一種免疫親和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種免疫親和方法。
【背景技術】
[0002] 作為一項樣品前處理技術,固相萃取柱已得到實驗室廣泛地應用。隨著固相萃取 技術的不斷發展,一種新型萃取柱一一免疫親和柱正悄然代替傳統固相萃取柱。免疫親和 柱(IAC)基于抗原抗體反應,利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結合 的特性而制作的一種分離萃取柱,具有獨特的選擇專一性和良好的吸附凈化性能。處理過 的樣品提取液在緩慢通過免疫親和柱時,樣品提取液中的分析物與柱內的抗體結合,而未 被結合的其它雜質經洗滌后除去,再用洗脫液沖洗柱體,收集分析物。較傳統固相萃取柱, 免疫親和柱對目標物的選擇性更強,吸附凈化效果更好,且所消耗的試劑更少。
[0003] 利用上述免疫親和柱進行免疫親和時存在以下幾個問題: 1.免疫親和由于使用抗體基質代替傳統固相填料,為保持柱內抗體活性,需將抗體置 于活性液中。而目前免疫親和柱通常體積較小,無法有足夠的體積儲存活性液,且活性液經 常存在溢出、漏液等情況。
[0004] 2.單根免疫親和柱的抗體數量是固定的,這也決定了單根免疫親和的可容納目標 物濃度是有限的。當目標物超過柱內抗體所能結合的抗原限度,將導致目標物流失,無法有 效定量分析目標物濃度。
[0005] 3.在使用免疫親和柱的過程中,常出現分析樣品液較混濁導致親和柱堵塞的現 象,影響親和柱的抗體抗原結合能力,甚至無法正常開展淋洗、洗脫等后續步驟。
[0006] 上述因素限制了免疫親和柱的推廣使用和商品化,需要一種簡單、有效的裝置來 解決這些問題。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有技術的不足,提供了一種免疫親和方法。
[0008] 本發明解決技術問題所采取的技術方案為: 本發明方法具體是: 首先根據分析對象的具體目標物,在免疫親和柱中填充相對應的抗體基質,具體是:首 先在空柱腔中放入下篩板,接著填入抗體基質,再放入上篩板,下壓上篩板使抗體基質分布 均勻,并起到固定抗體填充區的作用。
[0009] 其次灌入抗體活性液保持抗體活性,活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液 面刻度線,擰緊上下堵頭,置于合適的環境溫度待使用。
[0010] 然后根據目標物的濃度范圍,選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使 用,確定免疫親和柱的根數;具體是:將要使用的免疫親和柱取出,去掉上下堵頭,固定免 疫親和柱于合適位置;待活性液全流出后,根據實驗需要加入待分析樣品液;確認分析樣 品液全流出后,加入適量淋洗液,并將其擠干棄去。
[0011] 最后加入目標物洗脫液,收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。
[0012] 所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱,所述伸縮型螺旋組合式免 疫親和柱包括上堵頭、下堵頭和上樣管。
[0013] 所述上堵頭周向帶有外螺紋,上堵頭與上樣管進口螺紋配合。
[0014] 所述下堵頭周向帶有內螺紋,下堵頭與上樣管出口螺紋配合。
[0015] 所述上樣管包括進口、柱腔和出口,進口周向帶有內螺紋,用于結合固定上堵頭或 者組合固定另一免疫親和柱的出口;出口周向帶有外螺紋,用于結合固定下堵頭或者組合 固定另一免疫親和柱的進口。
[0016] 所述柱腔包括伸縮區和免疫親和區;伸縮區設置于進口下方,免疫親和區位于出 口上方,免疫親和區內從上至下設置有上篩板、抗體填充區和下篩板;在柱腔外壁標識有最 高液面刻度線,該最高液面刻度線位于伸縮區下方。
[0017] 進一步說,若分析樣品較混濁,則擰緊上堵頭,擠壓伸縮區。
[0018] 本發明的有益效果在于: 1.伸縮型螺旋組合式免疫親和柱由于柱腔容量大,并配有上下兩堵頭擰于進出口,提 高了活性液體積,增強了免疫親和的整體密封性,在保證有充足的抗體活性液同時,又達到 了防溢出、漏液等情況的出現。
