一種鉛離子快速檢測金標試紙條或卡的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于快速檢測鉛離子的金標試紙條/卡，包括底層支撐板(1)、樣品墊(2)、金標抗體結合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊。本發明可以實現對環境、土壤、水、食品、藥物、化妝品中鉛離子污染殘留的快速檢測。
【專利說明】一種鉛離子快速檢測金標試紙條或卡
【技術領域】:
[0001]本發明涉及的是一種用于快速檢測鉛離子的金標試紙條/卡及其制備方法與應用，屬于免疫學和衛生檢驗學【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]鉛(Pb)是一種青灰色重金屬，是我們所熟知的環境毒物之一，它在自然界中分布廣泛，而且又是在現代社會中具有多種用途的有色金屬之一。早在夏商時期，我們的祖先就利用銅與鉛冶煉出具高硬度與韌性的青銅，廣泛用于兵器、工具、禮器與食器制作，青銅器鉛含量最高可達40%左右。隨著工農業的發展，鉛的用途也越來越廣泛，以致在空氣、土壤、食品、餐具、玩具中都能尋其身影，覓其蹤跡。在我國，鉛和精煉鉛產量居世界第三位，主要用于蓄電池制造、顏料、合金等行業。1923年開始在汽油中加入鉛用作抗爆劑以后，更加速了全球性鉛的污染。鉛污染狀況已不容忽視。鉛是全身性毒物，具有高蓄積性與多親和性，可通過消化、呼吸等途徑被機體吸收，對人體無任何生理功能。急性鉛中毒多表現為胃疼，頭痛，顫抖，神經性煩躁，嚴重時，昏迷，直至死亡。慢性鉛中毒大多表現為神經毒性，對血液系統、免疫系統、腎臟等造成一定損害。鉛是對兒童威脅最大的環境污染物之一，兒童對鉛元素較成人敏感。由于血腦屏障沒有發育完整，嬰幼兒的血鉛水平在達到100 μ g/L時便可以引起認知功能障礙或發育延遲。
[0003]由于鉛的污染和危害性較大，我國制定了土壤、食品、水體、玩具、用具等涉鉛領域中的國家限量標準，農產品安全質量無公害水產品安全要求(GB18406.4-2001)中對鉛含量都有限定量< 0.5mg/kg，地下水質量標準(GB/T14848-93)中規定，主要適用于集中式生活飲用水水源及工農業用水的鉛離子限量< 0.05mg/L，熟肉制品(GB2726-2005)要求鉛含量< 0.5mg/kg。歐盟、日本、韓國等對我國的出口物資的重金屬含量標準也越來越嚴格。
[0004]目前，檢測環境鉛離子的方法主要有:
[0005](I)物理和化學分析方法:包括紫外分光光度法(UV)、電化學分析法(EC)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)、氫化物發生-原子熒光光譜法(HG-AFS)、中子活化分析法(NAA)等。這些方法各有自己優缺點，紫外分光光度法操作簡單，快速，干擾小，但其靈敏度不高；電化學分析法具有靈敏、簡便等特點，對操作人員的技術要求高；原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜法、電感耦合等離子體原子發射光譜法、氫化物發生-原子熒光光譜法具有選擇性好、測定精度高、簡單、快速等優點，但所用儀器比較昂貴，只能在實驗室進行檢測，且對操作人員技術要求較為嚴格，限制了其廣泛使用；中子活化分析法是一種以核反應為基礎的分析方法，具有微量、快速、準確和非破壞性且同時可分析多元素的優點，但所需的設備不易為一般實驗室所具備，很難得到廣泛應用。
[0006](2)免疫學分析方法:包括酶聯免疫吸附法(ELISA)，和膠體金免疫層析法。酶聯免疫吸附法(ELISA)以競爭性酶聯免疫反應為檢測原理，反應顯色后用酶標儀測定吸光值(OD)值進行結果判定。縮短了檢測時間，可以對殘留藥物進行定性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操作過程仍較復雜，而且國內現處在研發階段，進口國外產品價格昂貴，因而ELISA方法的應用受到了較大限制。膠體金免疫層析法(GICA)，其檢測原理是當待檢樣本與吸附在在膜上的膠體金標記物(抗體或單克隆抗體)結合后，通過層析，與固定在膜上的特異性的抗原或抗體發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到膠體金標記物的顯色結果。膠體金免疫層析技術因具有攜帶方便、操作簡便、快速、特異性強、敏感性高、影響因素少、無需特殊儀器和標本不易污染等優點，適合對大批量樣品進行現場初篩，從而被廣泛用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等眾多領域。但對于鉛離子快速檢測金標試紙條/卡研制的有關文獻和專利目前尚未見報道。
[0007]因此，鉛離子污染已對人類健康構成了嚴重威脅，研制快速、簡便、敏感、特異、經濟、篩檢量大的鉛離子快速檢測金標試紙產品，對于減少環境污染、提高食品質量、保障食品安全具有重要意義。

【發明內容】
:
[0008]本發明的目的:研制出一種能夠快速、簡便、敏感、特異的檢測鉛離子污染殘留的快速檢測鉛離子金標試紙條和試紙卡。
