一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗體檢測方法，具體涉及到一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒及檢測 方法。
【背景技術】
[0002] ELISA(Enzyme-1inkedImmunosorbentAssay)為酶聯免疫吸附試驗的縮寫，該方 法是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合 起來的一種敏感性很高的分析技術。其基本原理是:①使抗原或抗體結合到某種固相載體 表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原 或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，被檢樣品(含有受檢的抗體或抗原） 和酶標抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體結合。通過洗滌除去未結合的游離反應 物，最后，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底 物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與樣品中受檢物質的量直接相關，使用酶標儀 即可定性或定量分析。
[0003] 銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在 的最常見的細菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。銅綠假 單胞菌是一種常見的條件致病菌，屬于非發酵革蘭氏陰性桿菌;是引發麝出現化膿性疾病 的主要菌株。因此通過對麝血清中是否含有抗體進行檢測，以進行科研是非常必要的。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒，以及使用抗體檢測試劑 盒檢測麝血清中抗體的方法。
[0005]為達上述目的，本發明的一個實施例中提供了一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑 盒，包括：
[0006] 酶標板，用于提供固相載體；
[0007]包被于所述酶標板固相載體的銅綠假單胞菌外膜蛋白；
[0008] 陽性血清、陰性血清、洗滌液、顯色液、酶標二抗以及終止液。
[0009] 進一步的，陽性血清為免疫銅綠假單胞菌的家兔血清，陰性血清為健康麝血清;洗 滌液為PBST溶液，顯色液為TMB試劑;酶標二抗為HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌 蛋白A;終止液為2mol/L的硫酸溶液。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種銅綠假單胞菌抗體的檢測方法，包括以下步驟：
[0011] 1)、將稀釋后的待檢血清加入到酶標板孔內，于37°c條件下作用0.5h~3h，反應完 畢后加入洗滌液靜置3min~lOmin，然后洗滌；
[0012]2)、在酶標板中加入稀釋后的酶標二抗HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌 蛋白A，于37°C條件下作用0.5h~3h;加入洗滌液靜置3min~lOmin后再洗滌；
[0013] 3)、洗滌完畢后加入顯色劑反應lOmin~20min，顯色反應完畢后加入終止液終止； 并使用酶標儀檢測在450nm和參考波長630nm下的讀數。
[0014]進一步的，待檢血清的加入量為50yL/孔~200yL/孔。
[0015] 進一步的，洗滌時間為3min~lOmin。
[0016] 進一步的，酶標二抗的加入量為50yL/孔~200yL/孔；酶標二抗的稀釋度為1: 64000〇
[0017] 進一步的，顯色劑的加入量為50yL/孔~200yL/孔，顯示反應的溫度為37°C。
[0018] 進一步的，終止液的加入量為50yL/孔~200yL/孔。
[0019] 進一步的，第一種洗滌液為PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2P〇4〇.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐溫-200.5mL。
[0020] 進一步的，第二種洗滌液為PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2P〇4〇.27g， Na2HP〇4.12H20 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐溫-200.5mL，慶大霉素0.02g，硫酸銨 0 · 05g〇
[0021] 本發明的反應機理
