屬于GH3家族的耐熱性β-木糖苷酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種耐熱性β-木糖巧酶、編碼上述耐熱性β-木糖巧酶的多核巧酸、 用于表達上述耐熱性β-木糖巧酶的表達載體、整合了上述表達載體的轉化體、W及使用 上述耐熱性β-木糖巧酶的木質纖維素分解產物的制造方法。
[0002] 本申請要求基于2014年8月4日在日本申請的特愿第號的優先權， 并在本文中引用其內容。
【背景技術】
[0003] 除了對運輸用能源供應的擔憂之外，由于全球變暖和大氣污染等環境上的問題， 近年來，石油替代能源的開發成為非常重要的課題。植物生物質是地球上最豐富的可再生 能源，作為石油替代資源而備受期待。作為植物生物質的主要成分的木質纖維素為纖維素、 半纖維素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖類，W及木質素。運些多糖類被各 種糖巧水解酶水解為葡萄糖或木糖等單糖后，用作生物燃料或化學品原料。
[0004] 具有復雜結構的木質纖維素是難分解性的，難W用單一的酶分解或糖化 (hy化olysis)。因此，對于多糖類中的纖維素的水解，通常需要糖巧水解酶中的內切葡聚糖 酶（內切-1，4-β-D-葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 4)、外切型纖維二糖水解酶（1，4-β-纖維二糖 糖巧酶（cellobiosidase)或纖維二糖水解酶，EC3. 2. 1. 91、EC3. 2. 1. 176)、β-葡糖巧酶 巧C3. 2. 1. 21)運Ξ種酶。另一方面，半纖維素的構成因植物的種類而異，例如，在闊葉樹和 草本植物中，木聚糖構成了主要成分。對于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（內切-1，4-β-木 聚糖酶，EC3. 2. 1.8)、β-木糖巧酶巧C3. 2. 1. 37)。β-木糖巧酶對通過木聚糖酶水解半 纖維素生成的低聚糖進行水解，是設及單糖生成工藝的水解酶之一。 陽0化]在W往的W木質纖維素為資源的生物乙醇的制造中，W乙醇的高能效轉化為目 的，嘗試了基于高固液比（30~60%的固液比）的糖化處理（hy化olysisprocess)。運種 基于高固液比的木質纖維素的酶糖化，生物質糖化液的粘性高，難W進行木質纖維素的水 解反應。因此，通過使用耐熱性酶在例如80°CW上的高溫下進行木質纖維素的酶解糖化處 理，除了加快水解反應速度之外，降低了生物質糖化液的粘性，從而有望實現縮短糖化反應 時間并降低酶量。因此，對于各種糖巧水解酶，期望開發耐熱性更優異的酶。
[0006] 大多數耐熱性糖巧水解酶可W通過如下方式獲得：對生存于高溫環境下的嗜熱性 微生物進行分離鑒定，從運些分離培養的微生物中克隆基因，確定DNA序列后，利用大腸桿 菌或絲狀真菌等表達而獲得。例如，專利文獻1公開了來源于絲狀真菌的β-木糖巧酶，專 利文獻2公開了在30°C表現出酶活性的、來源于絲狀真菌米曲霉（Aspergillus0巧zae)的 0-木糖巧酶。專利文獻3中公開了在抑5.5W下、50°CW上表現出酶活性的、來源于酸熱 脂環酸芽抱桿菌（Alixyclobacillusacidocaldarius)的β-木糖巧酶。專利文獻4公開 了在45°C表現出酶活性的、來源于解纖維頂抱霉（Acremoniumcellulolyticus)的β-木 糖巧酶。另外，非專利文獻1~6報道了最適溫度為6(TC左右的、分離自特定細菌或絲狀真 菌的β-木糖巧酶。
[0007] 現有技術文獻 陽00引專利文獻
[0009] 專利文獻1 :特表平第11-507837號公報
[0010] 專利文獻2 :特開平第11-313683號公報
[0011] 專利文獻3 :特表第號公報
[0012] 專利文獻4 :特開第2013-59272號公報
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1 :Ko;rmelink等，《JournalofBiotechnology(生物技術雜志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 頁。
[0015] 非專利文獻 2iHerrmann等，《BiochemicalJournal(生化雜志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381頁。
[0016] 非專利文獻 3:kitamoto等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology應用 與環境微生物學）》，1999年，第65卷，第20-24頁。
[0017] 非專利文獻 4:LaGrange等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology應用 與環境微生物學）》，2001年，第67卷，第5512-5519頁。
[0018] 非專利文獻 5 :化ao等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology(應用與環 境微生物學）》，2011年，第77卷，第719-726頁。
[0019] 非專利文獻6:Morais等，《JournalofBiologicalQiemistry(生物化學雜 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221頁。

【發明內容】

[0020] 本發明要解決的技術問題
[0021] 本發明的目的是提供一種至少在85°C且P冊.0的條件下表現出W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（PNP訝為底物的水解活性的新耐熱性β-木糖巧酶、編碼上述耐熱 性β-木糖巧酶的多核巧酸、用于表達上述耐熱性β-木糖巧酶的表達載體、整合了上述表 達載體的轉化體、W及使用上述耐熱性β-木糖巧酶制造木質纖維素分解產物的方法。
[0022] 解決技術問題的技術手段
[0023] 本發明的發明人為了解決上述問題，通過從溫泉高溫±壤中直接提取DNA來進行 難培養微生物群的大規模宏基因組測序，成功獲取具有新的氨基酸序列的耐熱性β-木糖 巧酶，從而完成了本發明。
[0024]目Ρ，作為本發明的耐熱性β-木糖巧酶、多核巧酸、表達載體、轉化體、耐熱性 0-木糖巧酶的制造方法、糖巧水解酶混合物、W及木質纖維素分解產物的制造方法，可W 列舉下列山~[10]。
[00對 山一種耐熱性β-木糖巧酶，其特征在于具有由下列（Α)、做或似構成的 β-木糖巧酶催化區域：