[0009]一種用于快速檢測鉛離子的金標試紙條/卡，包括底層支撐板(I)、樣品墊(2)、金標抗體結合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)、包被膜(6)和外卡(7)等部分。其特征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標抗體結合墊、纖維素膜、吸水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上。所述試紙卡是以試紙條為基礎，加上外卡制成。所述底層支撐板和外卡均由硬質塑料制成，所述樣品墊與金標抗體結合墊由玻璃纖維棉制成；所述金標抗體結合墊包被有膠體金標記的能識別鉛離子的單克隆抗體；所述纖維素膜中部依次平行排列有隱形檢測線(T線)和質控線(C線)，檢測線包被有鉛離子與載體蛋白形成的偶聯物，質控線包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)。所述的鉛離子金標試紙條/卡，其特征是:所述的檢測抗原鉛-異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸-雞卵清白蛋白(Pb2+-1TCBE-OVA)，其制備步驟:
[0010](I)稱取20mg卵清蛋白(OVA)溶于ImL pH9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液。
[0011](2)稱取IOmgl-(4-異硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；
[0012](3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應24h，制成0VA-1TCBE溶液。
[0013](4)取11.25mg硝酸鉛(Pb (N03) 2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液；
[0014](5)將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調節pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，一 20°C凍存。
[0015]所述的重金屬鉛離子金標試紙條/卡制備步驟:
[0016](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取IOOOmL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL朽1檬酸三鈉繼續加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續加熱至溶液呈現橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存備用。
[0017](2)單克隆抗體制備:采用權利要求3所述的Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點注射。采用細胞融合技術無菌取脾臟制備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVA mAb ；
[0018](3)金標抗體制備:將待標單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/LK2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據聚沉現象，確定Pb2+-1TCBE-0VA mAb與膠體金溶液最適標記濃度，為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用0.lmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液的PH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用0.02mol/L Na2B4O7溶液(含10g/L0VA、0.5g/L疊氮鈉)稀釋，4°C保存備用。
[0019](4)金標抗體結合墊制備:裁取規格為20X4mm的玻璃纖維棉，將金標抗體用X-only單向噴點儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存備用。
[0020](5)硝酸纖維素膜上檢測線、質控線制備:將濃度為lmg/ml的Pb2+-1TCBE-OVA放于X-only單向噴點儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG放于貯存池B，開機分別點射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測線和質控線，自然干燥，密封，4°C保存備用。
[0021](6)金標試紙條組裝:將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標抗體結合墊表面粘貼MAX線，在切槽機上切割成寬度4_的金標試紙。
[0022](7)金標試紙卡組裝:將制備好的金標試紙條加上外卡制成。
[0023]所述的鉛離子金標試紙條/卡檢測線上Pb2+-1TCBE-OVA的包被量為I μ L/cm, OVA濃度為lmg/mL ;所述質控線上RaMIgG的包被量為I μ L/cm, RaMIgG的濃度為lmg/mL。
