一種β-葡萄糖苷酶基因及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種β?葡萄糖苷酶基因。所述β?葡萄糖苷酶基因從土壤總DNA中獲取，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1。本發明的β?葡萄糖苷酶不需要利用表面展示或者信號肽表達的技術就可直接使菌體利用纖維二糖，從而進行丁二酸的生產。
【專利說明】
一種β-葡萄糖苷酶基因及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種β-葡萄糖苷酶基因及其應用。
【背景技術】
[0002] β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)屬于水解酶。它可以水解并且結合末端、非還原性的 β-D-葡萄糖及相應配基。該酶可以將纖維二糖或短鏈葡聚糖水解成葡萄糖。因其參與纖維 素水解的最后一步，所以常被認為是纖維素水解糖化過程的限速酶。葡萄糖苷酶按照氨 基酸序列可以劃分為糖苷水解酶家族1和糖苷水解酶家族3兩類。糖苷水解酶家族1中的酶 主要來源于細菌、植物和哺乳動物;糖苷水解酶家族3中酶來源于真菌、細菌和植物。可見其 來源比較廣泛。β-葡萄糖苷酶一般通過表面展示和信號肽表達的方式達到在胞外分解纖維 二糖為葡萄糖，以此供給細胞利用生長，目前尚未有葡萄糖苷酶不需要通過表面展示或 者信號肽表達就可以利用纖維二糖生長的報道。

【發明內容】

[0003]本發明的技術目的之一，在于提供一種來自土壤總DNA的β-葡萄糖苷酶基因，所述 的土壤總DNA采集自南京工業大學東操場邊上小花園附近。
[0004] 為實現上述技術目的，本發明采用如下技術方案：
[0005] 本發明所述的β-葡萄糖苷酶基因，來源于南京工業大學東操場邊上小花園附近土 壤總DNA，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0006] 所述的β-葡萄糖苷酶基因是通過構建土壤總DNA的基因組文庫，經過一系列酶切、 酶連、轉化等手段獲得所需的陽性克隆，提取陽性克隆質粒測序，獲得葡萄糖苷酶核苷酸 序列。再根據所得到序列設計引物通過PCR即獲得目的基因。優點是方便快捷效率高。
[0007] 為獲得本發明所述β-葡萄糖苷酶基因，具體步驟為：
[0008] (1)樣品采集:土壤樣品采自南京工業大學東操場邊上小花園附近。
[0009] (2)土壤總DNA的提取:稱取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液 和玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇 (1:1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0010] (3)構建土壤總DNA的基因組文庫：用限制性內切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經 瓊脂糖凝膠電泳分離回收2_3kb的DNA片段，與脫磷載體pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)連接后，化學轉化導入制備好的E.coli DH5a感受態細胞，構建基因組文庫。
[0011] 限制性內切酶Ecoia酶切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調至總體積30yL。
[0012] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應。酶切產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收2-3kb DNA片段。回收按照試劑盒說明書進行。
[0013] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0014] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EcoRI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應12h以上。
[0015] ⑷酶連產物的轉化和獲取陽性克隆:將l〇yL酶連產物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態細胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后，快速轉移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復蘇細胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態細胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養箱培養，12-16h后出現菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽性克隆子，同時對陽性克隆子進行編號。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長出菌懸液后提質粒驗證。
[0016] (5)提取陽性克隆質粒測序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽性克隆子插入片段 的測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據兩端測序結果設計引物，直至將整個插入片段測通。
[0017] 將測序完成的序列在NCBI數據庫中進行比對，并利用ORF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0018] (6)引物的設計與合成:根據測序結果的基因序列設計PCR引物，引物設計如下： [0019]設計長度為50mer左右的引物，該引物分為兩個部分，P1的第一部分是上游載體末 端同源序列，第二部分是基因特異性正向擴增序列。P2的第一部分是基因特異性反向擴增 序列，第二部分是下游載體末端同源序列。
