在37 °C條件下，陽性血清的0D值隨著包被時間的延長而增加，在37°C包被4h時，P值為1.824，N值 為0.051，P/N值達到最大，為35.758。因此，本試驗的抗原包被的最佳溫度為37°C，最佳包被 時間為4h。
[0048]表1包被條件優化試驗結果
[0049]
[0050]HRP-SPA最適工作濃度及最適作用時間的確定
[00511根據已確定的最佳條件試驗，將HRP-SPA的稀釋度分別設為:1:8000、
[0052] 1:16000、1: 32000、1:64000、1:128000、1: 256000、1:512000，其余按常規間接 ELISA程序操作，以P/N值最大的一組為HRP-SPA最佳工作濃度。
[0053]根據已確定的HRP-SPA最適工作濃度，根據其作用時間將試驗分成37°C條件下 0.5h、lh、1.5h和37°C2h共4組。其余按常規間接ELISA程序操作，以P/N值最大的一組為HRP-SPA最適作用時間。
[0054]由表2可知，隨著HRP-SPA稀釋倍數的增加，陽性血清和陰性血清的0D值呈遞減趨 勢。當HRP-SPA稀釋64000倍時，P值為1.264，N值為0.029，P/N最大，為43.091。本試驗HRP-SPA的最佳稀釋倍數為64000倍。
[0055] 表2HRP-SPA稀釋倍數的選擇
[0056]
[0057] 以HRP-SPA稀釋64000倍進行HRP-SPA最佳反應時間試驗，結果見表3。在0.5h到 1.5h之間，隨著反應時間的延長，P值呈增加的趨勢，反應時間為2h時，P值已趨于平緩。當 HRP-SPA反應1.5h時，P值為1.267，N值為0.032，P/N值最大，為39.594。本試驗HRP-SPA的最 佳工作時間為37°C孵育1.5h。
[0058] 表3HRP-SPA反應時間的選擇
[0059]
[0060] TMB顯色時間的選擇
[0061 ] 根據已確定的最佳條件進行試驗，將顯色時間設為37°C條件下5min、10min、15min和20min，其余按常規間接ELISA程序操作，以P/N值最大的一組為底物最適顯色時間。
[0062] 由表4可以看出，隨著顯色時間的延長，P值呈先升后降的趨勢，當顯色15min時，P 值為1.200，_直為0.020，？/^最大，為59.975<^]\^的最佳顯色時間為151^11。
[0063] 表4TMB顯色時間的選擇
[0064]
[0065]實施例2:特異性實驗
[0066] 2.1交叉試驗
[0067] 用大腸桿菌、不動桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的18h培養菌液，分別制備免 疫原，按基礎免疫程序免疫小鼠，每組5只，共20只。分離血清，用建立的間接ELISA方法檢 測，并設立陽性對照和林麝陰性血清對照。根據P/N值判定這四種菌的血清是否呈銅綠假單 胞菌抗體陽性。交叉試驗檢測結果見表5,分別含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和 不動桿菌的P/N值均小于2,判為陰性，即該方法與上述血清無交叉反應。本試驗建立的間接 ELISA方法特異性較好。
[0068]表5交叉試驗結果
[0069]
[0070] 表示陰性，"+"表示陽性。
[0071] 2.2阻斷試驗
[0072] 取Sp-Ι株陽性血清作2倍比稀釋，從1:250到1:8000,共6個稀釋度，將每個稀釋度 的陽性血清都分為兩份，一份加等體積的最佳稀釋倍數的外膜蛋白，此為阻斷組;另一份加 等體積的包被緩沖液，此為阻斷對照組。將處理后的血清在37°C孵育1.5h后，lOOOOrpm離心 20min。陰性血清也作2倍比稀釋，從1:500到1:16000,共6個稀釋度。按已確定的最佳反應條 件進行試驗，采用雙波長法測定結果，計算阻斷率。阻斷率的計算方法如下：
[0073]
[0074] 阻斷試驗結果
[0075]由表6可以看出，血清稀釋倍數一定時，阻斷組的0D值顯著低于阻斷對照組，阻斷 率在60%以上，說明外膜蛋白能阻斷陽性血清與它的反應。本試驗建立的間接ELISA方法特 異性較好。
[0076] 表6阻斷試驗
[0077]
[0078] 實施例3
[0079] 采用本發明記載的方法檢測32份陽性麝血清，32份陽性麝血清為相同血清。檢測 方法和實驗參數步驟為:按1.5yg/mL包被外膜蛋白，包被溫度和時間為37°C4h;洗滌2次后， 以5%脫脂奶粉在37°C封閉2h;洗滌3次后，加入待檢血清，與外膜蛋白37°C條件下作用 1.5h;洗滌3次后，加入HRP-SPA(稀釋倍數為64000倍），在37°C條件下作用1.5h;洗滌4次后 加入顯色液，37°C作用15min，終止讀數，其中1~16份采用第一種洗滌液洗滌，17~32份采 用第二種洗滌液進行洗滌。本次實驗的檢測結果如下表7。
[0080] 表7:麝血清檢測結果
[0081]
