銅綠假單胞菌的psr檢測方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其設及細菌的分子生物學檢測方法，特別是設及銅 綠假單胞菌的PSR檢測方法及其專用引物與試劑盒。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌的學名是Pseudomonasaeruginosa,是一種常見的條件致病菌，屬 于非發酵革蘭氏陰性桿菌。菌體細長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排 列。菌體的一端有單鞭毛，在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察可見細菌運動活潑。
[0003] 本菌為專性需氧菌，生長溫度范圍25~42°C，最適生長溫度為25~30°C，特別是 該菌在4°C不生長而在42°C可W生長的特點可用W鑒別。在普通培養基上可W生存并能產 生水溶性的色素，如綠脈素（pyocynin)與帶巧光的水溶性巧光素（pyoverdin)等。在血平 板上會有透明溶血環。
[0004] 該菌含有0抗原（菌體抗原）W及H抗原（鞭毛抗原）。0抗原包含兩種成分：一 種是其外膜蛋白，為保護性抗原；另一種是脂多糖，有特異性。0抗原可用W分型。
[0005] 經常引起術后傷口感染，也可引起稱瘡、脈腫、化脈性中耳炎等。本菌引起的感染 病灶可導致血行散播，而發生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。 銅綠假單胞菌引起的很多感染發生在衰弱或免疫受損的住院病人，它是重癥監護室感染的 第二位最常見的病原菌，是呼吸機相關性肺炎的常見原因。除醫院內獲得感染外，HIV感染 者很容易在社區獲得該菌的感染，而且一旦被銅綠假單胞菌感染，常可出現晚期HIV感染 的體征。
[0006] 聚合酶螺旋反應（PolymeraseSpiralReaction,PSR)是一種全新的核酸恒 溫體外擴增方法 <Xiu,W,DongD,YangZ,ZouD,QienZ,化anJ,HuangL.Polymerase SpiralReaction(PSR):Anovelisothermalnucleicacidamplificationmethod.Sci. R巧.2015, 5, 12723.)，運種方法通過在兩條引物的5'端加上一段互為反向的序列，可W使 引物W自我為模板采用自螺旋擴增的方式將目標核酸片段大量擴增出來。只需要兩條引 物，在大片段DNA聚合酶的作用下，恒溫60°C-65°C保持30-120分鐘，便可W將祀序列大 量擴增出來，僅需要兩條引物且不需要熱循環便可W大量擴增祀序列是PSR的顯著特點。 同時也可W通過添加兩條加速引物來大大加速擴增反應的進程，可W使擴增時間縮短至 20-30分鐘W內，特別適合床頭檢測和現場的快速檢測。整個PSR反應只需要一種酶，大大 簡化了操作，使成本也大大降低。由于僅需要兩條引物，所W對祀序列的要求也大大減少， 特別適合于一些變異較大的病毒的快速檢測。在設計引物的時候引入了外源序列，運樣的 話就增加了對擴增產物操作的可能性，可W把擴增產物用于雜交、標記、示蹤等各種修飾應 用。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測銅綠假單胞菌的PSR專用引物與試劑盒問世。

【發明內容】

[0007] 本發明的一個目的是提供用于檢測銅綠假單胞菌的聚合酶螺旋反應引物。
[000引本發明提供的成套引物，其由引物1、引物2、引物3、和引物4組成；
[0009] 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核巧酸序列分別為序列表中 的序列2、序列3、序列4和序列5。
[0010] 上述引物中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為2 :2 : 1:1。
[0011] 本發明另一個目的是提供用于檢測銅綠假單胞菌的聚合酶螺旋反應試劑。
[0012] 本發明提供的反應試劑，包括上述引物。 陽〇1引上述聚合酶螺旋反應試劑由DNA聚合酶、Tris?肥1、KC1、（畑4)25〇4、Tween20、甜 菜堿、Mg2\dNTPs、上述的引物和水組成；
[0014] 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述聚合酶螺旋反應試劑中 的濃度分別為 40pmol/ul、40pmol/ul、20pmol/ul和 20pmol/ul。