[0020] 利用PCR進行β-葡萄糖苷酶基因擴增，在50yL反應體系中，P1、P2兩個引物的添加 量為 lyL，擴增條件為:94°C 預熱 10min;94°C，45s;60°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個循環，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國）。
[0021] PCR結束后，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測定濃度。同時對于表達載體pET-28a( + )用 限制性內切酶EcoRI酶切線性化，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測定濃度。計算最適克隆載體使 用量（=0.02 X克隆載體堿基對數)ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基對 數)ng(例如，將長度為2kb的插入片段克隆至長度為5kb的克隆載體時，克隆載體的最適使 用量應為：0.02 X 5000 = 100ng;插入片段最適使用量應為：0.04 X 2000 = 80ng)。利用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進行重組反應。37°C反應30min后轉化到DH5a感受 態中。獲得長度為2775bp的SEQ ID N0:1序列的陽性克隆，即為本發明的β-葡萄糖苷酶基 因。
[0022] 本發明還提供了一種重組載體，所述重組載體含有上述的β-葡萄糖苷酶基因。
[0023] 本發明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述重組載體。
[0024]所述宿主細胞可為原核細胞。
[0025] 所述原核細胞可為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。
[0026]為實現上述技術目的，具體可采用如下技術方案:將上述SEQ ID N0:1序列直接與 原核表達載體pET-28a( + )連接，37°C反應30min。將該載體轉化感受態大腸桿菌DH5a。將菌 液涂布在含30yg/mL卡那霉素霉素的固體LB培養基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~ 2%瓊脂)培養后獲得單菌落。挑取單菌落用5mL液體LB試管培養過夜，提質粒，進行單雙酶 切驗證。選取驗證正確質粒轉化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。將菌液涂布含30yg/mL卡那 霉素的固體LB培養基培養后獲得單菌落。
[0027] 本發明還提供了本發明所述β-葡萄糖苷酶基因在生產丁二酸中的應用。
[0028] 本發明的β-葡萄糖苷酶是一種新型β-葡萄糖苷酶，它是一類應用非常廣泛的生物 酶類。通過對該基因的原核表達和純化，可以應用于該酶的工業化生產中。本發明的葡萄 糖苷酶不需要利用表面展示或者信號肽表達的技術就可直接使菌體利用纖維二糖，從而進 行丁二酸的生產。
【附圖說明】
[0029]圖1為以本發明β-葡萄糖苷酶基因在E.coli BL21(pET-28a( + ))中高效表達實驗 方案圖。
[0030] 圖2為本發明β-葡萄糖苷酶的最適溫度曲線圖。
[0031] 圖3位本發明β-葡萄糖苷酶的溫度的穩定性曲線圖。
[0032] 圖4為本發明β-葡萄糖苷酶的最適pH曲線圖。
[0033]圖5為本發明β-葡萄糖苷酶的pH的穩定性曲線圖。
[0034] 圖6為金屬離子對本發明β-葡萄糖苷酶酶活的影響柱狀圖。
[0035] 圖7為有機溶劑對本發明β-葡萄糖苷酶酶活的影響柱狀圖。
【具體實施方式】
[0036]以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明的技術方案 而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解， 可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍， 其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0037] 本發明所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪-奧奧德里奇（Sigma-Aldrich)公 司。
[0038] 本發明涉及分子生物實驗，若未特別注明，均參考自《分子克隆實驗指南》一書(J. 薩姆布魯克、D. W.拉塞爾著，2002，科學出版社。）
[0039] 實施例1獲取β-葡萄糖苷酶基因
[0040] 本實施例說明獲取本發明所述β-葡萄糖苷酶基因的方法。具體步驟如下：
[0041] (1)樣品采集:土壤樣品采自南京工業大學東操場邊上小花園附近。
[0042] (2)土壤總DNA的提取:稱取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液 和玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇 (1:1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0043] (3)構建土壤總DNA的基因組文庫：用限制性內切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經 瓊脂糖凝膠電泳分離回收2_3kb的DNA片段，與脫磷載體pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)連接后，化學轉化導入制備好的E.coli DH5a感受態細胞，構建基因組文庫。
[0044] 限制性內切酶Ecoia酶切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調至總體積30yL。