[0024]一種快速檢測鉛離子的金標試紙條/卡，其檢測步驟:
[0025](I)樣品預處理方法:樣品包括土壤、水、食品、飼料、動物組織、血液、尿液、器物(如玩具、油漆等)。固體待檢物研磨搗碎，進行硝酸-高氯酸濕消化(a)或微波消解(b)。液體待檢物直接加入硝酸消化(C)。
[0026]a硝酸-高氯酸濕消化法:分別取0.5g樣品放入玻璃消化管中，加15ml濃硝酸，置于通風窗過夜；然后加入5ml濃高氯酸，恒溫下緩緩加熱至高氯酸白色煙霧逸盡，同時溶液澄清透明為止，冷卻后轉移到25ml容量瓶中待用。
[0027]b微波消解法:分別稱取0.5g樣品，放入體積為20ml密閉的聚四氟乙烯微波消化管中，加入12ml硝酸，浸泡過夜；然后，將裝有樣品的微波消化管放人微波爐中，按程序消解。消解完成后，冷卻，倒入燒杯，置于198°C恒溫電熱板中，體積濃縮至2-3ml時，冷卻后用
2.5%硝酸，定容到25ml容量瓶中待用。
[0028]c硝酸消化法:液體待檢物直接加入15ml硝酸，室溫靜置2h，恒溫電熱板中，體積濃縮至2-3ml時，冷卻后用2.5%硝酸，定容到25ml容量瓶中待用。
[0029]按照1:1體積將樣品消化液與10% ITCBE螯合劑混勻，使鉛離子與ITCBE充分螯合，形成樣品待測液。
[0030](2)檢測步驟:取100μ L待測樣品，將所述的鉛離子金標試紙條插入待測樣品中，室溫反應5min,水平放置,觀察結果，IOmin以后結果無效。或用滴管吸取待測樣品100 μ L,滴加于試紙卡的樣品孔上，反應5min,觀察結果，IOmin以后結果無效。
[0031](3)分析檢測結果:T線、C線均顯色，判為陰性，表示樣品中鉛離子濃度小于2ng/mL或樣品中不含鉛離子；僅C線顯色，而T線不顯色，判為陽性，表示樣品中鉛離子濃度大于2ng/mL ;若C線不顯色，無論T線是否顯色，均判為金標試紙失效。
[0032]所述的鉛離子金標試紙的檢測靈敏度為2ng/mL ;所述的鉛離子金標試紙可應用于環境、土壤、水、食品、器物中鉛離子污染殘留快速檢測中。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0033]圖1，3為鉛離子快速檢測金標試紙條/卡的結構示意圖。
[0034]圖2為鉛離子快速檢測金標試紙的顯色結果示意圖。
【具體實施方式】:
[0035]實施例一、鉛離子人工免疫抗原制備
[0036]采用采用異硫氰酯法制備人工免疫抗原Pb2+-1TCBE_0VA。稱取20mg卵清蛋白OVA溶于ImL pH9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液。稱取IOmgITCBE溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應24h，制成0VA-1TCBE溶液。取11.25mg硝酸鉛(Pb (NO3)2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液；將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調節pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存。制備出人工免疫抗原 Pb2+-1TCBE-0VA。
[0037]紫外分光光度法掃描可見OVA的最大吸收峰在280nm處，偶聯物在濃度與OVA濃度相同的情況下的紫外掃描光譜中表現出了各自光譜圖的迭加性質；SDS-PAGE電泳法結果可見OVA的泳動速度大于偶聯物，說明偶聯物Pd2+-1TCBE-OVA的分子量大于0VA，證明偶聯成功。
[0038]實施例二、鉛離子人工免疫抗原鑒定
[0039]采用二喹啉甲酸法測定Pb2+-1TCBE-OVA中載體蛋白OVA濃度。以OVA作為標準蛋白，配成 O μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL>60 μ g/mL>80 μ g/mL 的濃度梯度，用二喹啉甲酸法構建濃度檢測標準曲線。OVA濃度標準曲線的線性方程為:y=0.0022x+0.008，R2=0.9987，其中y為樣品在波長為562nm處吸光度，x為樣品蛋白濃度。
[0040]采用ICP-AES 法測定 Pb2+-1TCBE-OVA 中 Pb2+ 的濃度。將 100 μ g/mL 的Pb2+-1TCBE-OVA 中 Pb2+ 標準儲備液用 2 % 的硝酸稀釋成 O μ g/mL,0.1 μ g/mL,0.2 μ g/mL、
0.3 μ g/mL、0.4 μ g/mL、0.5 μ g/mL的濃度梯度，儀器軟件自動繪制標準曲線，并得出線性回歸方程Y=0.27X+0.0045，相關系數0.9998 ;在283nm波長的最佳優化實驗條件下進行測定，儀器軟件自動分析結果。
[0041]實施例三、抗鉛離子單克隆抗體制備