[0026] (Α)由序列號1所示氨基酸序列構成的多膚；
[0027] 度）由序列號1所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而形成 的氨基酸序列所構成的、并且至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃 木糖巧為底物的水解活性的多膚； 陽02引 似由與序列號1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列構成 的、并且至少在85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解 活性的多膚。
[0029] 凹上述山的耐熱性β-木糖巧酶，其進一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0030] 閒一種多核巧酸，其具有由下列（a)~（e)的堿基序列構成的編碼β-木糖巧酶 催化區域的區域：
[0031] (a)編碼由序列號1所示氨基酸序列構成的多膚的堿基序列；
[0032] 化）編碼由序列號1所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所構成的、并且至少在85 °C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列；
[0033] (C)編碼由與序列號1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列構 成的、并且至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水 解活性的多膚的堿基序列；
[0034] (d)與序列號2或3所示堿基序列具有80%W上序列一致性、并且編碼至少在 85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的 堿基序列；
[0035] (e)與由序列號2或3所示堿基序列構成的多核巧酸在嚴格條件下進行雜交的多 核巧酸的堿基序列、且編碼至少在85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木 糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列。
[0036] [4]上述巧]的多核巧酸，上述多膚進一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0037] [引一種表達載體，其整合了上述[3]或[4]的多核巧酸，在宿主細胞中可表達具 有0-木糖巧酶活性的多膚。
[00測 [6] -種轉化體，其導入有上述閒的表達載體。
[0039] [7]上述[6]的轉化體，其為真核微生物。 W40] 閒上述耐熱性β-木糖巧酶的制造方法，其包括在上述[6]或[7]的轉化體中生 產上述耐熱性β-木糖巧酶。
[OOW[9] -種糖巧水解酶混合物，其包含上述山或凹的耐熱性β-木糖巧酶、上述 [3]或[4]的多核巧酸編碼的耐熱性β-木糖巧酶、或者利用上述[引的耐熱性β-木糖巧 酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶及至少一種其他糖巧水解酶。
[0042] [10] -種木質纖維素分解產物的制造方法，其包括使含有纖維素、半纖維素及木 質素的木質纖維素所形成的材料與上述[1]或[2]的耐熱性β-木糖巧酶、上述[3]或[4] 的多核巧酸編碼的耐熱性β-木糖巧酶、上述[6]或上述[7]中記載的轉化體、利用上述 [引的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶、或者上述[9]的糖巧水 解酶混合物接觸，由此生產木質纖維素分解產物。 陽0創發明效果
[0044] 本發明的耐熱性β-木糖巧酶至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（下面有時縮寫為PNP訝為底物的水解活性。因此，上述耐熱性β-木 糖巧酶適合于高溫條件下的、木質纖維素所形成的材料的糖化處理。
[0045] 此外，作為另一方面，上述耐熱性β-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含具有 e-木糖巧鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0046] 此外，作為又一方面，上述耐熱性β-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含具有 0 -木糖巧鍵的低聚糖、或具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0047]另外，上述包含具有β-木糖巧鍵的低聚糖的材料可通過例如對包含半纖維素的 木質纖維素進行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料可通 過例如對包含纖維素的木質纖維素進行纖維二糖水解酶的水解而得到。此外，本發明的多 核巧酸、整合了上述多核巧酸的表達載體、導入有上述表達載體的轉化體適合用于制造本 發明的耐熱性β-木糖巧酶。
【附圖說明】
[0048] 圖1為基因克隆AR19M-346-18的β-木糖巧酶活性催化區域的氨基酸序列（序 列號1)與F'ervidobacteriumgondwanense的G冊木糖巧酶（序列號7)的氨基酸序列的 比對圖。 W例 圖2為表示實施例1中的AR19M-346-18基因在大腸桿菌中表達得到的 AR19M-346-18蛋白的SDS-PAGE分析結果的圖。
[0050] 圖3為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白對各底物的水解 活性的測定結果的圖。
[0051] 圖4為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白在各溫度下的 PNK(水解活性（P冊.0)的測算結果的圖。 陽05引 圖5為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白在各抑的PNPX 水解活性（70°C)的測算結果的圖。
[0053] 圖6為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白示出的、伴隨熱變 性而引發的SYPR0化ange(寶石澄蛋白染色試劑）的巧光強度變化的圖。
【具體實施方式】
[0054][耐熱性β-木糖巧酶]
[0055] 眾所