[0045] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應。酶切產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收2-3kb DNA片段。回收按照試劑盒說明書進行。
[0046] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0047] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應12h以上。 [0048] (4)酶連產物的轉化和獲取陽性克隆：將10yL酶連產物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態細胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后。快速轉移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復蘇細胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態細胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養箱培養，12-16h后出現菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽性克隆子，同時對陽性克隆子進行編號。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長出菌懸液后提質粒驗證。
[0049] (5)提取陽性克隆質粒測序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽性克隆子插入片段 的測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據兩端測序結果設計引物，直至將整個插入片段測通。
[0050] 將測序完成的序列在NCBI數據庫中進行比對，并利用ORF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0051] (6)引物的設計與合成:根據測序結果的基因序列設計PCR引物，利用PCR進行β-葡 萄糖苷酶基因擴增，PCR結束后，用1.5%瓊脂糖膠回收片段，測定濃度，即獲取本發明所述 β-葡萄糖苷酶基因。
[0052]實施例2β_葡萄糖苷酶基因的擴增
[0053]本實施例說明β_葡萄糖苷酶基因擴增的具體過程。
[0054] 參看圖1，用PCR方式來克隆本發明的β-葡萄糖苷酶基因。設計的引物分別如下：
[0055] 上游引物PI :Tm = 66.7,45mer;引物序列如下：
[0056] CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAGTAAAATCAACATGG；
[0057] 下游引物P2:Tm = 68.7,52mer;引物序列如下：
[0058] TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTACTTTTTTGCCTTTTCTGTAGAGGTTGCC；
[0059]利用PCR進行β-葡萄糖苷酶基因擴增，在50yL反應體系中，P1、P2兩個引物的添加 量為 lyL，擴增條件為:94°C 預熱 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個循環，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國）。 [0060] PCR結束后，1.5%瓊脂糖膠回收片段，測定濃度。計算最適克隆載體使用量（= 0.02 X克隆載體堿基對數)ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基對數)ng，利 用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進行重組反應。37°C反應30min后轉化到DH5 α感受態中。獲得長度為2775bp的陽性克隆，即為本發明的β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序 列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0061 ]實施例3β_葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達
[0062] 將上述SEQ ID Ν0:1序列直接與原核表達載體pET-28a( + )連接，37°C反應30min。 將該載體轉化感受態DH5a。將菌液涂布含30yg/mL氨芐青霉素的固體LB培養基(質量分數配 方為:2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~2 %瓊脂)培養后獲得單菌落。挑取單菌落用5mL 液體LB試管培養過夜，提質粒，進行單雙酶切驗證。選取驗證正確質粒轉化到大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)。將菌液涂布含30μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養基培養后獲得單菌落。 再挑取單菌落用5mL液體LB試管培養過夜，提質粒，進行單雙酶切驗證，選取驗證正確的菌 落，接種到50mL液體LB培養基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 % NaCl)中，37 °C搖床培養，直到菌 液濃度達到OD600為0.6~0.8時，用終濃度為0.3mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行 誘導表達，25°(：，150印111，誘導2011。
[0063]實施例4β_葡萄糖苷酶的純化
[0064]將實施例3最終獲得的培養液在4°C，8000rpm離心10min獲得菌體，用預冷的50mM Tris-HCl緩沖液(PH=8.5)洗滌三次，最后用預冷的lOOmMTris-HCl緩沖液(PH=8.5)重懸。 超聲破碎得到初酶液，4°C下，12000rpm離心30min，用微孔濾膜過濾離心好的上清，用Ni-Agarose柱子純化出目的蛋白。將目的蛋白透析后用蛋白保存液保存起來。
