一種水泡性口炎病毒抗體快速檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術和病毒檢驗領域，具體地涉及一種水泡性口炎病毒抗體 快速檢測試紙條。
【背景技術】
[0002] 水泡性口炎（Vesicularstomatitis,VS)是由彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性 口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV)引起的人畜共患的重大動物疫病。世界 動物衛生組織（0ΙΕ)將VS列為法定報告傳染病。目前，VSV分為兩個血清型，即印第安納 (Indiana,IN型）和新澤西（NewJersey,NJ型）。VSV的感染譜很廣，牛、豬、馬、羊和其它 多種野生動物可感染，人也可以感染VSV，并出現急性熱性類似流感的癥狀。動物感染VSV 發病后，臨床癥狀與口蹄疫（FMD)癥狀非常相似，很難根據臨床癥狀作鑒別診斷。水泡性口 炎嚴重影響反芻動物養殖業的健康發展及相關動物和動物產品的國際貿易，對疫區造成巨 大的經濟損失。
[0003] VSV為單股負鏈RNA病毒，基因全長11163bp，共編碼5種主要病毒蛋白，包括糖蛋 白（G)、基質蛋白（M)、核蛋白（N)、磷酸蛋白（NS)、病毒RNA聚合酶（L)。其中N蛋白由422 個氨基酸組成，呈現群特異性，為所有型的VSV所共有，誘導產生非中和抗體，與其它彈狀 病毒無任何交叉反應，因此VSVN蛋白是作為建立VSV抗體免疫學檢測方法的重要抗原。
[0004] 目前，可用于水泡性口炎病毒抗體檢測的方法有瓊脂擴散試驗（AGID)和競爭 ELISA方法。由于瓊脂擴散試驗特異性較差，需要時間長等因素的制約，該方法在基層獸醫 部門很少應用。競爭ELISA具有較好的特異性和敏感性，可用于實驗室檢測。但由于ELISA 檢測需要專門的儀器設備和技術操作人員，在條件較好的實驗室才可以得到應用。另外，目 前國內沒有商品化的ELISA試劑盒。
[0005] 申請號為200910190437. 5的發明公開了 一種水泡性口炎病毒快速檢測試紙 條及其制作方法，但其是檢測水泡性口炎病毒，即檢測抗原，準確性不高。申請號為 200410008749. 7的發明公開了一種水泡性口炎病毒N基因重組表達質粒載體、表達抗原以 及制備方法，該發明使用的是水泡性口炎病毒N蛋白全基因，蛋白表達量并不高。申請號為 201010182429. 9的發明公開了一種水泡性口炎病毒抗體膠體金檢測試紙條及其制備方法， 該發明雖是檢測水泡性口炎病毒抗體，但使用抗原為VSV全病毒抗原，特異性較差。

【發明內容】

[0006] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明公開了一種水泡性口炎病毒重組N蛋白 抗原及其制作方法。
[0007] 本發明公開了一種水泡性口炎病毒抗體快速檢測試紙條，其所述試紙條固定有水 泡性口炎病毒重組N蛋白抗原，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原的氨基酸序列為SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 進一步地，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原，其基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
[0009] 所述試紙條包括背襯和硝酸纖維膜、金標復合物墊、樣品墊、吸水墊，所述硝酸纖 維膜的上有檢測線，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原墊是固定在檢測線上。
[0010] 進一步地，所述檢測線，水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原的包被量為0. 175μg/ 條。
[0011] 進一步地，所述硝酸纖維膜上還點有兔抗鏈球菌G蛋白IgG作為對照線。
[0012] 進一步地，所述對照線，兔抗鏈球菌G蛋白IgG的包被量為0. 35μg/條。
[0013] 進一步地，所述對照線與檢測線之間距離為5mm。
[0014] 進一步地，所述試紙條為經過切條機加工成70_X 3. 5mm的成品。
[0015] 本發明針對水泡性口炎水泡性口炎病毒N蛋白氨基酸序列，通過抗原表位分析和 密碼子優化獲得截短并優化后的VSVN基因序列，通過人工合成該序列并在原核表達體系 表達該基因，獲得水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原。相對于先有技術，本發明的水泡性口炎 病毒重組N蛋白抗原具有更好的抗原特性，且優化后的基因序列在表達體系中蛋白表達量 尚，效果好。
[0016] 將本發明的水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原應用于制備快速檢測水泡性口炎病 毒抗體的試紙條，特異性好，靈敏度高，具有檢測快速、操作簡便，檢測樣品量少，檢測成本 較低等優點，為水泡性口炎病毒抗體檢測和水泡性口炎流行病學調查提供良好的檢測手 段。
[0017] 為了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發明。
【附圖說明】
[0018] 圖1為SDS-PAGE (左圖）和Western-blot (右圖）分析基因表達的VSVN蛋白。其 中，Μ :蛋白分子量標準；1 :轉化pET52/LIC質粒的對照菌；2,4 :轉化pET52/LIC-mVSVN質粒 的陽性菌（含密碼子優化后的VSVN基因序列）；3, 5 :轉化pET52/LIC-VSVN質粒的陽性菌 (含密碼子未優化后的VSVN基因序列）。