[0042]用Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點注射。選擇細胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測抗血清中Pb2+螯合物pAb效價，阻斷ELISA檢測Pb2+-1TCBE pAb對Pb2+-1TCBE的IC5tl，挑選效價最高、IC5tl最低的小鼠，超免用于細胞融合。采用細胞融合技術無菌取脾臟制備脾細胞，在50% PEG(pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進行陽性雜交瘤細胞株的篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存15d、30d和60d后復蘇雜交瘤細胞，培養后取上清液，間接ELISA測定抗體效價，考察雜交瘤細胞分泌單克隆抗體的穩定性，獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVAmAb，取8周齡健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10?15天后使用。將培養的陽性雜交瘤細胞IOOOrpm離心IOmin棄上清，收集細胞沉淀。用滅菌的PBS將細胞沉淀懸浮、混勻，將細胞數調至106/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只。接種細胞7_10天后產生腹水，進行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過夜，12000rpm離心5min，棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測定IgG含量和效價，_20°C保存備用。
[0043]實施例四、抗鉛離子單克隆抗體鑒定
[0044]腹水效價測定。給腹腔注射液體石蠟IOd后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株107個細胞，7d后抽取腹水，飽和硫酸銨鹽析法提純，間接ELISA測定效價。測定結果，單克隆抗體腹水效價為1:7.2Χ105。
[0045]親和力鑒定。飽和ELISA測定親和常數(Ka)，用濃度分別為3.4μ g/mL和Uyg/mL 的 Pb2+-1TCBE-OVA 包被，加入倍比稀釋的 Pb2+-1TCBE mAb,再加入 GaMIgG-HRP，TMB 顯色測A45tol值，以Pb2+-1TCBE mAb濃度為橫坐標，以A45tol值為縱坐標，繪出相應的2條反應曲線，以每條曲線上部平坦段的A45tlnm值作為100%，在曲線上算出50% A45tol值時對應的Pb2+-1TCBE mAb 濃度,按照公式 Kaff= (n-1)/2 (n [Ab' ] t_[Ab] t)計算 Ka。單克隆抗體的Ka 為 1.87 X IO1Vmolo
[0046]敏感性鑒定。用阻斷ELISA測定Pb2+-1TCBE mAb對不同濃度Pb2+-1TCBE的抑制率，以抑制率BziBci為縱坐標，以不同濃度Pb2+-1TCBE的對數值為橫坐標，繪制標準抑制曲線，進行相關回歸分析，計算Pb2+-1TCBE mAb對Pb2+-1TCBE的IC50 0鑒定結果，IC50為25.25 μ g/L0
[0047]特異性鑒定。采用交叉反應試驗鑒定其特異性。交叉反應試驗選擇汞、鉻、鉛、鋅、銅、銫、鈷、鑰、鐵與ITCBE的鰲合物(鰲合方法同上)和ITCBE溶液。做為抑制劑，用阻斷ELISA 測定各抑制物的 IC5(I，以 Pb2+-1TCBE mAb 對 Pb2+-1TCBE 的 IC5tl 和 Pb2+-1TCBE mAb 對各競爭物的IC5tl之比的百分數為其交叉反應率(cross-reactivity, CR% )。鑒定結果,與其它重金屬離子交叉反應小于0.01 %。
[0048]實施例五、鉛離子金標試紙條/卡制備
[0049](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取IOOOmL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL朽1檬酸三鈉繼續加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續加熱至溶液呈現橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存備用。
[0050](2)金標抗體制備:將待標單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/LK2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據聚沉現象，確定Pb2+-1TCBE-OVA mAb與膠體金溶液最適標記濃度，為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用0.lmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液的PH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用0.02mol/L Na2B4O7溶液(含IOg/L0VA、0.5g/L疊氮鈉)稀釋，4°C保存備用。[0051](3)金標抗體結合墊制備:裁取規格為20X4m的玻璃纖維棉，將金標抗體用X-only單向噴點儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存備用。