[0082]
[0083]由此可見，本發明的抗體檢測試劑盒具有較高的特異性，檢測結果可靠，誤差率 低。從表7的統計結果分析得知，采用第二種洗滌液的檢測靈敏度和特異性要高于采用第一 種洗滌液，且誤差率也要相對較少;說明采用第二種洗滌液時具有更優的特異性效果和可 靠性。
【主權項】
1. 一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒，包括： 酶標板，用于提供固相載體； 包被于所述酶標板固相載體的銅綠假單胞菌外膜蛋白； 陽性血清、陰性血清、洗滌液、顯色液、酶標二抗以及終止液。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述陽性血清為免疫銅綠假單胞菌的家兔 血清，所述陰性血清為健康麝血清;所述洗滌液為PBST溶液，所述顯色液為TMB試劑;所述酶 標二抗為HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌蛋白A;所述終止液為2mol/L的硫酸溶 液。3. -種銅綠假單胞菌抗體的檢測方法，包括以下步驟： 1) 、將稀釋后的待檢血清加入到酶標板孔內，于37°C條件下作用0.5h~1.5h，反應完畢 后加入洗滌液靜置3min~lOmin，然后洗滌； 2) 、在酶標板中加入稀釋后的酶標二抗HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌蛋白 A，于37°C條件下作用0.5h~l. 5h;加入洗滌液靜置3min~lOmin后再洗滌； 3) 、洗滌完畢后加入顯色劑反應lOmin~20min，顯色反應完畢后加入終止液終止;并使 用酶標儀檢測在450nm和參考波長630nm下的讀數。4. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述待檢血清的加入量為50μ!7孔~200μ L/孔。5. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述洗滌時間為3min~lOmin。6. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述酶標二抗的加入量為50μL7孔~200μ L/孔;酶標二抗的稀釋度為1:64000。7. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述顯色劑的加入量為50μL7孔~200μL7 孔，顯示反應的溫度為37°C。8. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述終止液的加入量為50μL7孔~200μL7 孔。9. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述洗滌液為PBST溶液，每升PBST溶液 中含有ΚΗ2Ρ〇4 0.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐溫-20 0.5mL。10. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述洗滌液為PBST溶液，每升PBST溶液 中含有KH2P〇4 0.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐溫-20 0.5mL，慶 大霉素0.02g，硫酸銨0.05g。
【專利摘要】本發明公開了一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒，包括：酶標板、包被于酶標板固相載體的銅綠假單胞菌外膜蛋白；陽性血清、陰性血清、洗滌液、顯色液、酶標二抗以及終止液。同時，本發明還提供了檢測方法，包括將稀釋后的待檢血清加入到酶標板孔內，反應完畢后加入洗滌液靜置洗滌；在酶標板中加入稀釋后的酶標二抗，于37℃條件下作用0.5h~3h；加入洗滌液靜置3min~10min后再洗滌；洗滌完畢后加入顯色劑反應10min~20min，顯色反應完畢后加入終止液終止；并使用酶標儀檢測在450nm和參考波長630nm下的讀數。本發明的試劑盒以及檢測方法，可以檢測麝血清中的抗體，高效迅速，不僅具有良好的特異性，而且操作簡單，成本低廉。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/543
【公開號】CN105424929
【申請號】CN201510822442
【發明人】熊焰, 王洪永, 任佳會, 唐清山, 廖常偉, 范學華, 喬美萍
【申請人】四川夾金山逢春養殖科技有限公司, 四川農業大學, 鎮坪縣逢春林麝養殖有限責任公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月24日