[0065]實施例5β_葡萄糖苷酶的酶動力學特性分析
[0066] β-葡萄糖苷酶動力學特性分析主要底物為pNPG。反應采用實施例4中的體系。主要 測定酶對底物的1和最大反應速度Vmax。也就是說在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物 濃度對酶促反應的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，酶促反應的速度(v)隨底物濃度 的增加而迅速增加;隨著底物濃度的繼續增加，反應速度的增加開始減慢；當底物濃度增加 到某種程度時，反應速度達到一個極限值(V max)。
[0067] 底物濃度與反應速度的這種關系可用Michaelis-Menten方程式表示：
[0069]式中：V-反應速度;Km_米氏常數;Vmax-酶反應最大速度；[S]-底物濃度。
[0070] 采用Linewaver-Burk作圖法測定1(111、'\^￡?，該法是根據米氏方程的倒數形式，以1八 對1/[S]作圖，得到一條直線。直線在橫軸上的截距為-1/Km，縱截距為1/Vmax，求出K m與Vmax。 所述方程如下所示：
[0072]在這里我們所用的底物的濃度是：pNPG(從0.5mM到8mM)。所得到的結果如表1所 不。
[0073] 表 1
[0074]
[0075]實施例6β_葡萄糖苷酶的生理生化特性分析
[0076]對實施例4中保存的蛋白酶液做特定的生理生化特性分析。本過程是在下述酶反 應體系中進行的：80yL的lOOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ=8.5)加入100yL的8mM的pNPG底物，40 。(:預熱2min后，加入20yL適當稀釋的酶液開始反應，在40°C下反應10min，加入100yL的0.5M 的Na2C03終止反應。然后在405nm處測量對硝基酚的釋放量。在這里我們定義一定數量的酶 在每分鐘催化ΙμΜ的對硝基酚的活力為1U』-葡萄糖苷酶的蛋白濃度是使用Micro-Spectrophotometer K5500來分析的。
[0077] 我們分析的生理生化特性主要有酶的最適溫度，酶的溫度穩定性，酶的最適pH，pH 的穩定性，金屬離子對酶活的影響，有機溶劑對酶活的影響。圖中相對活性是指在最適溫度 和最適pH條件下測定得到的酶活，以此為100%的基準，其他條件下測得活性與之比較從而 得到的比值即為該條件下的相對活性。
[0078] 在研究酶的最適反應的溫度時，反應的溫度從20°C開始，每隔10°C，一直到80°C。 每個體系做3個重復試驗（以下每個反應都是3次重復），研究結果如圖2所示，從圖中可知， 本發明的葡萄糖苷酶在20-50°C具有較高酶活，其中最適溫度為40°C，溫度超過50°C的時 候酶活力快速下降，超過60 °C后基本沒有酶活。
[0079] 在研究酶的溫度穩定性時，主要測定酶在20,30,40和50°C這四個不同溫度處理酶 液，然后在最適溫度下測定酶的殘余活性，研究結果如圖3所示，從圖中可知，本發明的β-葡 萄糖苷酶酶活力隨著時間的增長逐漸降低。在20 °C條件下酶活最穩定，30-40°C條件下活力 依次下降，在50°C的情況下，酶穩定性迅速降低至無活性。可見較低的溫度更適合保存該 酶。
[0080]在研究酶的最適pH時，選擇不同的緩沖液，主要有檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液 (0· 1Μ，ρΗ4· 0-6.0)，磷酸鹽緩沖液（0· 1Μ，ρΗ6· 0-8.0)，Tris-HCl緩沖液（0·05Μ，ρΗ8·0-9.0)，甘氨酸-似0!1緩沖液(0.051，？!18.5-10.0) ;研究結果如圖4所示，從圖中可知，不同？!1 對酶活力有影響，當pH處于酸性環境下，酶活力較低。其中最適pH為8.5,該酶在堿性環境下 比在酸性環境下有更好的酶活力。
[0081 ] 在研究酶的pH穩定性時，是先將酶在不同的pH緩沖液中，在4°C下處理24h，然后在 最適pH下測定酶的殘余活性;研究結果如圖5所示，從圖中可知，該酶在堿性條件下比酸性 條件下更穩定，且在最適pH下穩定性最好。
[0082]在金屬離子對酶活的影響，有機溶劑對酶活的影響是將酶用不同的影響因素處 理，然后在酶的最佳反應體系中測定酶的殘余活性。研究結果如圖6-圖7所示，從圖中可以 看出，基本所有的金屬離子對該酶都有激活作用，其中Fe 2+的激活作用最明顯;有機溶劑中 除了SDS和Tritonx-100對該酶有激活作用，其他有機試劑都起到抑制作用，尿素的抑制作 用最強。
[0083] 經實驗驗證，酶在40°C，pH8.5時活性最高。
[0084] 實施例7
[0085] 本實施例通過實驗描述β-葡萄糖苷酶基因在生產丁二酸中的應用，來說明本發明 葡萄糖苷酶應用于工業化生產的優越性。
[0086] 采用本發明β-葡萄糖苷酶基因生產丁二酸的步驟具體如下：
[0087] (1)構建質粒pTrc99a_bglB，導入大腸桿菌DH5a感受態中。
[0088]其中β-葡萄糖苷酶基因(bg 1B)的獲取方法。具體步驟如下：
[0089]①樣品采集:土壤樣品采自南京工業大學東操場邊上小花園附近。
[0090] ②土壤總DNA的提取:稱取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液和 玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置冰 箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇（1 :1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。
[0091] ③構建土壤總DNA的基因組文庫：用限制性內切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經瓊 脂糖凝膠電泳分離回收2-3kb的DNA片段，與脫磷載體pUC118(BamHI/BAP)(TaKaRa，C 〇de: D3321)連接后，化學轉化導入制備好的E.coli DH5a感受態細胞，構建基因組文庫。
