專利名稱：致病性鰻弧菌的pcr快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于水產動物疾病的診斷技術，特別是養殖動物的致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
弧菌是海洋水環境微生態系的成員，在海水和海洋生物中廣泛存在。病原性弧菌能引起養殖生物流行病的爆發，導致死亡。鰻弧菌是其中一種非常重要的弧菌性病原，能夠引起養殖魚類的皮膚潰爛、肌體出血和死亡，危害十分巨大。對于致病性鰻弧菌的檢測方法，目前主要有生理生化鑒定技術、熒光抗體技術、酶聯免疫吸附試驗和16srRNA基因探針雜交技術。但這些方法存在一些缺點和不足。生理生化檢測技術十分耗時耗力，并且結果不穩定；熒光抗體技術需要較昂貴的儀器設備；酶聯免疫吸附實驗敏感性不高，還易受干擾因素的影響；16srRNA基因在生物物種中非常保守，因此16srRNA基因探針雜交技術特異性不強。PCR是一種具有敏感性高、特異性強的靶DNA快速檢測方法，樣品中含有少量的細菌就能檢出。然而，采用PCR試劑盒對鰻弧菌的快速檢測目前未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒及其檢測方法。
本發明技術方案如下致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒，包括提供兩對對致病性鰻弧菌DNA特異的引物對1和2、引物對3和4，以及提供一種使用該試劑盒快速測檢和監測多種樣品中致病性鰻弧菌的方法，以實現對致病性鰻弧菌檢測的準確、標準化，為健康養殖提供科學的依據。
本發明的主要原理為試劑A、B和C將樣品中的細菌進行裂解，釋放出細菌DNA，PCR試劑管含多聚酶鏈式反應試劑，通過加入致病性鰻弧菌特異DNA片段引物和Tag酶等成分，對樣品釋放出的DNA進行特異性的擴增。由于我們設計的引物為致病性鰻弧菌所特有，因此，如果樣品中含有致病性鰻弧菌，那么它的DNA的特異片段在經過擴增后，濃度將達到108mol(克分子)以上，在電泳和溴化乙錠染色后，紫外光檢測就可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有鰻弧菌，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。
其中所述快速檢測鰻弧菌的PCR試劑盒的配方如下(1)DNA提取試劑含緩沖試劑A、細胞裂解試劑B和C；試劑ApH為8.0，含有三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它們的濃度分別為10～50mM、1～10mM；試劑BpH為8.0，含有蛋白酶、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它們的濃度分別為1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；試劑C含有十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、氯化鈉，濃度分別為1～10g/ml、5～10M；(2)PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer(10×buffer為10倍濃度的緩沖溶液A)，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物對10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物對20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl滅菌去離子水；(3)Taq酶5～10μl，3U/μl；(4)普通瓊脂糖1～1.2g；可配制成1～1.2％的使用濃度；(5)5～10μg/μl溴化乙錠溶液0.5～1.0ml，可配制成為0.5～1.0μg/ml的使用濃度；(6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚藍上樣緩沖液30～100μl；所述的引物對1和2、引物對3和4是DNA片段，堿基序列分別為5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’；所述PCR試劑的最佳成份為5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM1μl引物4，31μl滅菌去離子水。
采用快速檢測鰻弧菌的PCR試劑盒的檢測方法如下(1)樣品處理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml樣品，100～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；(2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A懸浮沉淀，再加入20～50μl試劑B，或取上清，加入20～50μl試劑B；在55～65℃浴中保溫5～10分鐘，再加入10～50μl試劑C；55～65℃浴中保溫5～10分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000-12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存備用；(3)多重PCR擴增在一PCR試劑管內加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置PCR儀進行擴增；94～96℃解鏈2～5分鐘，然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復性30秒～1分鐘，72℃延伸40秒～1分鐘，如此進行循環25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘；(4)PCR擴增產物分析取5～10μl擴增后的樣品，與2-6μl 0.25～0.75％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的瓊脂糖中進行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒有。
