)一個倒三角的切口后，用止血(xue)鉗將(jiang)(jiang)其腹部(bu)毛(mao)皮層撕開，露出(chu)腹腔。

7)用無(wu)菌小(xiao)鑷(nie)子提起(qi)小(xiao)鼠腹(fu)腔膜，用另一無(wu)菌眼(yan)科(ke)剪剪開腹(fu)腔膜，露出整(zheng)個腹(fu)腔。

8)在腹(fu)腔右上(shang)方，找出脾臟，小心取出，放入盛有預(yu)熱的1640培養液的玻璃平皿中，洗滌三遍。

9)用(yong)鑷子在脾臟(zang)一(yi)(yi)端先(xian)造(zao)成一(yi)(yi)個穿孔，然后用(yong)兩把(ba)鑷子將(jiang)脾臟(zang)中(zhong)的脾細胞(bao)擠壓出來，然后用(yong)1ml的槍將(jiang)脾細胞(bao)吹散，收集至15ml離(li)心(xin)管，1500rpm離(li)心(xin)5min。

10)去上清(qing)液(ye)，加入3ml紅細胞(bao)裂解液(ye)，吹勻細胞(bao)，靜置(zhi)5min后，1500rpm離心5min，棄上清(qing)，沉淀(dian)加入10ml預熱的1640培養基。

1.16.1.2細胞(bao)融合(he)：

1)將生長狀(zhuang)態良好的SP2/0細胞，吹打下來后，1000rpm離心5min。

2)棄去上(shang)清，用(yong)4ml預熱的1640培養液(ye)重懸，1000rpm離心5min。

3)重復步驟2)。

4)棄去(qu)上清，加入(ru)適量預熱(re)的(de)1640培養液(ye)重(zhong)懸(xuan)沉淀。

5)取50ul細胞懸(xuan)液，于顯微(wei)鏡(jing)下檢活計數(shu)。

6)每個融合取1×10⁷個細胞，與處理好的1×10⁸個脾細胞(bao)在(zai)進(jin)口(kou)的50ml離心(xin)管中(zhong)混合均勻后，1350rpm離心(xin)7min。

7)用抽液泵抽干(gan)上清，在(zai)超凈(jing)臺桌(zhuo)面(mian)上敲打離(li)心管(guan)底部(bu)，使沉淀(dian)松動呈糜(mi)狀沿著離(li)心管(guan)底部(bu)的管(guan)壁(bi)，緩慢加入(ru)1ml PEG，在(zai)90s內(nei)完成。

8)將離(li)心管靜置60s。

9)沿管壁緩(huan)慢(man)滴加(jia)5ml預熱(re)的(de)1640培(pei)養液，先(xian)慢(man)后快，終(zhong)止反應再(zai)逐漸加(jia)快速度，最終(zhong)加(jia)入40ml預熱(re)的(de)1640培(pei)養液，再(zai)將(jiang)細胞吸起緩(huan)慢(man)地將(jiang)細胞打入培(pei)養基中以致均勻分布。

