一種副溶血弧菌檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于水產養殖微生物檢測技術領域，具體涉及一種副溶血弧菌檢測方法。
【背景技術】
[0002]副溶血弧菌(Vibr1parahaemolyticus,簡稱 VP)最早是由 Fujino 等于 1953 年從日本一個食物中毒患者中初次分離得到的，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常呈多態性，有鞭毛，無莢膜和芽孢。副溶血弧菌分布于世界各地，通常廣泛分布于近海區域、鹽湖及魚、貝類等海產品中，是沿海地區引起食物中毒的重要病原菌，可導致患者出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和頭疼等典型胃腸炎反應，嚴重者可引起敗血癥。我國沿海地區每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報道。副溶血弧菌在食物中的數量超過106即可引起腹瀉、敗血癥甚至死亡。1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引發食物中毒的規模呈明顯的上升趨勢，已超過沙門氏菌引起的食物中毒，躍居首位。為有效控制副溶血弧菌病原的發生擴散，準確即時的檢測手段是預防控制該菌傳播的關鍵所在。
[0003]目前對副溶血弧菌常用的檢測方法有生化鑒定、免疫學方法、分子生物學方法等。但是這些方法在快速檢測、定性和精確定量方面難以兼顧，并且傳統方法費時費力，對于需要檢測大量樣本的出入境檢疫、食品、衛生以及獸醫部門的實驗室是一種沉重的負擔。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種副溶血弧菌檢測方法，從而彌補現有技術的不足。
[0005]本發明的副溶血弧菌檢測方法，包括如下的步驟:
[0006]1)生物素-抗體復合物的制備
[0007]用N，N- 二甲基甲酰胺將生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯配制成溶液，將生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入到副溶血弧菌鞭毛蛋白抗體溶液中，冰浴反應制成生物素-抗體復合物；過量未反應和水解的生物素用微量透析管4°C攪拌透析去除；
[0008]2)量子點-抗體的制備
[0009]將量子點標記的鏈霉親和素-525與步驟1)制備的生物素-抗體在PBS溶液中混合，輕柔震蕩15min制成量子點-抗體；再加入過量的生物素封閉量子點-抗體，再用微量透析管4°C攪拌透析去除生物素得到純化的量子點-抗體(QDs-Ab);
[0010]3)制備待檢測樣品的囷懸液
[0011]取待測樣品接入液體培養基中振蕩培養得到菌懸液；
[0012]4)菌懸液的熒光檢測
[0013]在激發波長(λ ex)為350nm，發射波長(λ em)為450nm?600nm的條件下掃描測量量子點-抗體(QDs-Ab)的熒光值，然后加入氧化石墨烯GO溶液，再將菌懸液加入氧化石墨烯G0溶液中得到反應體系；相同條件下測量熒光值，如果熒光強度未發生顯著變化，說明待測樣品中未檢出副溶血弧菌，如果熒光強度部分恢復，說明待測樣品中檢出副溶血弧菌。并且隨著菌液濃度升高，熒光強度也隨之升高，因此可以實現對副溶血弧菌的定量檢測。
[0014]步驟3)的培養條件是28 °C、180rpm進行培養；
[0015]步驟3)的液體培養基為2216E培養基；
[0016]作為優選，步驟3)的液體培養基的配方如下:胰蛋白胨10g、魚蛋白胨10g、酵母粉lg、FeP04 0.lg、NaCl 30g、酪蛋白水解物 5g、牛肉浸粉 10g、CaCl2 2.0mg、MgCl2 4mg、蒸餾水1L0
[0017]步驟4)的反應體系中QDs-Ab的濃度優選為InM，氧化石墨稀G0的濃度優選為60ng/ml。
[0018]本發明方法的優點如下:1)快速:在短時間內即可完成副溶血弧菌的檢測；2)高效靈敏:最低檢出限達到10 7個/ml ;3)特異性強:該方法能夠特異性的檢出副溶血弧菌；
4)定性定量檢測:根據熒光強度的變化，即可定性判定副溶血弧菌的有無，并可實現對副溶血弧菌的精準定量檢測。
【附圖說明】
[0019]圖1:本發明的檢測方法示意圖，
[0020]圖2:量子點標記鏈霉親和素-525的紫外可見吸收光譜和熒光光譜圖；
[0021]圖3:實施例1的檢測結果圖。
[0022]圖4:實施例1特異性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0023]本發明通過量子點標記副溶血弧菌菌體鞭毛蛋白抗體(Ab)，實現副溶血弧菌的快速、特異性檢測。檢測方案見圖1。首先將抗體與生物素連接，再將鏈霉素共價修飾的發綠色熒光的量子點通過鏈霉素-生物素相互反應與抗體連接起來得到量子點-抗體(QDs-Ab)。QDs-Ab的熒光通過加入GO產生了淬滅，從而構建了捕獲目標細菌的探針。一旦這種細菌捕獲探針暴露于副溶血弧菌中，由于抗原抗體共價反應，QDs-Ab將被釋放出來，從而能夠檢測到重新恢復強度的綠色熒光。利用這一新型檢測方法，能夠快速、特異的檢測副溶血弧菌。
[0024]本發明使用的材料試劑記載如下:
[0025]材料:
[0026]NaH2P04.2H20、Na2HP04.12H20、NaCl均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯，N，N-二甲基甲酰胺購自Sigma公司；副溶血弧菌鞭毛蛋白抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；量子點標記的鏈霉親和素-525(SA-QDs)購自武漢珈源量子點公司。
[0027]儀器:
[0028]紫外可見吸收光譜數據由紫外-可見光分光光度計測定；熒光光譜數據由熒光分光光度計收集。
[0029]下面結合實施例對本發明的方法進行詳細的描述。
[0030]實施例1
[0031]1)制備菌懸液
[0032]將副溶血弧菌標準菌株ATCC 33844接種于2216E液體培養基(蛋白胨5g、酵母粉lg、FeP040.lg、NaCl 30g、蒸餾水1L)中，傳代培養3次，28°C過夜培養，吸取1ml菌液，滅菌生理鹽水梯度稀釋后用血球計數板計數。
[0033]2)生物素-抗體的制備
[0034]副溶血弧菌鞭毛蛋白抗體的濃度為lmg/ml。用N，N_ 二甲基甲酰胺將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯配制成2.5mg/ml的溶液，將0.8 μ 1此溶液迅速加入10 μ 1副溶血弧菌鞭毛蛋白抗體溶液中，冰浴2.5h。過量未反應和水解的生物素用微量透析管4°C攪拌透析8小時去除，期間換液1?2次。生物素-抗體的終濃度用紫外-可見光分光光度計測定，濃度為 0.8mg/mlo
[0035]3)量子點-抗體的制備
[0036]將1 μ Μ的量子點標記的鏈霉親和素-525與合適濃度的生物素-抗體在10mM PBS溶液中混合，輕柔震蕩15min。加入過量的生物素封閉量子點-抗體，再用微量透析管4°C攪拌透析8小時，期間換液1?2次，純化的量子點-抗體(QDs-Ab)用紫外-可見光分光光度計進行測定，濃度為0.7mg/mlo
[0037]4)熒光檢測
[0038]該反應體系包括InM的QDs-Ab，60ng/ml的GO和1.3 X 10 2個/ml的副溶血弧菌，由15mM的PBS(pH 8.0，15mM NaCl)緩沖液配制，終體積為0.6ml。溶液的熒光發射光譜，在15分鐘后測定。所有的光學測量在室溫環境條件下進行，激