本發明具有如下優點本發明在設計特異引物并成功建立致病性鰻弧菌的多重PCR檢測技術的基礎上，進一步研制成簡單快速敏感的PCR檢測試劑盒，與其它的弧菌病原檢測技術和其它的病原檢測技術相比，本發明方法的顯著的特點是1)檢測十分快速，3-6小時即可得知檢測結果，而其它方法則至少需要24小時或一個星期以上；2)檢測靈敏度極高，檢測下限低至10-100個左右的細菌，其它方法必須經過一定時間的純培養增殖達到105個細菌后才能進行檢測；3)可以應用于多種樣品的檢測，如可以檢測養殖動物遭受鰻弧菌感染的情況，也可以監測養殖水體環境中鰻弧菌，還可以檢測養殖飼料和鮮活餌料是否遭受鰻弧菌污染。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明，但不作為對本發明的限制。
實施例1按以下配方制作快速檢測鰻弧菌的試劑盒試劑ApH為8.0，含10mM Tris、1mM EDTA；
試劑BpH為8.0，含10mg/ml蛋白酶、10mM Tris、1mM EDTA；試劑C含10g/ml CTAB、5M氯化鈉；PCR試劑管成份為5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水；Taq酶10μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.2g；(7)10μg/μl溴化乙錠溶液0.5ml；(8)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
按照以下程序進行檢測(1)樣品處理取0.5g魚組織，用400μl試劑A懸浮樣品，充分勻漿，12000g離心5分鐘；(2)DNA提取棄上清，用200μl試劑A懸浮沉淀，加入50μl試劑B，在65℃浴中保溫10分鐘，再加入試劑C 50μl，65℃浴中保溫10分鐘，12000g離心10分鐘，取上清并加入600μl的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置5分鐘，12000g離心5分鐘，去上清，70％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于30μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，4℃保存備用；(3)PCR擴增在一PCR試劑管內加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/ul Taq酶，3000g離心5秒鐘混勻，置PCR儀進行擴增96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進行循環30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴增產物分析取6μl擴增后的樣品，與3μl 0.25％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5ug/ml的1.0％的瓊脂糖中進行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒有。
其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實驗指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
實施例2按以下配方制作快速檢測鰻弧菌的試劑盒試劑ApH為8.0，含25mM Tris、5mM EDTA；
試劑BpH為8.0，含5mg/ml蛋白酶、25mM Tris、5mM EDTA；試劑C5g/ml CTAB、7.5M氯化鈉；PCR試劑管成份為2.5μl 10×buffer，2.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0μl MgCl2，10μM 0.5ul引物1，10μM 0.5μl引物2，20μM 0.5μl引物3，20μM 0.5μl引物4，15μl滅菌去離子水；(5)Taq酶5μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.0g；(7)5μg/μl溴化乙錠溶液1.0ml；(8)0.5％溴酚蘭上樣緩沖液50μl。
按照以下程序進行檢測(1)樣品處理取0.5g餌料，用200μl試劑A懸浮樣品，充分勻漿，11000g離心3分鐘；(2)DNA提取棄上清，用100μl試劑A懸浮沉淀，加入30μl試劑B，在60℃浴中保溫8分鐘，再加入試劑C 20μl，60℃浴中保溫8分鐘，12000g離心8分鐘，取上清并加入300ul的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置8分鐘，12000g離心8分鐘，去上清，70％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，8℃保存備用；(3)多重PCR擴增在一PCR試劑管內加入1μl DNA提取液，1.0μl 3U/μl Taq酶，4000g離心3秒鐘混勻，置PCR儀進行擴增，96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進行循環30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴增產物分析取10μl擴增后的樣品，與5μl 0.5％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.8ug/ml的1.0％的瓊脂糖中進行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說明樣品有鰻弧菌感染或污染，反之則沒有。
實施例3按以下配方制作快速檢測鰻弧菌的試劑盒(1)試劑ApH8.0，含50mM Tris、10mM EDTA；(2)試劑BpH8.0，含8mg/ml蛋白酶，50mM Tris、10mM EDTA；(3)試劑C1g/ml CTAB、10M氯化鈉；
(4)PCR試劑管成份為5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水；(5)Taq酶8μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.1g；(7)8μg/μl溴化乙錠溶液0.8ml；(8)0.75％溴酚蘭上樣緩沖液30μl。
