一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及超低溫保存領域，具體涉及一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方 法。
【背景技術】
[0002] 超低溫保存是上世紀70年代發展起來的一項現代種質資源離體保存技術。通常 在液氮中保存，被保存材料細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩定的 生物學狀態，達到長期保存種質的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續繼代的中長期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結晶的玻 璃化態，并以這種玻璃態在低溫下保存。玻璃化法因操作簡單快捷，成本低，適宜保存種類 廣泛，保存材料遺傳性穩定，保存效果好等優點，是近十年來用于優良種質資源中長期保存 的首選方法。
[0003] 山葡萄（VitisamurensisRupr.)，是葡萄科（Vitaleae)葡萄屬（Vitis)多年生 落葉藤本漿果類果樹，起源于我國東北、俄羅斯遠東地區，朝鮮半島亦有分布。山葡萄品種 基本不發生白腐病、黑痘病和穗軸褐枯病，霜霉病發生較輕或不發生，不需噴布農藥防治病 害，用其漿果釀造"綠色山葡萄"酒己成為現實，由于山葡萄漿果含糖量（可溶性固形物）可 達18% -23%，由釀造低檔甜紅山葡萄酒上升到釀造高檔干紅山葡萄酒已成為現實。隨著 山葡萄釀酒業的不斷發展，對原料的需求量越來越大，因而，對山葡萄苗木的需求量也將越 來越大。建園繁殖山葡萄苗木的常規方法有壓條繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖和實生繁殖。壓 條繁殖的繁殖系數低；嫁接繁殖受到接穗來源的限制；扦插繁殖不易生根；而實生繁殖中， 山葡萄為多基因雜合體，種子播種育苗，會出現90%左右的低產單株。而40年代興起的組 培繁殖技術實用于山葡萄工廠化育苗，該技術在育種方面具有重要的意義。①加快繁殖，② 病原脫除，③種質資源的交換和保存。因此，通過體細胞胚胎發生的離體快速繁殖和種質資 源的保存對山葡萄優質種苗的需求至關重要。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，用于山葡萄 種質資源的保存，為體細胞胚發生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑。
[0005] -種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，包括誘導愈傷組織、風干、超低溫保 存、化凍的步驟。
[0006] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，所述誘導愈傷組 織包括：
[0007] 步驟1 :以山葡萄莖段為材料接種在下列培養基中：
[0008] MS培養基；
[0009]
[0010] 培養條件：溫度25±2°C，光照強度1200LUX-1600LUX，每天光照16h誘導愈傷組 織。
[0011] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，所述風干包括：將 愈傷組織切塊并進行風干；所述超低溫保存包括：
[0012] 將風干后的山葡萄愈傷組織浸入到含有冷凍保護液的凍存管中，然后將凍存管迅 速投入到液氮中進行超低溫保存；所述化凍包括：將液氮中保存的愈傷組織取出置于水浴 鍋中化凍。
[0013] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，在化凍之后，還包 括以下步驟：
[0014] 步驟a:用MS培養基添加質量百分比含量為3%的蔗糖液體作為最終培養基沖洗 兩次，每次10~12分鐘；
[0015] 步驟b:洗滌后，轉移到下列培養基中：
[0016]MS培養基
[0017]
[0018] 培養條件：在25°C進行暗培養2周，然后移到光照強度1200Lux~1600Lux，每天 光照16h。
[0019] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，所述冷凍保護液 按質量百分比計，包括DMS010%、乙二醇10%、葡萄糖8%，余量：超純水。
[0020] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，所述將愈傷組織 切塊并進行風干包括：將愈傷組織切成0. 2*0. 2cm小塊置于超凈工作臺中鼓風干燥30min。
[0021] 進一步地，如上所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，步驟4中，所述水 浴鍋的溫度為40°C。
[0022] 有益效果：
[0023] 1、山葡萄愈傷組織的繁殖率高。
[0024] 2、避免了田間圃位保存易受自然災害影響而導致種質丟失或毀滅的危險。
[0025] 3、避免了試管苗組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。
[0026] 4、山葡萄愈傷組織不需經過長期繼代保存，降低人工勞動強度。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例2干燥時間對山葡萄愈傷組織存活率的影響圖；
[0028] 圖2為實施例3裝載液對山葡萄愈傷組織存活率的影響圖；
[0029] 圖3為實施例4化凍溫度對山葡萄愈傷組織存活率的影響圖；
[0030] 圖4為實施例5暗培養時間對山葡萄愈傷組織存活率的影響圖。
【具體實施方式】
[0031] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面本發明中的技術方案進行清 楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0032] 本發明提供一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，包括以下步驟：
[0033] 步驟1:以山葡萄莖段為材料接種在MS培養基中添加BA(6_芐氨基腺嘌 呤）2mg?L\NAA(萘乙酸）0?Img?L\蔗糖30g?L\瓊脂7g?L1中，溫度25±2°C，光照 強度1200Lux~1600Lux，每天光照16h的條件下誘導愈傷組織；
[0034] 步驟2 :將愈傷組織切成0. 2*0. 2cm小塊置于超凈工作臺中鼓風干燥30min;
[0035] 具體地，將愈傷組織切成0. 2*0. 2cm小塊置于超凈工作臺中鼓風干燥30min，使愈 傷組織適當脫水，可在超低溫保存過程中防止組織內冰晶的形成。
[0036] 步驟3 :然后浸入到裝有冷凍保護液的凍存管中，然后將凍存管迅速投入到液氮 中進行超低溫保存；
[0037] 具體地，所述冷凍保護液對愈傷組織起到保護作用。
[0038] 步驟4 :將液氮中保存的愈傷組織取出置于40°C水浴鍋中化凍；
[0039] 步驟5 :用MS添加3 %蔗糖液體培養基沖洗兩次，每次10~12分鐘；
[0040] 步驟6 :洗滌后，轉移到MS培養基中添加BA(6-芐氨基腺嘌呤）Img?L1、NAA(萘 乙酸）0. 5mg?L\蔗糖30g?L\瓊脂7g?L1中，在25°C進行暗培養2周，然后移到光照強 度1200LUX~16