10)步驟7)－9)在3min內完成(cheng)。

11)1200rpm離心5min。

12)棄去(qu)上清，加入25ml預熱(re)的15％FBS 1640(1＊HAT)培養(yang)基，用10ml移液管小(xiao)心重懸細胞。

13)200ul/孔的量將步(bu)驟12)中的混合細胞懸液鋪到96孔細胞培養板(ban)上(shang)，數(shu)量10板(ban)。

1.16.1.3選擇(ze)性培養(yang)雜(za)交瘤細(xi)胞：

1)融合后第四天，吸(xi)盡融合板(ban)上的培養液(ye)，避(bi)免吸(xi)走板(ban)底的細(xi)胞。

2)每孔(kong)補液(15％FBS血清，1×HAT，1640)150ul。

3)根據克隆(long)大小，于融合(he)后第(di)6天(tian)，吸盡(jin)融合(he)板上的培養(yang)液。

4)每孔補(bu)液(15％FBS血清，1×HAT，1640)50ul。

5)融(rong)合后第10天(tian)，取上清應用(yong)ELISA進(jin)行(xing)初(chu)篩(Primary－screen)。

6)挑取ELISA檢測陽性的(de)孔(kong)至一新的(de)96孔(kong)板進行轉孔(kong)，棄去原來(lai)的(de)上清。

7)根據克隆大小(xiao)，于轉孔(kong)后第2天再次取樣應(ying)用ELISA進行確認(Confirm－screen)。

8)待Confirm－screen結果陽性的孔(kong)長大(da)后，轉至24孔(kong)板。

9)培養4天后(hou)，取上清(qing)，WESTERN BLOT鑒定(ding)。

10)根據(ju)WESTERN BLOT結果，將陽性的克隆(long)(long)(long)進行亞克隆(long)(long)(long)處理，篩選單克隆(long)(long)(long)細胞株。

1.16.2重組蛋(dan)白GST－NP融合檢(jian)測

通(tong)過ELSIA方法，96孔板取多(duo)克(ke)隆(long)細胞株上清(qing)液檢測陽性，挑選分泌(mi)所(suo)需抗體的多(duo)克(ke)隆(long)細胞株。

1)包板(ban)：用(yong)包被緩沖液(ye)將重組蛋(dan)白(bai)GST－NP稀釋至(zhi)1μg/ml，在96孔板(ban)中加50μl/孔，4℃過(guo)夜，次(ci)日，棄去孔內(nei)溶液(ye)，用(yong)1xTBST洗(xi)滌(di)緩沖液(ye)以每孔180μl洗(xi)1次(ci)，拍干。

2)封閉：每孔加(jia)60μl的1％BSA進行封閉，置37℃孵育1h。之后棄封閉液(ye)。

3)加(jia)樣：加(jia)融合后的(de)(de)多克隆細(xi)胞(bao)株上清(含有細(xi)胞(bao)分泌(mi)的(de)(de)抗體)，50μl于上述已封閉(bi)的(de)(de)反應孔(kong)。同(tong)時(shi)設置(zhi)好陰(yin)性對照(zhao)孔(kong)(不加(jia)小鼠(shu)血清加(jia)1％BSA)。置(zhi)37℃孵育1h，之后棄液，用1xTBST洗滌緩沖液以(yi)每孔(kong)180μl洗2次，拍(pai)干。

4)加(jia)(jia)酶(mei)標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)：加(jia)(jia)稀釋(shi)的(de)羊抗(kang)(kang)(kang)鼠二抗(kang)(kang)(kang)－HRP(用1％BSA進行1：10000稀釋(shi))，以(yi)50μl/孔(kong)加(jia)(jia)入酶(mei)標板(ban)孔(kong)中，置37℃孵育45min，之后棄液，用1xTBST洗滌緩沖液以(yi)每孔(kong)180μl洗3次，拍干。

5)加(jia)底(di)物液顯色：于各反應孔中加(jia)入配制(zhi)的TMB底(di)物溶液100μl(A液與B液以1：1配制(zhi))，置(zhi)37℃反應5min。

6)終(zhong)(zhong)止反應：于各(ge)反應孔中加入2M硫(liu)酸100μl，終(zhong)(zhong)止反應。

7)讀板：將酶(mei)標(biao)板置于預(yu)熱(re)過的酶(mei)標(biao)儀中進行(xing)(xing)讀數，保存數據，進行(xing)(xing)分析。

1.17細胞亞(ya)克隆(long)(sub)挑(tiao)選單(dan)克隆(long)細胞株

1)取Western Blot結果陽性的多克隆期(qi)細(xi)胞(bao)，用(yong)(15％FBS，1×HT，1640)培(pei)養液重懸，通過細(xi)胞(bao)計(ji)數，確定(ding)鋪板細(xi)胞(bao)量。(1板96孔(kong)板挑選200－220個細(xi)胞(bao))。

2)以200ul/孔的量，將稀釋好的細胞鋪到(dao)新(xin)的96孔板中。

3)7天后(hou)，待克隆長至1/8－1/10底面大，可取上清，送(song)檢ELISA(Subclone－screen)。

4)從ELISA結果陽性的孔(kong)中挑選單克隆細(xi)胞(bao)株，一般(ban)挑選10－12個(ge)(ge)，單克隆不(bu)多時用雙克隆、三克隆補足(zu)。每個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)孔(kong)逐(zhu)個(ge)(ge)換液，于1－2天再(zai)次取樣送檢(jian)ELISA(Subclone Confirm－screen)。5)每板(ban)sub選2－3個(ge)(ge)陽性值最(zui)好(hao)，細(xi)胞(bao)狀態(tai)最(zui)好(hao)的克隆擴增至24孔(kong)板(ban)。