[0019] 2.采用多根伸縮型螺旋組合式免疫親和柱方式,使免疫親和過程中的抗體數量成 倍數增長,從根本上解決了免疫親和方法中的可容納目標物濃度有限的問題。
[0020] 3.伸縮型螺旋組合式免疫親和柱帶有伸縮區,在使用免疫親和過程中可將上堵頭 擰緊進口,可通過側面擠壓或者向下壓縮伸縮區,增大柱腔內壓力,達到提高柱腔溶液流速 和充分排除殘留液的目的,同時還可防止柱腔堵塞。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明中伸縮型螺旋組合式免疫親和柱結構示意圖; 圖2為本發明中使用單根免疫親和柱示意圖; 圖3為本發明中使用多根免疫親和柱示意圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
[0023] 如圖1所示,伸縮型螺旋組合式免疫親和柱主要包括以下部分:上堵頭1、下堵頭 2、上樣管3。上堵頭1高L5-L 8 cm,具外翻螺紋,外徑0.8-0. 9 cm,螺旋式擰于上樣管進 口;下堵頭2高L 6-2.0 cm,具內陷螺紋,內徑0.4-0. 5 cm,螺旋式擰于上樣管出口。上樣管 3高9. 0-10.0 cm,外壁材料為聚乙烯,包括進口 4、柱腔5和出口 6。進口 4高0· 9-1.0 cm, 具內陷螺紋,內徑為0.9-1. 0 cm,外徑1.0 -Ll cm,用于結合固定上堵頭1或者組合固定另 一免疫親和柱的出口 6。出口 6高0.9-1. 0 cm,具外翻螺紋,內徑0· 1-0.2 cm,外徑0.3-0. 4 cm,用于結合固定下堵頭2或者組合固定另一免疫親和柱的進口 4。柱腔5高7. 0-8.0 cm, 內徑L 4-1. 5 cm,外徑L 5-1. 6 cm,可容納分析體積為6-7 mL,柱腔5包括伸縮區7、免疫 親和區8及最高液面刻度線9。伸縮區7設置于離進口 4距為0.7-0. 8 cm,未伸縮高度為 I. 1-1. 2 cm,厚度偏薄,為0.1-0. 2 cm。免疫親和區8位于出口 6上方,高度L 3-1. 4 cm, 從上至下設置有上篩板10、抗體填充區11和下篩板12。最高液面刻度線9位于柱腔外壁 具伸縮區7下方0. 9-1. 0 cm。
[0024] 利用上述免疫親和柱,進行免疫親和的方法: 根據分析對象的具體目標物,填充相對應的抗體基質,具體是:首先在空柱腔中放入下 篩板,接著填入抗體基質,再放入上篩板,下壓上篩板使抗體基質分布均勻,并起到固定抗 體填充區的作用。
[0025] 然后灌入抗體活性液保持抗體活性,活性液的最高液面要低于免疫親和柱的最高 液面刻度線,擰緊上下堵頭,置于合適的環境溫度待使用。根據目標物的濃度范圍,選擇單 根免疫親和柱或者多根組合使用,確定免疫親和柱的根數。將要使用的免疫親和柱取出,去 掉上下堵頭,固定免疫親和柱于合適位置(若是多根組合使用,優先組合免疫親和柱)。待活 性液全流出后,根據實驗需要加入合適體積的待分析樣品液(若分析樣品較混濁,可擰緊上 堵頭,擠壓伸縮區)。確認分析樣品液全流出后,加入適量淋洗液,并將其擠干棄去。最后加 入合適的目標物洗脫液,收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。
[0026] 實施例:水產品中河豚毒素的免疫親和凈化應用。
[0027] 將河豚毒素抗體填入到柱腔內,高度為1. 2-1. 3 cm,蓋好篩板,并注入活性液,擰 緊上下堵頭,保存于〇_5°C環境,待使用。
[0028] 準確稱取已充分均質馬面魚樣品2. 00 g于50 mL具塞離心管中,加入10 mL含有 1%乙酸的甲醇溶液,渦旋振蕩2 min,60°C水浴超聲提取15 min,冷卻至室溫后,6000 r/min 離心5 min。移取5 mL上清液至另一 50 mL離心管中,加入20 ml PBS溶液進行稀釋,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7~8,待凈化。