[0092] 限制性內切酶EcoR頂每切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調至總體積30yL。
[0093] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應。酶切產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收2-3kb DNA片段。回收按照試劑盒說明書進行。
[0094] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0095] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應12h以上。 [0096]④酶連產物的轉化和獲取陽性克隆：將10yL酶連產物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態細胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后。快速轉移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復蘇細胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態細胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養箱培養，12-16h后出現菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽性克隆子，同時對陽性克隆子進行編號。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長出菌懸液后提質粒驗證。
[0097]⑤提取陽性克隆質粒測序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽性克隆子插入片段 的測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據兩端測序結果設計引物，直至將整個插入片段測通。
[0098] 將測序完成的序列在NCBI數據庫中進行比對，并利用0RF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0099]⑥用PCR方式來克隆本發明的β-葡萄糖苷酶基因。設計的引物分別如下：
[0100] 上游引物PI :Tm = 66,40mer;引物序列如下：
[0101] GCCTGCAGGTCGACTCTAGATTACTTTTTTGCCTTTTCTG；
[0102] 下游引物？2:1'111 = 63,4〇11161';引物序列如下：
[0103] GGAAACAGACCATGGAATTCGTGAAAGTAAAATCAACATG；
[0104]利用PCR進行β-葡萄糖苷酶基因擴增，在50yL反應體系中，P1、P2兩個引物的添加 量為 lyL，擴增條件為:94°C 預熱 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個循環，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國）。 [0105] PCR結束后，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測定濃度。同時對于表達載體pTrc99a用限 制性內切酶EcoRI和Xbal酶切線性化，1.5%瓊脂糖膠回收片段，測定濃度。計算最適克隆載 體使用量（=〇. 02 X克隆載體堿基對數)ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基 對數)ng，利用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進行重組反應。37°C反應30min 后轉化到DH5a感受態中。
[0106] (2)提取質粒，驗證質粒正確后，將正確的質粒導入大腸桿菌SUC260感受態中，繼 續驗證，完成菌株構建suc26〇-pTrc99a_bglB。
[0107] (3)以菌suc260-pTrc99a為對照菌，進行厭氧發酵。先在5mL LB試管里過夜生長， 再轉接到50mL LB的搖瓶中，37°C，200rpm生長，至OD600為0.6~0.8時用IPTG誘導，終濃度為 0.3mM; 25°C，150rpm培養6~8h。用離心管收集菌液后用純水洗3遍，目的是為了洗掉原來的 LB培養基。最后用純水重懸菌泥，使最終OD55Q控制在4左右，然后向血清瓶中加入菌液，接種 量為10%，其中，血清瓶內的培養基為AM1培養基，唯一碳源為30g/L的纖維二糖，裝液量為 30mL。接種前用C0 2氣體預先混勻培養基中的纖維二糖和堿式碳酸鎂，約混勻lmin，然后進 行接種，取初樣后向每個血清瓶中再次通C0 2氣體，目的是是菌液和培養基充分混勻并且保 證厭氧狀態。37°C，180rpm培養。培養結束后取終樣。經檢測，發酵產物中丁二酸的質量收率 為0.85g/g(即丁二酸對纖維二糖的收率）。
【主權項】
1. 一種β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基 因。3. -種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求2所述的重組載體。4. 根據權利要求3所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為原核細胞。5. 根據權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述原核細胞為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)〇
【文檔編號】C12N1/21GK105969751SQ201610424102
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】姜岷, 薛夢蕾, 董維亮, 馬江鋒
【申請人】南京工業大學