6)培養(yang)72h后，進行Western Blot檢測(ce)。

7)選(xuan)取(qu)Western Blot結(jie)果好的克(ke)隆，擴增(zeng)至6孔(kong)板(ban)。

8)最終擴增至(zhi)100mm dish，每個克(ke)隆各(ge)凍存2管。

9)將綜合結果最好的細胞株，擴(kuo)大(da)生產制備(bei)腹(fu)水(shui)，然后再(zai)進行二次亞克隆(long)，擴(kuo)增細胞，再(zai)凍存2－3管(guan)。

1.18單(dan)克隆細(xi)胞株腹水抗體制備、純化、亞型(xing)鑒定、以及效價檢測

1.18.1挑選的單克隆細胞株(zhu)制備腹(fu)水(shui)

1)提前(qian)7天準備腹水(shui)制(zhi)備用的小(xiao)鼠(shu)，將誘導劑注射至小(xiao)鼠(shu)體內。

2)提前準備需要接種的細胞，注射當天每只小鼠注射8X10⁵個(ge)細胞(bao)，根據所需接種的小鼠數量，飼(si)養細胞(bao)。

3)小(xiao)鼠誘導7天(tian)后注射(she)細胞。

4)注射的細胞先用無血清培養(yang)基(1640)將細胞吹(chui)下來，計(ji)數，離心(1500rpm，5min)。

5)去上清，再用無血清培養基將細胞懸浮至濃度為8X10⁵個(ge)/mL，1mL每管分(fen)裝(zhuang)到1.5mLEP管中(zhong)，接(jie)種小鼠，1ml注射1只小鼠。

6)第7天左右小(xiao)鼠(shu)開(kai)始產(chan)腹水(shui)，開(kai)始收集腹水(shui)。

1.18.2單克隆細胞株的腹水亞型(xing)鑒定(ding)

1)包(bao)板：用包(bao)被緩沖液將GST－NP重(zhong)組蛋白(bai)稀釋(shi)至(zhi)1μg/ml，ELSIA板的96孔(kong)板中加(jia)50μl，4℃過夜，次日，棄去孔(kong)內溶液，用1xTBST洗滌緩沖液以(yi)每孔(kong)180μl洗1次，拍干。

2)封閉(bi)：每孔加60μl的1％BSA進行封閉(bi)，置(zhi)37℃孵(fu)育1h。之(zhi)后棄(qi)封閉(bi)液。

3)加樣：加1：1000稀釋的(de)小鼠(shu)腹(fu)水，50μl于上述已封閉(bi)的(de)反應孔(kong)。同時設置好陰性對(dui)照孔(kong)(不加小鼠(shu)血(xue)清加1％BSA)。置37℃孵育1h，之后棄液，用1xTBST洗滌緩(huan)沖液以每孔(kong)180μl洗2次，拍干。

4)加酶(mei)標(biao)抗(kang)體：加稀釋(shi)的(de)分型二抗(kang)－HRP(用1％BSA進(jin)行1：4000稀釋(shi))，以50μl/孔(kong)加入酶(mei)標(biao)板孔(kong)中，置37℃孵育(yu)45min，之后棄(qi)液，用1xTBST洗滌緩(huan)沖液以每孔(kong)180μl洗3次，拍干。

5)加底物液顯色：于各(ge)反應孔中(zhong)加入配制(zhi)的TMB底物溶(rong)液100μl(A液與(yu)B液以1：1配制(zhi))，置37℃反應5min。

6)終(zhong)止反(fan)應：于各反(fan)應孔中加入2M硫(liu)酸100μl，終(zhong)止反(fan)應。

7)讀板(ban)：將酶標(biao)板(ban)置于預熱過的(de)酶標(biao)儀(yi)中進行(xing)讀數，保存(cun)數據，進行(xing)分(fen)析。