[0029] 取出免疫親和柱,去掉上下堵頭,放出柱內保存活性液后,上樣品液。上樣結束后, 用8 mL水淋洗親和柱,擠干柱內殘留液,并棄去以上全部流出液,最后用4 mL含有1%乙酸 的甲醇溶液洗脫,收集的洗脫液于60°C氮氣吹干,用I mL流動相定容溶解,經0.22 μπι濾 膜后供液相色譜-質譜分析。按照上述步驟平行測定6次,結果如表1所示。在1.50 Pg/ kg添加水平下,六次測定的平均回收率為96. 7%,相對標準偏差為3. 24%。整個免疫親和凈 化過程耗時為30 min。
[0030] 表1利用免疫親和凈化測定水產品中河豚毒素的殘留量結果(/7=6)
實驗結果表明使用本發明方法能有效吸附目標物,從而達到凈化的效果。同時整個凈 化過程時間短,操作簡單,具有較高的實際應用價值。
[0031] 以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已,當然不能以此來限定本發明之權利 范圍,因此依本發明要求所作的等同變化,仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
【主權項】
1. 一種免疫親和方法,其特征在于該方法具體是: 首先根據分析對象的具體目標物,在免疫親和柱中填充相對應的抗體基質,具體是:首 先在空柱腔中放入下篩板,接著填入抗體基質,再放入上篩板,下壓上篩板使抗體基質分布 均勻,并起到固定抗體填充區的作用; 其次灌入抗體活性液保持抗體活性,活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液面刻 度線,擰緊上下堵頭,置于合適的環境溫度待使用; 然后根據目標物的濃度范圍,選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使用,確 定免疫親和柱的根數;具體是:將要使用的免疫親和柱取出,去掉上下堵頭,固定免疫親和 柱于合適位置;待活性液全流出后,根據實驗需要加入待分析樣品液;確認分析樣品液全 流出后,加入適量淋洗液,并將其擠干棄去; 最后加入目標物洗脫液,收集分析免疫親和柱流出的洗脫液; 所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱,所述伸縮型螺旋組合式免疫親 和柱包括上堵頭、下堵頭和上樣管; 所述上堵頭周向帶有外螺紋,上堵頭與上樣管進口螺紋配合; 所述下堵頭周向帶有內螺紋,下堵頭與上樣管出口螺紋配合; 所述上樣管包括進口、柱腔和出口,進口周向帶有內螺紋,用于結合固定上堵頭或者組 合固定另一免疫親和柱的出口;出口周向帶有外螺紋,用于結合固定下堵頭或者組合固定 另一免疫親和柱的進口; 所述柱腔包括伸縮區和免疫親和區;伸縮區設置于進口下方,免疫親和區位于出口上 方,免疫親和區內從上至下設置有上篩板、抗體填充區和下篩板;在柱腔外壁標識有最高液 面刻度線,該最高液面刻度線位于伸縮區下方。2. 根據權利要求1所述的一種免疫親和方法,其特征在于:若分析樣品較混池,則擰緊 上堵頭,擠壓伸縮區。
【專利摘要】本發明公開了一種免疫親和方法。本發明首先根據分析對象的具體目標物,在免疫親和柱中填充相對應的抗體基質。其次灌入抗體活性液保持抗體活性,活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液面刻度線,擰緊上下堵頭,置于合適的環境溫度待使用。然后根據目標物的濃度范圍,選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使用,確定免疫親和柱的根數。最后加入目標物洗脫液,收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱。本發明提高了活性液體積,增強了免疫親和的整體密封性,在保證有充足的抗體活性液同時,又達到了防溢出、漏液等情況的出現。
【IPC分類】G01N30/02, G01N33/53, G01N30/60
【公開號】CN105136915
【申請號】CN201510396382
【發明人】張小軍, 嚴忠雍, 喻亮, 李佩佩, 方益, 祝銀
【申請人】浙江省海洋水產研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年7月8日