一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領域。編碼所述肌酸水解酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。所得肌酸水解酶突變體的半衰期相比野生型分別提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更適合工業應用。
【專利說明】
一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體
技術領域
[0001] 本發明涉及一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領域。
【背景技術】
[0002] 肌酸水解酶(Creatinase，EC 3.5.3.3，簡稱CRE)是酶促檢測法中檢測肌酐的一種 必不可少的酶，主要來源于微生物。在一些研究中發現一些屬的菌株能夠通過誘導產生肌 酸水解酶并在細胞中積累。這些細菌有假單胞菌屬、梭菌、黃桿菌屬、芽孢菌屬、產堿菌屬等 等。但由于原始菌的肌酸水解酶產量很低，且誘導劑的價格較高，不適合進行工業化大規模 生產。同時，對肌酸水解酶的性質分析發現其具有底物親和力低、熱穩定性差等特點。而在 實際應用中需要有大量的酶，不利于工業生產。
[0003] 目前對肌酸水解酶性質分析比較深入的菌株主要是惡臭假單胞菌、節桿菌和產堿 桿菌。綜合分析不同來源的肌酸水解酶學性質，多數肌酸水解酶的最適反應pH范圍為7.0~ 8.0，在中性、弱堿和弱酸條件下保持穩定。已報道的肌酸水解酶的最適反應溫30~40°C，而 熱穩定性不是很理想，在45°C以下相對穩定，溫度一旦高于45°C，酶活會迅速下降。因此，對 肌酸水解酶的熱穩定性研究很有必要。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的問題是提供一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體。
[0005] 編碼所述肌酸水解酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQIDN0.4SSEQIDN0.5K*。
[0006] 本發明還提供一種獲得上述肌酸水解酶突變體的方法，包括以下步驟:PCR獲得編 碼突變體的核苷酸序列，連接表達載體，轉化E. coli BL21，以TB培養基培養重組菌，使之表 達突變體。
[0007] 本發明還提供表達上述肌酸水解酶突變體的基因工程菌，是以pET_20b為載體構 建重組表達載體，轉化宿主BL21 (DE3)。
[0008] 本發明還提供一種肌酐檢測試劑盒，含有所述的肌酸水解酶突變體。
[0009] 本發明的有益效果在于：提高肌酸水解酶的熱穩定性，所得肌酸水解酶突變體的 半衰期相比野生型分別提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更適合工業應用。
【具體實施方式】
[0010] LB培養基:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。
[0011] TB 培養基：蛋白胨 12g/L、酵母粉 24g/L、甘油 10g/L、KH2P042.32g/L、K2HP〇4l6.43g/ L〇
[0012] 采用分光光度法測定肌酸水解酶酶活。單位酶活定義：lmin內將肌酸水解產生1μ mol尿素所需要的酶量。酶活測定條件為：在試管中加入900yL肌酸溶液，在室溫中平衡 5min。后加入100yL待測酶液，在37 °C反應10min，然后向反應體系中加入2mL對-二甲胺基苯 甲醛溶液終止反應，并置于25°C溫育20min，在435nm處測定吸光度值，以水調零。空白管是 在肌酸溶液中先加入對-二甲氨基苯甲醛，后加入待測酶液，其它步驟與測定管一致。
[0013]實施例1高熱穩定性突變菌株的獲得
[0014] 利用定點突變試劑盒(TaKaRa)，設計多對引物，以載體PET20J(煙草節桿菌肌酸酶 的高效異源表達與應用分析[J].食品與生物技術學報)為模板對第368位和第195位兩個位 點進行飽和突變。編碼野生肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015] PCR 反應條件為 981€31^11，34個循環（981€311^11、581€305、72。(：111^11305)、72 1€ lOmiruPCR擴增體系:模板ΙμL、上下游引物各ΙμL，2x PrimeStar 24μ1、滅菌的雙蒸水24μ1。 PCR結束后，加入5μ1 的FD Buffer、lyU9DpnHf^^lh。
[0016] 將含有編碼突變體的基因的質粒，轉化E.coli BL21，挑選轉化子接種到LB液體培 養基中，37°C培養12h，轉化至TB培養基，接種量為3 %。菌體長到OD600為3時，加入IPTG，使其 終濃度為〇. 6mmol/L，并將培養溫度降到30 °C，培養8h。收集發酵后的菌體，超聲破碎后測定 相同溫度下保溫不同時間的酶活。篩選到Pet20J-V368L、Pet20J-K195C、Pet20J-K195L、 Pet20J-K195V、Pet20J-K195T五個正向突變株，分別對應肌酸水解酶突變體V368L、肌酸水 解酶突變體K195C、肌酸水解酶突變體K195L、肌酸水解酶突變體K195V、肌酸水解酶突變體 K195T。
[0017] 實施例2肌酸水解酶的純化
[0018] 破碎大腸桿菌后進行硫酸銨沉淀，選擇55 % -75 %硫酸銨飽和度的沉淀，用少量 磷酸鹽緩沖液(PH 7.0)溶解蛋白沉淀，透析24h除去酶液中的硫酸銨。根據肌酸水解酶的等 電點性質，選擇QFF柱進行離子交換純化。QFF柱以磷酸鹽緩沖液平衡30min，將粗酶液注入 純化柱中，用含有1M NaCl的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
[0019 ]實施例3突變體的純酶液的性質測定
[0020] 將純化后的各肌酸水解酶突變體稀釋，測定突變體在50°C下保溫不同時間的酶活 并計算其半衰期（ti/2，min)，發現五個突變體￥3681^、1(195￥、1(1951'、1(195(：、1(1951^較訂分別提 高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍(如表1所示）。除此之外，1(195(：的1^值較町下降了72.4%，1(195￥ 和1(195(：的比酶活較訂分別提高了41.9%、47.9%。
[0021] 表1酶學性質
[0022]
[UUM」 雖然不友明已以敉住頭施例公開卯上，但兵開非用以限疋不友明，仕例熟戀此扠 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種肌酸水解酶，其特征在于，編碼所述肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. I、 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4SSEQIDN0.5m*。2. 編碼權利要求1所述肌酸水解酶的核苷酸序列。3. 含有權利要求2所述核苷酸序列的載體或細胞。4. 一種獲得權利要求1所述肌酸水解酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:PCR獲得編 碼突變體的核苷酸序列，連接表達載體，轉化E. coli BL21，以TB培養基培養重組菌，使之表 達突變體。5. -種表達權利要求1所述肌酸水解酶的基因工程菌，其特征在于，是以pET-20b為載 體構建重組表達載體，轉化宿主BL21(DE3)。6. 權利要求1所述肌酸水解酶在檢測肌酐中的應用。7. -種肌酐檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的肌酸水解酶。8. 權利要求7所述的肌酐檢測試劑盒在肌酐檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK105907739SQ201610294244
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】劉松, 李江華, 阮潔, 陳堅, 堵國成
【申請人】江南大學