1.18.3單(dan)克隆細(xi)胞株腹水效(xiao)價檢(jian)測

通過ELSIA和Western Blot方法檢測小(xiao)鼠(shu)(shu)腹水的效(xiao)價，檢測方法同(tong)免疫(yi)小(xiao)鼠(shu)(shu)血(xue)(xue)清檢測，稀釋比(bi)例也同(tong)免疫(yi)小(xiao)鼠(shu)(shu)血(xue)(xue)清。

1.18.4單(dan)克隆細胞株(zhu)腹水純化

1)將親和層析柱依(yi)次用(yong)20mL純水和1×PBS(pH7.4)充分清洗，流速(su)70mL/h。

2)取(qu)待(dai)純化的(de)血清10mL于50mL離心(xin)管，用孔徑(jing)0.45μm，直徑(jing)25mm微孔濾膜抽濾。

3)將(jiang)抽(chou)濾過的血清樣(yang)品(pin)以40mL/h流速上樣(yang)，重復(fu)一次。

4)用20mL 1×PBS(pH7.4)清洗柱子，70mL/h的(de)流速，10min后連接蛋白檢測儀，清洗過程中調節儀器(qi)透(tou)光率(T檔)示數為100。

5)調節蛋(dan)白檢測(ce)儀(yi)吸光率(lv)(1A檔)示(shi)數(shu)為(wei)0，打開HD－A電腦采集(ji)(ji)器，將(jiang)滿屏量程調到(dao)5，用甘(gan)氨酸溶液(pH 2.7，0.2M)以40mL/h的流速洗脫抗體(ti)(ti)，在儀(yi)器示(shi)數(shu)開始升高時開始收集(ji)(ji)抗體(ti)(ti)。

6)在抗體收集過程中以(yi)1M的碳酸氫鈉(na)及(ji)時調節抗體的pH值至7.0，記錄(lu)洗(xi)脫(tuo)峰(feng)的最(zui)高峰(feng)值。

7)抗(kang)(kang)體收集完后，調節pH值至(zhi)7.0，記錄洗脫的(de)抗(kang)(kang)體體積，用純凈水(shui)沖洗連接收集器(qi)的(de)橡膠管。

8)依次用20mL 1×PBS和純(chun)水以70mL/h的流速清(qing)洗親和層析柱，加入20％乙醇，封口，4℃冰(bing)箱(xiang)保存。

1.18.5純(chun)化后(hou)單克隆抗體(ti)效價(jia)檢測

通過ELSIA和Western Blot方法檢測(ce)純(chun)化后(hou)抗體的效(xiao)價，檢測(ce)方法同免(mian)疫小鼠血(xue)清(qing)檢測(ce)，稀釋比例也同免(mian)疫小鼠血(xue)清(qing)。

1.19單克隆抗體的Western blot分析

重組核蛋白經(jing)SDS－PAGE電泳，120mA恒流(liu)轉膜2.5h，以純(chun)化后1：100、1：500稀釋的單克隆細(xi)胞株C3－E8和2－F11為(wei)一抗，以1：10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為(wei)二抗，通過封(feng)閉反(fan)應、抗體孵育、底物反(fan)應、曝光顯(xian)影，獲得Western blot結果。

2漢坦病(bing)毒(du)S基因克(ke)隆、表達(da)及(ji)單克(ke)隆抗體制備結果

2.1S基(ji)因(yin)的PCR擴增及TA克隆鑒定

Trizol提取后(hou)的(de)RNA經pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R引物進(jin)行一(yi)步法RT－PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)S基(ji)因(yin)，1.0％瓊脂糖凝膠(jiao)電(dian)泳顯示擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)條帶約1306bp，與預(yu)期大小一(yi)致，提示擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)DNA為目的(de)片段。以(yi)抽提后(hou)的(de)TA克隆質粒為模板，用pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R引物對S基(ji)因(yin)進(jin)行PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，產物經1.0％瓊脂糖凝膠(jiao)電(dian)泳，可見一(yi)約1306bp的(de)目的(de)條帶(見圖(tu)1)，與預(yu)期值一(yi)致。