[0022] 本研究采用間接ELISA方法檢測血清標本中的銅綠假單胞菌抗體。以提取的銅綠 假單胞菌Sp-Ι株的外膜蛋白作為包被抗原，包被酶標板，制成固相抗原。往包被抗原的孔中 加入待檢血清，如果血清中有該抗體，則與隨后加入的辣根過氧化物酶(HRP)標記的葡萄球 菌A蛋白（SPA)結合，形成抗原-抗體-HRP-SPA復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB 在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm和 630nm的雙波長下測定吸光度(0D值）。
[0023]本發明的試劑盒以及檢測方法，可以準確的檢測麝血清中的抗體，高效迅速，不僅 具有良好的特異性，而且操作簡單，成本低廉。
【具體實施方式】
[0024]免疫原的制備
[0025]將銅綠假單胞菌Sp-Ι菌株復壯培養后，挑取單個菌落接種于100mL普通肉湯培養 基，于37°C160r/min搖床振蕩培養16h后作為種子液，此種子液按1%的體積比接種于新鮮 普通肉湯中進行增菌培養12~18h。
[0026]按培養基總體積加入終濃度為0.4%的甲醛滅活，37°C溫箱培養24h，期間拿出搖 晃幾次。將滅活后菌液6000r/min離心15min，棄上清，用滅菌的0.lmol/L、PH7.4的PBS洗滌3 次，調節菌含量至1.0X101()CFU/mL，備用。然后釆用注射器混勻法，取上述菌液和等量的弗 氏完全佐劑分別加入小瓶中，反復抽吸吹打注射器，直至形成油包水乳劑為止，滴在水中不 立即擴散，4°C保存情況下不分層即可，并以此作為首免抗原。另取上述部分滅活菌液加入 弗氏不完全佐劑制成后續免疫抗原。
[0027] 免疫程序
[0028]a.基礎免疫:首次免疫用弗氏完全佐劑抗原在4只健康家兔的背部皮下多點注射， 2.5mL/只；第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐劑抗原，劑量同前，每次免疫間隔14d。 在第三次免疫前采取少量耳緣靜脈血，檢測血清抗體效價。
[0029]b.加強免疫:三次免疫后一周，每只家兔再用3mL未滅活的等量濃度菌液進行加強 免疫，一周后米血檢驗血清效價。
[0030] Sp-1株抗血清的分離
[0031] 采集的血液置37°Clh后轉入4°C冰箱過夜，小心吸取析出的血清，經3000r/min離 心15min，分裝于1.5mL的EP管，存于_80°C備用。
[0032 ]雙向瓊脂擴散試驗測免疫血清效價
[0033]以提取的銅綠假單胞菌外膜蛋白作為抗原，將分離的Sp-Ι株抗血清以2倍比稀釋， 采用雙向瓊脂擴散試驗檢測抗體效價，同時設陰性對照和生理鹽水的空白對照。效價達到 1:8倍的可作為本試驗中的陽性血清。
[0034]本發明提供一種銅綠假單胞菌抗體檢測試劑盒，包括：
[0035]酶標板，用于提供固相載體；
[0036]包被于所述酶標板固相載體的銅綠假單胞菌外膜蛋白；
[0037]陽性血清、陰性血清、洗滌液、顯色液、酶標二抗以及終止液。
[0038]其中，陽性血清為免疫銅綠假單胞菌的家兔血清，陰性血清為健康麝血清;洗滌液 為TOST溶液，顯色液為TMB試劑;酶標二抗為HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌蛋白 A;終止液為2mol/L的硫酸溶液。
[0039]銅綠假單胞菌抗體ELISA的檢測方法
[0040] 1)、將待檢血清加入到酶標板孔內，每孔100yL，于37°C條件下作用1.5h，反應完畢 后加入洗滌液靜置5min，然后洗滌3次；
[0041 ] 2)、在酶標板中加入稀釋后的酶標二抗HRP-SPA辣根過氧化物酶-金黃色葡萄球菌 蛋白A，酶標二抗的稀釋度為1:64000，每孔100yL，于37°C條件下作用1.5h;加入洗滌液靜置 5min后再洗滌；
[0042] 3)、洗滌完畢后加入顯色劑在37°C下反應15min，每孔100yL，顯色反應完畢后加入 終止液2mol/L的硫酸終止;并使用酶標儀檢測在450nm和參考波長630nm下的讀數。
[0043] 其中，洗滌液為？831'溶液，每升？831'溶液中含有1012?〇4〇.278，似 2耶〇4，12!120 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐溫-200.5mL;慶大霉素0.02g，硫酸銨0.05g。
[0044]實施例1:檢測條件的選擇 [0045]抗原包被條件的優化
[0046]以確定的外膜蛋白濃度包被酶標板，將包被條件設為4°C條件下分別放12h、24h， 37°C條件下分別放此、211、311、411，共6組，每組做兩個重復。以確定的最佳稀釋倍數稀釋血 清，HRP-SPA做1: 2000稀釋，其余按常規間接ELISA程序進行試驗。以P/N值最大的一組為抗 原最適包被條件。
[0047]從表1可以看出，37°C包被條件下的P/N值明顯大于4°C包被條件下的P/N值。