[0019] 圖2為水泡性口炎病毒抗體快速檢測試紙條結構示意圖。其中，
[0020] 1 :背襯，2 :硝酸纖維素膜，3 :樣品墊，4 :金標復合物墊，5 :吸水墊，6 :檢測線，7 : 對照線。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0022] 實施例1 :截短的VSVN蛋白的表達
[0023] 1、VSVN蛋白抗原表位分析和密碼子優化：通過檢索NCBI數據庫中VSVN基因序列 和對應氨基酸序列（GenBank:J02428. 1)，利用在線軟件對其主要抗原表位進行分析，確定 選擇抗原表位位于N蛋白中第88~374位氨基酸，其氨基酸序列為序列表中SEQIDNo. 1， 其對應的核苷酸序列（GenBank:J02428. 1)為第325~1185nt位核苷酸，見序列表SEQID No. 5〇
[0024] 2、VSVN基因密碼子優化和人工合成：密碼子優化，即根據表達系統對氨基酸密碼 子的偏愛性，對基因序列進行重新設計，將基因序列中利用率低或稀有的密碼子修改為表 達系統使用頻繁的密碼子，確保所表達蛋白的氨基酸序列不變。根據大腸桿菌對密碼子的 偏愛性，對選取的蛋白質片段對應的基因序列密碼子進行優化，優化后的基因序列標記為 mVSVN，其序列為序列表中SEQIDNo. 2,通過人工合成該序列，將該序列克隆至pMD-18T載 體中。
[0025] 3、mVSVN基因引物設計：根據密碼子優化后的VSVN基因序列，設計特異性引物，在 引物5'端人工添加LIC粘性末端，與商品化線性pET52/LIC末端互補的序列。PCR引物序 列如下，下劃線部分為LIC粘性末端：
[0026] 上游引物（PI) ：5' ~CAGGGACCCGGTTGGTCAAGTTTCGGAATC~3,(SEQIDNo. 3)；
[0027] 下游引物（P2) :5,-GGCACCAGAGCGTTATCACGACCTTGTGGTGG-3'（SEQIDNo. 4);
[0028] 4、PCR擴增mVSVN基因：用PCR擴增試劑盒（Takara公司產品），從pMD-18T-mVSVN 質粒中擴增目的基因片段。在PCR管中加入以下組分：
[0029]
[0030] 將上述組分混合后置于PCR儀中，進行擴增。反應程序為95°C預變性5min;95°C lmin，55°Clmin，72°Clmin，35個循環，72°ClOmin。經瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴增產 物約為890bp，用DNA快速回收試劑盒回收PCR產物。
[0031] 5、pET52/LIC-mVSVN重組表達載體的構建：用T4DNA聚合酶處理的上述PCR產物 與商品化線性pET52/LIc載體（Invitrogen公司產品）連接，利用T4DNA聚合酶外切酶活 性，切去3'端約11~12個堿基，即形成與LIC位點序列互補的粘性末端，處理后的PCR產 物可與線性PET52/LIC定向連接。反應體系如下：
[0032]
[0033] 將上述反應物混合后，于22°C反應30min，然后于75°C反應20min。在1. 5mL離心 管中，加入線性PET52/LIC質粒1μL、經T4DNA聚合酶處理的PCR產物2μL和25mmol/L EDTAlyL，混合后，于22°C反應5min。取上述反應物lyL轉化100yLNovaBlueE.coli 感受態細胞（Invitrogen公司產品），冰浴5min，42°C熱激30s，冰浴2min。加入300μL S0C液體培養基，37°C震蕩（200r/min)培養lh后，5,000r/min離心5min，棄去350yL上 清，用加樣器吹打數次，重懸菌體后涂布含Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，37°C培養 16h后，隨機挑取6個單菌落，分別接種至3mL含Ampicillin(50μg/mL)的LB培養液中， 37°C震蕩培養過夜。取1. 5mL培養物，用質粒DNA提取試劑盒（TARAKA公司產品）提取質 粒DNA，用該DNA作為模板，進行PCR鑒定。PCR反應體系如下：
[0034]
[0035] 反應程序為：95°C預變性 5min;95°Clmin，54°Clmin，72°Clmin，30 個循環， 72°C10min。PCR反應結束后，取8yLPCR產物進行電泳分析。同時將pET52/LIC-mVSVN 質粒DNA送到TAKARA公司進行DNA序列測定，經測定，其序列為序列表中SEQIDNo. 2完 全一致。
[0036] 6、VSVN蛋白在原核細胞中的表達及分析：將上述經鑒定的pET52-VSVN質粒DNA 轉化（DE3)pLacIE.coli感受態細胞（Invitrogen公司產品），涂于含Ampicillin(50μg/ mL)的LB固體培養基，37°C培養12~16h，挑取陽性單菌落，接種于5mLLB培養基，于37°C 震蕩培養2h后，加入IPTG(終濃度為lmmol/L)進行誘導表達VSVN蛋白。收集上述菌液， 5000r/min離心10min，取上清，加入原體積約1/10的PBS(pH7. 2)，用超聲波破碎儀對菌體 進行破碎處理。經SDS-PAGE分析，表達產物大小約為36Ku(圖1)。由圖1可看出SDS-PAGE 試驗表明經過優化后，VSVN蛋白表達量明顯提高。用羊抗VSV陽性血清和HRP標記的兔抗 羊IgG(SIGMA公司產品）進行Westernblot分析，結果表明表達產物可以和抗VSV陽性血 清反應。
[0037] 7、VSVN蛋白的純化：使用6XHis標簽融合蛋白純化試劑盒對表達VSVN表達產物 進行純