2.2pGEX－6P－2/S的構建與(yu)鑒定

以(yi)(yi)抽提后的(de)質(zhi)(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S為模板，以(yi)(yi)pGEX－6P－2－F、pGEX－6P－2－R為引(yin)物進行PCR擴增，可見(jian)一(yi)約1306bp的(de)目(mu)的(de)條帶(見(jian)圖(tu)2)，與預期值一(yi)致。用(yong)(yong)限制性內(nei)切酶(mei)EcoRⅠ、XholⅠ對(dui)重(zhong)組(zu)質(zhi)(zhi)粒(li)pGEX－6P－2/S進行雙(shuang)酶(mei)切，得到(dao)與目(mu)的(de)基因(1306bp)及載(zai)體(4985bp)相同大小的(de)2個片段(duan)(見(jian)圖(tu)1)。挑(tiao)取含插入片段(duan)pGEX－6P－2/S的(de)陽性克(ke)隆，用(yong)(yong)小量質(zhi)(zhi)粒(li)提取試劑盒(he)提取質(zhi)(zhi)粒(li)測序(xu)，結果表明S基因片段(duan)已經成功的(de)插入pGEX－6P－2載(zai)體，且插入方向正確。

2.3測序結果分析

核蛋(dan)白基(ji)(ji)因(yin)編碼區以起始密碼ATG開始，以終止密碼子TAA結尾，ORF長(chang)1290個(ge)核苷酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)，包括堿(jian)基(ji)(ji)A423個(ge)(32.79％)，堿(jian)基(ji)(ji)C244個(ge)(18.91％)，堿(jian)基(ji)(ji)G325個(ge)(25.19％)，堿(jian)基(ji)(ji)T298個(ge)(23.10％)，GC含(han)(han)(han)量為(wei)44.11％，AT含(han)(han)(han)量為(wei)55.89％，單鏈分(fen)子量約為(wei)391.41kDa，編碼429個(ge)氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)(20種)，平均(jun)分(fen)子量為(wei)48.13kDa，含(han)(han)(han)量最(zui)(zui)高的(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)為(wei)Leu(亮氨(an)(an)酸(suan))，占總(zong)蛋(dan)白含(han)(han)(han)量的(de)9.79％(42/429)，含(han)(han)(han)量最(zui)(zui)低的(de)為(wei)Cys(半胱氨(an)(an)酸(suan))和Trp(色氨(an)(an)酸(suan))，僅各占1.17％(5/429)。

2.4pGEX－6P－2/S的表達與鑒定

含重(zhong)組質粒(li)pGEX－6P－2/S的(de)E.coli Star BL21(DE3)菌(jun)(jun)株(zhu)應用不同濃度IPTG進(jin)行誘導(dao)，SDS－PAGE凝(ning)膠電泳圖上均顯示特異性條帶，蛋白(bai)分(fen)子量與理論值一致，約為74kDa。菌(jun)(jun)株(zhu)在(zai)(zai)IPTG終濃度1.0mmol/L、37℃條件下誘導(dao)3h條件下，表達量最大(見圖2)。菌(jun)(jun)體經超聲波破菌(jun)(jun)，包涵體經8mol/L尿素溶解后過GST親和層析柱，SDS－PAGE凝(ning)膠電泳顯示單一的(de)目(mu)的(de)蛋白(bai)條帶，分(fen)子量與預(yu)期大小(xiao)一致，約74kDa，融合蛋白(bai)主要存在(zai)(zai)于不溶性的(de)包涵體中。

2.5NP蛋白的純化與Western blott鑒定

A280紫(zi)外分光光度法測得蛋(dan)白(bai)濃度為(wei)1.80mg/mL。蛋(dan)白(bai)復性(xing)后(hou)經GST蛋(dan)白(bai)純(chun)化柱純(chun)化，SDS－PAGE凝膠電泳顯示(shi)蛋(dan)白(bai)分子量(liang)約74kDa(見(jian)圖3)；以(yi)抗(kang)GST McAb為(wei)一抗(kang)、HRP標(biao)記的羊抗(kang)鼠IgG為(wei)二(er)抗(kang)的Western blott在相應位置出現特異性(xing)條(tiao)帶。