[0052](4)硝酸纖維素膜上檢測線、質控線制備:將濃度為lmg/ml的Pb2+-1TCBE-OVA放于X-only單向噴點儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG放于貯存池B，開機分別點射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測線和質控線，自然干燥，密封，4°C保存備用。
[0053](5)金標試紙條組裝:將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標抗體結合墊表面粘貼MAX線，在切槽機上切割成寬度4m的金標試紙。
[0054](6)金標試紙卡組裝:將制備好的金標試紙條加上外卡制成。
[0055]實施例六、鉛離子金標試紙條/卡性能測定
[0056](I)本發明鉛離子金標試紙條/卡的敏感度試驗
[0057]用鉛離子金標試紙測定濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512ng/mL的鉛
離子標準品，每個濃度設6個重復，根據試驗結果判斷其敏感性。結果見表1，由表1可知，鉛離子金標試紙的目測檢測限為2ng/mL。
[0058]判定方法為:顯色區出現兩條線，且T線顏色明顯淺于C線顏色；或者顯色區只出現一條C線，而T線不顯色，判為陽性。陽性結果表示含量汞離子≤Ing/mL;顯色區出現檢測線(T線)和對照線(C線)兩條線，且T線顏色不淺于C線顏色，判為陰性。無效:顯色區兩條線(T線和C線)均不出現，表明操作有誤或試紙失效，判為無效。
[0059]表1測定金標試紙 敏感度試驗(n=6)
[0060]
【權利要求】
1.一種用于快速檢測鉛離子的金標試紙條，包括底層支撐板(I)、樣品墊(2)、金標抗體結合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)，其特征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標抗體結合墊、纖維素膜、吸水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上所述底層支撐板和外卡均由硬質塑料制成，所述樣品墊與金標抗體結合墊以玻璃纖維棉為基質，所述金標抗體結合墊包被有膠體金標記的能識別鉛離子的單克隆抗體；所述纖維素膜中部依次平行排列有隱形檢測線(T線)和質控線(C線)，檢測線包被有鉛離子與載體蛋白通過螯合劑形成的偶聯物，質控線包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)。
2.根據權利要求1所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，其特征是:所述的螯合劑選自異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、還原谷胱甘肽(GSH)中的一種；所述載體蛋白選自雞卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)中的一種；優選的，所述的偶聯物為Pb2+-1TCBE-OVA。
3.根據權利要求1或2所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，其特征是所述的單克隆抗體是通過抗原鉛離子與載體蛋白通過螯合劑形成的偶聯物采用單克隆抗體技術制備得到。
4.據權利要求3所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，其特征在于所述的偶聯物為Pd2+-1TCBE-OVA,所述的金標試紙條通過包括如下步驟在內的方法制備得到: (1)稱取20mgOVA溶于ImL ρΗ9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液； (2)稱取IOmgITCBE溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液； (3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應24h，制成0VA-1TCBE溶液； (4)取11.25mg硝酸鉛(Pb(NO3)2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液； (5)將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調節pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存； (6)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取1000mL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL檸檬酸三鈉繼續加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續加熱至溶液呈現橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存備用。 (7)單克隆抗體制備:用鉛離子-螯合劑-載體蛋白免疫小鼠，以Pb2+-1TCBE-OVA為例，說明如下:用Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點注射。