按照以下程序進行檢測(1)樣品處理取0.1ml水樣，用100μl試劑A，充分混勻，10000g離心2分鐘；(2)DNA提取取上清，加入50μl試劑B，在55℃浴中保溫5分鐘，再加入試劑C 50μl，55℃浴中保溫5分鐘，12000g離心5分鐘，取上清并加入400ul的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘，去上清，75％乙醇洗滌1次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于20μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2℃保存備用；(3)多重PCR擴增在一PCR試劑管內加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/μl Taq酶，5000g離心2秒鐘混勻，置PCR儀進行擴增96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進行循環30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴增產物分析取10μl擴增后的樣品，與2μl 0.75％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為1.0ug/ml的1.1％的瓊脂糖中進行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說明樣品有鰻弧菌感染或污染，反之則沒有。
權利要求
1.一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒，其特征是試劑包括1)DNA提取試劑含緩沖試劑A、細胞裂解試劑B和C；試劑ApH為8.0，含有三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它們的濃度分別為10～50mM、1～10mM；試劑BpH為8.0，含有蛋白酶、三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它們的濃度分別為1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；試劑C含有十六烷基三甲基溴化胺、氯化鈉，濃度分別為1～10g/ml、5～10M；2)PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物對10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物對20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl滅菌去離子水；3)Taq酶5～10μl，3U/μl；4)普通瓊脂糖1～1.2g，可配制成1～1.2％的使用濃度；5)5～10μg/μl溴化乙錠溶液0.5～1.0ml，可配制成為0.5～1.0μg/ml的使用濃度；6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚藍上樣緩沖液30～100μl。
2.根據權利要求1所述致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒，其特征在于所述的引物對1和2、引物對3和4是DNA片段，堿基序列分別為5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’。
3.根據權利要求1所述致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒，其特征在于所述PCR試劑的最佳成分為5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水。
4.一種使用致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于檢測程序如下
1)樣品處理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml樣品，用100～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A懸浮沉淀，再加入20～50μl試劑B，或取上清，加入20～50μl試劑B；在55～65℃浴中保溫5～10分鐘，再加入10～50μl試劑C；55～65℃浴中保溫5～10分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000～12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存備用；3)多重PCR擴增在一PCR試劑管內加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置PCR儀進行擴增；94～96℃解鏈2～5分鐘，然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復性30秒～1分鐘，72℃延伸40秒～1分鐘，如此進行循環25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘；4)PCR擴增產物分析取5～10μl擴增后的樣品，與2-6μl 0.25～0.75％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的瓊脂糖中進行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒有。
全文摘要
本發明公開一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測試劑盒及其檢測方法。本發明的內容包括由緩沖試劑A、細胞裂解試劑B和C、PCR試劑管、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚藍上樣緩沖溶液組成的PCR檢測試劑盒以及一套檢測操作程序。本發明突出的優點是建立多重PCR反應，可快速、準確、敏感地檢測出樣品中的致病性鰻弧菌，為水產養殖動物的疾病診斷提供簡單快速準確的方法，也可應用于對養殖水體和飼料的質量監測。
文檔編號G01N33/569GK1595155SQ03133939
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優先權日2003年9月10日
發明者莫照蘭, 張培軍, 陳師勇, 鄒玉霞, 張振冬, 王春玲, 肖鵬, 徐永立 申請人:中國科學院海洋研究所