2.6小(xiao)鼠(shu)血清ELSIA檢測結果

參(can)見表1所示，5只小(xiao)鼠血清ELSIA檢測(ce)結果(guo)顯(xian)示效價均(jun)已經達到(dao)合格標(biao)準(1：10000＞0.6)。

表1重(zhong)組蛋白GST－NP小鼠血清ELSIA檢測效(xiao)價結果

2.7實驗(yan)動(dong)物(小(xiao)鼠)血清Western Blot檢測結果

圖4是本發(fa)明實施例的(de)免疫小鼠血(xue)清Western Blot檢測結(jie)果的(de)SDS－PAGE電泳圖，參見圖4所示，5只免疫小鼠血(xue)清Western Blot檢測效價均合格。綜合ELISA和Western Blot效價結(jie)果，挑選1249－7小鼠進(jin)融合。

2.8細胞融合(he)檢測結果

多(duo)(duo)克隆細胞株(zhu)篩選階段(duan)(pri階段(duan))ELSIA方法檢測結(jie)(jie)果(guo)為：1249－7免(mian)疫小鼠融合(he)結(jie)(jie)果(guo)陽性較多(duo)(duo)，具(ju)體結(jie)(jie)果(guo)見(jian)表2。

表(biao)2多(duo)克隆細胞株篩選階(jie)(jie)段(pri階(jie)(jie)段)ELSIA方(fang)法檢(jian)測結果

針對重組蛋(dan)白(bai)的標(biao)(biao)簽進(jin)行交叉篩選，去除與標(biao)(biao)簽蛋(dan)白(bai)反(fan)應(ying)的細胞株ELSIA方法檢測結果(guo)絕大部分(fen)為陽性(xing)。

表3去(qu)除與標(biao)簽蛋白反應的細胞株ELSIA方(fang)法(fa)檢測結(jie)果(guo)

多克隆細(xi)胞(bao)株篩選(xuan)階段陽性(xing)(pri階段)Western Blot方法檢測(ce)結(jie)果為：方法同小鼠血清階段，檢測(ce)樣(yang)品為多克隆階段細(xi)胞(bao)株上(shang)清液、原液檢測(ce)，檢測(ce)結(jie)果陽性(xing)率較高，參見圖5，結(jie)合Western Blot和ELSIA結(jie)果挑選(xuan)陽性(xing)較好的細(xi)胞(bao)株進行細(xi)胞(bao)亞克隆(sub)挑選(xuan)單克隆細(xi)胞(bao)株。

2.9細胞亞(ya)克隆(long)(sub)挑選單克隆(long)細胞株

Sub階段ELSIA檢(jian)測結果(ELSIA檢(jian)測方(fang)法同(tong)pri階段，檢(jian)測sub板每個細胞(bao)孔里細胞(bao)的抗體分泌(mi)情況)參見表4，A2#、C3#、2#、10#、6#效果較好(hao)。

表4Sub階段細胞(bao)亞克隆ELSIA檢(jian)測結果

sub階段的陽性(xing)細胞(bao)株(zhu)挑選(xuan)10顆左(zuo)右單克(ke)(ke)隆細胞(bao)株(zhu)進行復(fu)檢，同時上清液(ye)做1：20的稀釋檢測(ce)(ce)效價及(ji)叉檢his標簽蛋白。具體(ti)參(can)見表(biao)5，通過ELSIA方法篩選(xuan)后(hou)(hou)，每個多克(ke)(ke)隆來源的單克(ke)(ke)隆細胞(bao)株(zhu)，分別挑選(xuan)2株(zhu)比較好的細胞(bao)株(zhu)進行擴大培(pei)養和Western Blot檢測(ce)(ce)結(jie)果較好。Western Blot檢測(ce)(ce)sub后(hou)(hou)單克(ke)(ke)隆細胞(bao)株(zhu)上清液(ye)的抗(kang)體(ti)分泌良好，參(can)見圖6。

表5sub階段的陽性細胞株ELSIA復(fu)檢結果

2.10單克隆(long)細胞(bao)株腹水抗體亞型(xing)檢(jian)測結果

對2株(C3－E8和2－F11)單克(ke)隆細胞株的小鼠腹(fu)水抗(kang)體(ti)亞型(xing)檢測結果均為IgG1類型(xing)k鏈，具體(ti)參見表6。