選擇細胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測抗血清中Pb2+螯合物pAb效價，阻斷ELISA檢測Pb2+-1TCBEpAb對Pb2+-1TCBE的IC5(I，挑選效價最高、IC5tl最低的小鼠，超免用于細胞融合。采用細胞融合技術無菌取脾臟制備脾細胞，在50% PEG(pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進行陽性雜交瘤細胞株的篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存15d、30d和60d后復蘇雜交瘤細胞，培養后取上清液，間接ELISA測定抗體效價，考察雜交瘤細胞分泌單克隆抗體的穩定性，獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVAmAb，取8周齡健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10~15天后使用。將培養的陽性雜交瘤細胞1000rpm離心IOmin棄上清，收集細胞沉淀。用滅菌的PBS將細胞沉淀懸浮、混勻，將細胞數調至106/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只；接種細胞7_10天后產生腹水，進行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過夜，12000rpm離心5min，棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測定IgG含量和效價，_20°C保存備用； (8)金標抗體制備:將待標單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液的PH值至8.2 ;根據聚沉現象，確定鉛離子-螯合劑-載體蛋白mAb與膠體金溶液最適標記濃度，Pb2+-1TCBE-OVAmAb為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用`0.lmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用`0.02mol/LNa2B407 溶液(含 10g/L OVA,0.5g/L 疊氮鈉)稀釋，4°C保存備用； (9)金標抗體結合墊制備:裁取規格為20X 4mm的玻璃纖維棉,將金標抗體用X_only單向噴點儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存備用； (10)硝酸纖維素膜上檢測線、質控線制備:將濃度為lmg/ml的鉛離子-螯合劑-載體蛋白放于X-only單向噴點儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG(GaMIgG)放于貯存池B，開機分別點射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測線和質控線，自然干燥，密封，4°C保存備用； (11)金標試紙條組裝:將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標抗體結合墊表面粘貼MAX線，在切槽機上切割成寬度4mm的金標試紙。
5.根據權利要求1~4所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，檢測線上鉛離子-螯合劑-載體蛋白的包被量為I μ L/cm，載體蛋白濃度為lmg/mL。
6.根據權利要求1~4所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，其特征是:所述質控線上RaMIgG (或 GaMIgG)的包被量為 I μ L/cm, RaMIgG (或 GaMIgG)的濃度為 lmg/mL。
7.根據權利要求1~4所述的快速檢測鉛離子金標試紙條，其特征是:所述的膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30nm`,標記量為ImL膠體金:3ng單克隆抗體。`
8.用于檢測鉛離子的金標試紙卡，其特征在于:所述試紙卡是以權利要求1-7任意一項所述的快速檢測鉛離子金標試紙條為基礎，加上外卡制成。
9.一種如權利要求1~7所述的快速檢測鉛離子金標試紙條或權利要求8所述的用于檢測鉛離子的金標試紙卡在環境、土壤、水、食品、化妝產品或藥物中鉛離子污染殘留快速檢測中的應用，優選的，所述的檢測用于檢測鉛離子含量在10ng/mL的樣品。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征是:樣品預處理方法是樣品消解后，采用10%EDTA作為螯合劑處理溶液，離心取上清液用于檢測。
【文檔編號】G01N33/544GK103487577SQ201310445840
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】葛亞明, 王自良, 范國英, 王愛萍, 張海棠, 張慧輝 申請人:河南科技學院