促使北青龍衣中胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法及胡桃醌與胡桃酮的含量測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法及胡桃醌與胡桃酮的含量測定方 法。
【背景技術】
[0002] 癌癥是威脅人類生命的嚴重疾病，抗癌藥物的研究與開發一直是世界醫藥學界關 注的熱點。癌癥的復發和轉移是癌癥患者兩大主要死因，標志著治療失敗。中醫藥通過多 途徑綜合治療及調動機體整體防御體系，在癌癥的治療領域展現出越來越重要的作用。
[0003] 北青龍衣又稱核桃青皮，為胡桃科植物核桃揪（juglans mandshurica Maxim)的 未成熟外果皮。主要分布在我國黑龍江省東部，小興安嶺、完達山、老爺嶺及張廣才嶺等山 區。作為一種民間藥在我國的應用由來己久，最初記載于《開寶本草》，稱之為胡桃青龍，《救 急方》中稱之為青胡桃皮，自《山東中草藥手冊》稱之為"青龍衣"后，現多延用此名。其藥 性苦、澀，古代醫家多以其清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢功效入藥，近年來因其抗腫瘤效果 突出而備受國內外學者的廣泛關注。青龍衣含有萘醌及其苷類、黃酮及其苷類、鞣質、二芳 基庚烷類、萜類、有機酸類等化學成分，具有顯著的抗腫瘤活性，對胃癌、肝癌、淋巴癌、乳腺 癌、白血病的腫瘤細胞均具有較好的體內外抑瘤作用。
[0004] 2001年，北青龍衣藥材收載于《黑龍江省中藥材標準》，2004年黑龍江省中醫藥科 學院以其為主要原料開發了醫院制劑復方青龍衣膠囊（藥制字（2004)Z第0061)，并且經大 量臨床病例證明其抗腫瘤療效確切。該藥物具有抗腫瘤、調節免疫、止癌痛、抗轉移與化藥 協同增效五種療效。
[0005] 萘醌類成分是北青龍衣中公認的最有效的抗腫瘤成分，胡桃醌為其代表性化合 物。由于北青龍衣中胡桃醌的含量產地差異性大，所以目前利用北青龍衣制備的抗癌藥物 質量難以掌控，嚴重的影響了北青龍衣在臨床的使用和治療效果。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是為了解決目前因產地不同北青龍衣中胡桃醌差異性大，導致利用 北青龍衣制備的抗癌藥物質量難以掌控的問題，而提供的一種促使北青龍衣中胡桃酮苷水 解為胡桃酮的方法及胡桃醌與胡桃酮的含量測定方法。
[0007] 本發明促使北青龍衣中胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法按以下步驟進行：
[0008] 將青龍衣粉末加入甲醇溶液進行超聲處理，冷卻后濾過，取濾液加入酸性溶液回 流水解，即實現北青龍衣中結合型胡桃酮苷水解為游離型胡桃酮。
[0009] 胡桃醌與胡桃酮的含量測定方法，采用高效液相梯度檢測，檢測波長為265nm， 進樣量為10 μ 1，流速為lml/min ;梯度洗脫條件為初始流動相中甲醇與水的濃度配比為 45ml :55ml，第30~35min流動相中甲醇與水的濃度配比為75ml :25ml，第35min之后流動 相中甲醇與水的濃度配比為45ml :55ml。
[0010] 胡桃酮苷是北青龍衣中另外一種含量較高的萘醌類衍生物，胡桃酮苷在北青龍衣 中以苷和苷元的形式同時存在，胡桃醌與胡桃酮苷水解產物胡桃酮的含量之和在各產地北 青龍衣之間相對穩定，約為2mg/g~2. 5mg/g。因此，本發明方法促使北青龍衣中結合型胡 桃酮苷水解為游離型胡桃酮，使不同產地北青龍衣的抗腫瘤活性主要成分含量達到穩定， 從而保證了北青龍衣抗癌藥物的質量和穩定性，使北青龍衣臨床使用的安全性和可靠性大 幅提升。
[0011] 由于胡桃醌與胡桃酮的分子式極為接近，分子量也相近，所以其他方法難以將胡 桃醌與胡桃酮加以區分。本發明胡桃醌與胡桃酮的含量測定方法，不僅能夠將胡桃醌與胡 桃酮明確的區別分開，而且可以準確的測定其含量，并具有準確性高的特點。
【附圖說明】
[0012] 圖1是實施例11中對照品高效液相梯度檢測結果圖。
[0013] 圖2是實施例11中水解液高效液相梯度檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0014] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0015] 一：本實施方式促使北青龍衣中胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法按以 下步驟進行：