表(biao)6單(dan)克隆細(xi)胞株的腹水抗體亞型檢測結果

2.11單(dan)克隆細胞株腹水效價檢測結(jie)果

通過ELSIA和(he)Western Blot方法檢測(ce)單克隆細胞株C3－E8和(he)2－F11的小鼠腹水的效價，檢測(ce)方法同(tong)免疫小鼠血(xue)清(qing)(qing)檢測(ce)，稀釋比例也同(tong)免疫小鼠血(xue)清(qing)(qing)。參見圖(tu)7和(he)圖(tu)8，ELSIA和(he)WesternBlot結果都較好(hao)。

2.12單克隆(long)細(xi)胞株腹水純化結果

參見圖9所示，腹水純化峰值較為集中，純化效果較好。

2.13純化后單(dan)克隆抗體效價檢測(ce)結(jie)果

通過(guo)ELSIA和Western Blot方法檢(jian)(jian)測純化后單克隆抗(kang)體(單克隆細胞株C3－E8和2－F11)的效(xiao)價，檢(jian)(jian)測方法同(tong)免疫小鼠血清(qing)檢(jian)(jian)測，稀釋比例(li)也(ye)同(tong)免疫小鼠血清(qing)。參(can)見(jian)表7和圖10，ELSIA和Western Blot結(jie)果較(jiao)好。

表7ELSIA方法檢測(ce)純化后抗(kang)體的效價結果

2.14單克(ke)隆抗體(ti)檢測結(jie)果

根據純化(hua)后(hou)單克隆(long)抗(kang)體(單克隆(long)細胞株C3－E8和2－F11)檢測效價(jia)，進行適當濃縮，通過ELSIA方法檢測濃縮后(hou)抗(kang)體達到更高的效價(jia)，具體參見表(biao)8。

表8ELSIA方法檢測單克隆抗體(ti)的效(xiao)價(jia)結果

3異硫氰酸熒光素標記單克隆抗(kang)體及應用

用(yong)PBS(PH9.0)調整單(dan)克隆(long)細胞株C3－E8和(he)2－F11的單(dan)抗濃度為10mg/ml，取1mg FITC溶于(yu)0.2mlDMSO，滴加于(yu)抗體(ti)(ti)液內，室溫避光(guang)作用(yong)2h進(jin)行(xing)(xing)(xing)交(jiao)聯(lian)反應(ying)(ying)，交(jiao)聯(lian)混合(he)物經(jing)葡聚糖凝膠Sephadex G25柱進(jin)行(xing)(xing)(xing)純(chun)化(hua)。對(dui)純(chun)化(hua)后(hou)的C3－E8、2－F11單(dan)克隆(long)抗體(ti)(ti)應(ying)(ying)用(yong)含1％FBS的PBS進(jin)行(xing)(xing)(xing)1：100稀(xi)釋，建立常規(gui)IFA法對(dui)漢(han)坦(tan)病毒感染的鼠肺組織(經(jing)IFA、PCR和(he)測(ce)序鑒定)進(jin)行(xing)(xing)(xing)檢測(ce)，與1：50稀(xi)釋的漢(han)坦(tan)病毒多克隆(long)抗體(ti)(ti)(第四軍醫大)檢測(ce)效果進(jin)行(xing)(xing)(xing)比較。

應用結(jie)果：將FITC標記到C3－E8、2－F11兩(liang)株單克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)后，1：100進行(xing)稀釋，對鑒定后的(de)(de)漢(han)坦病毒感染鼠肺組(zu)織(zhi)進行(xing)檢測，在熒光(guang)顯(xian)微鏡下可見(jian)在被感染的(de)(de)鼠肺組(zu)織(zhi)中見(jian)到密集的(de)(de)蘋果綠色熒光(guang)顆粒(li)，與1：50稀釋的(de)(de)多克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)檢測結(jie)果進行(xing)比(bi)較，參(can)見(jian)圖(tu)11。