[0015] 本發明第=個目的是提供用于檢測銅綠假單胞菌的聚合酶螺旋反應試劑盒。
[0016] 本發明提供的試劑盒，其包括上述的引物或上述的聚合酶螺旋反應試劑。
[0017] 為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為銅綠 假單胞菌的DNA，所述陰性對照為不含DNA的PSR擴增體系（如雙蒸水）。
[0018] 具體的，該銅綠假單胞菌的PSR檢測試劑盒包括：20mMTris?肥1 (抑8. 8)，IOmM KCl，10mM(NH4)2S〇4,〇.l%Tween20,0. 8M甜菜堿化etaine)，8mMM拆〇4，1.4mMdNTPeach, 8UBstDNApolymerase，40pmolFT和BT，20pmolIF和IB，HNB指示劑，銅綠假單胞菌的 基因組DNA(25yIPSR反應體系中使用2yI)和雙蒸水。
[0019] 如下a)或b)的應用也是本發明保護的范圍：
[0020] a)上述的引物在制備上述試劑盒中的應用；
[0021] b)上述引物，或上述試劑，或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否 含有銅綠假單胞菌的產品中的應用；
[0022] C)上述引物，或上述試劑，或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測菌是否為銅 綠假單胞菌的產品中的應用。
[0023] 本發明第四個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測菌是否為銅綠假單胞菌的方 法。
[0024] 本發明提供的方法，包括如下步驟：用上述引物對所述待測菌進行PSR反應，檢測 PSR反應產物確定待測菌是否為銅綠假單胞菌。 陽0巧]上述方法中，所述PSR反應的溫度為65 °C。
[00%] 上述方法中，所述檢測PSR反應產物確定待測菌是否為銅綠假單胞菌的方法為： 若能實現擴增，則所述待測菌為或候選為具核梭桿菌；若不能實現擴增，則所述待測菌不為 或候選不為具核梭桿菌。
[0027] 所述檢測PSR反應產物確定待測菌是否為銅綠假單胞菌的方法具體為1)或2):
[0028] 1)、濁度儀檢測所述待測菌PSR反應產物濁度變化曲線，若所述待測菌PSR反應 產物濁度變化曲線呈上升狀態，則所述待測菌為或候選為銅綠假單胞菌，若所述待測菌PSR 反應產物濁度變化曲線不呈上升狀態，則所述待測菌不為或候選不為銅綠假單胞菌；
[0029] 2)在所述PSR反應中添加巧黃綠素與氯化儘混合液，檢測所述待測菌PSR反應產 物的顏色，若所述待測菌PSR反應產物為藍色，則所述待測菌為或候選為銅綠假單胞菌，若 所述待測菌PSR反應產物不為藍色，則所述待測菌不為或候選不為銅綠假單胞菌。
[0030] 上述方法中，所述PSR反應的模板為待測菌的基因組DNA。
[0031] 采用W上方案，本發明具有W下優點：
[0032] 1)高特異性：4條引物對銅綠假單胞菌祀序列的6個特異區域的識別保證了PSR 擴增的高度特異性，即PSR能從相差僅一個核巧酸的基因標本中找出相應的祀序列進行擴 增； 陽03引。高靈敏度：靈敏度比普通PCR方法高10倍；
[0034] 3)結果鑒定簡便：可通過肉眼觀察結果（HNB顯色），也可W直接用濁度儀判斷結 果；
[0035] 4)操作簡單：只要將檢測樣品（祀核酸）和檢測試劑一起放入60-65°C恒溫水浴 鍋中50分鐘后就可W判斷結果；
[0036] 5)快速、高效擴增：整個PSR擴增反應一小時內即可完成，且產率可達到0. 5mg/ mLo
[0037] 綜上所述，本發明可W在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到銅 綠假單胞菌，不需要復雜儀器，為銅綠假單胞菌的檢測提供了新的技術平臺，可用于基層醫 療衛生單位和各疾病預防控制中屯、篩查和檢測銅綠假單胞菌，具有廣闊的市場前景和較大 的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
[0038] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發明銅綠假單胞菌PSR檢測方法最佳溫度的濁度儀結果。
[0040] 圖2為本發明銅綠假單胞菌PSR檢測方法特異性的濁度儀和抑染色檢測結果。
[0041] 圖3為本發明銅綠假單胞菌的PSR檢測方法對銅綠假單胞菌靈敏度的濁度儀和FD 染色檢測結果W及銅綠假單胞菌靈敏度的PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方