[0016] 將青龍衣粉末加入甲醇溶液進行超聲處理，自然冷卻至室溫后濾過，取濾液加入 酸性溶液回流水解，即實現北青龍衣中結合型胡桃酮苷水解為游離型胡桃酮。
[0017] 其中，青龍衣粉末與甲醇溶液的比例為0. 5g~3g :25ml ;超聲處理時間為40min， 超處理頻率為30~70kHZ ;回流溫度為70±5°C，回流時間為1±0. 2h。
【具體實施方式】 [0018] 二：本實施方式與一的不同點是：甲醇溶液的濃度為 20%~100%。其它步驟及參數與實施方式一相同。
【具體實施方式】 [0019] 三：本實施方式與一或二的不同點是：濾液與酸性溶 液的體積比為15 :1. 5~14。其它步驟及參數與實施方式一或二相同。
【具體實施方式】 [0020] 四：本實施方式與一至三之一的不同點是：酸性溶液 的體積濃度為25%。其它步驟及參數與實施方式一至三相同。
【具體實施方式】 [0021] 五：本實施方式與一至四之一的不同點是：酸性溶液 為鹽酸或硫酸。其它步驟及參數與實施方式一至四相同。
【具體實施方式】 [0022] 六：本實施方式按以下步驟測定胡桃醌與胡桃酮的含量：采用高效 液相梯度檢測，檢測波長為265nm，進樣量為10 μ 1，流速為lml/min ;梯度洗脫條件為初始 流動相中甲醇與水的濃度配比為45ml :55ml，第30~35min流動相中甲醇與水的濃度配比 為75ml :25ml，第35min之后流動相中甲醇與水的濃度配比為45ml :55ml。
[0023] 實施例1
[0024] 促使北青龍衣中胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法按以下步驟進行：
[0025] 將青龍衣粉末加入甲醇溶液進行超聲處理，自然冷卻至室溫后濾過，取濾液加入 體積濃度為25%的HCl中回流水解，即實現北青龍衣中結合型胡桃酮苷水解為游離型胡桃 酮。
[0026] 其中，青龍衣粉末與甲醇溶液的比例為2g :25ml ;甲醇溶液的體積濃度為30% ;超 聲處理時間為40min，超處理頻率為50kHZ ;回流溫度為60°C，回流時間為Ih ;濾液與鹽酸 溶液的體積比為15 :7。
[0027] 實施例2
[0028] 本實施例與實施例1的區別點在于甲醇溶液的體積濃度為60%。
[0029] 實施例3
[0030] 本實施例與實施例1的區別點在于甲醇溶液的體積濃度為100%。
[0031] 實施例1~3北青龍衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表1所示。
[0032] 表 1
[0033]
[0034] 實施例4
[0035] 促使北青龍衣中胡桃酮苷水解為胡桃酮的方法按以下步驟進行：
[0036] 將青龍衣粉末加入甲醇溶液進行超聲處理，自然冷卻至室溫后濾過，取濾液加入 體積濃度為25%的HCl中回流水解，即實現北青龍衣中結合型胡桃酮苷水解為游離型胡桃 酮。
[0037] 其中，北青龍衣粉末與甲醇溶液的比例為2g :25ml ;甲醇溶液的體積濃度為60% ; 超聲處理時間為40min，超處理頻率為40kHZ ;回流溫度為60°C，回流時間為Ih ;濾液與鹽 酸溶液的體積比為15 :7。
[0038] 實施例5
[0039] 本實施例與實施例4的區別點在于取濾液加入0. 2mol/L NaOH溶液中回流水解； 濾液與NaOH溶液的體積比為15 :7。
[0040] 實施例6
[0041] 本實施例與實施例4的區別點在于濾液揮干后加入酶液中60°C水解30min，之后 沸水滅活；Ig α -淀粉酶加入50ml pH值6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中配置成本實 施例酶液；濾液與酶液的體積比為15 :7。
[0042] 實施例4~6北青龍衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表2所示。
[0043] 表 2
[0044]
酸性條件下水解能夠增加胡桃酮的含量，堿性條件下水解胡桃醌、胡桃酮含量均顯著 降低，而酶水解對二者含量均無影響。
[0045] 實施例7
[0046] 本實施例與實施例4的區別點在于取濾液加入體積濃度為25%的H2S04溶液中回 流水解；濾液與H2S04溶液的體積比為15 :7。
[0047] 實施例4和7北青龍衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表3所示。
[0048] 表 3
[0049]
[0050