國內目前沒有較好的(de)應(ying)用關于漢(han)(han)坦病(bing)毒(du)感染后(hou)檢(jian)測的(de)單克(ke)隆抗(kang)體，大(da)(da)部分均為多抗(kang)。大(da)(da)量(liang)實驗(yan)證明，漢(han)(han)坦病(bing)毒(du)核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)存在有許(xu)多血清(qing)型(xing)特異性(xing)抗(kang)原位點，具(ju)有良(liang)好的(de)免(mian)疫(yi)原性(xing)，有極高的(de)診(zhen)斷應(ying)用價(jia)值。我們(men)通過(guo)構建漢(han)(han)坦病(bing)毒(du)S基因(yin)PGE原核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)原核(he)(he)表達載體系，轉染大(da)(da)腸埃希菌誘(you)導表達，獲得(de)(de)具(ju)有抗(kang)原活性(xing)的(de)核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)。通過(guo)分離純化，得(de)(de)到(dao)(dao)了該核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)包涵體抗(kang)原，通過(guo)免(mian)疫(yi)小鼠，制備(bei)雜交瘤(liu)細胞，親和純化后(hou)得(de)(de)到(dao)(dao)了高純度核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)。用核(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)包被酶標(biao)(biao)板，ELISA篩選陽(yang)性(xing)雜交瘤(liu)細胞克(ke)隆株，建立了細胞系。選取2株高效價(jia)單抗(kang)細胞2－F11和C3－E8，常規制備(bei)腹水后(hou)鑒定(ding)了其免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)種(zhong)類和IgG亞類。同(tong)時將FITC標(biao)(biao)記到(dao)(dao)2－F11和C3－E8單抗(kang)上，檢(jian)測鼠肺組(zu)織中(zhong)的(de)漢(han)(han)坦病(bing)毒(du)抗(kang)原，取得(de)(de)了滿意的(de)效果(guo)。

本(ben)發明實(shi)施例的(de)(de)技(ji)術方案(an)帶來的(de)(de)有益效果是：上(shang)述漢(han)坦病(bing)毒(du)S基因克(ke)隆(long)、表達、單克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)的(de)(de)制(zhi)備(bei)方法，可分離到了(le)純度(du)較(jiao)高的(de)(de)目的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，最大程度(du)地恢(hui)復了(le)變性(xing)后重(zhong)組蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)生物活性(xing)，重(zhong)組蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)GST－NP具有較(jiao)好的(de)(de)免疫原性(xing)和免疫反應性(xing)，獲(huo)得雜交(jiao)瘤細胞株能穩定分泌高效價的(de)(de)單克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)，經(jing)與FITC進(jin)行(xing)交(jiao)聯，建立的(de)(de)IFA試驗能用于漢(han)坦病(bing)毒(du)感染后鼠(shu)組織器官標本(ben)中病(bing)毒(du)抗(kang)原的(de)(de)檢測。

以上(shang)(shang)所述，僅是本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的較佳實(shi)施例(li)(li)而已(yi)，并(bing)非對本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)作任(ren)何(he)形(xing)式上(shang)(shang)的限制，雖(sui)然(ran)本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)已(yi)以較佳實(shi)施例(li)(li)揭露(lu)如(ru)上(shang)(shang)，然(ran)而并(bing)非用以限定本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)，任(ren)何(he)熟悉本(ben)(ben)專(zhuan)業的技術(shu)(shu)(shu)人員，在不(bu)脫(tuo)離(li)本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)技術(shu)(shu)(shu)方案(an)范(fan)圍(wei)(wei)內，當可利用上(shang)(shang)述揭示的技術(shu)(shu)(shu)內容作出些許(xu)更動或修(xiu)飾為等同(tong)變化(hua)的等效實(shi)施例(li)(li)，但(dan)凡是未(wei)脫(tuo)離(li)本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)技術(shu)(shu)(shu)方案(an)內容，依據(ju)本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)的技術(shu)(shu)(shu)實(shi)質對以上(shang)(shang)實(shi)施例(li)(li)所作的任(ren)何(he)簡(jian)單修(xiu)改(gai)、等同(tong)變化(hua)與修(xiu)飾，均仍(reng)屬于本(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)技術(shu)(shu)(shu)方案(an)的范(fan)圍(wei)(wei)內。