一種快速檢測黃牛flii基因snp的rflp方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子遺傳學領域，具體涉及一種檢測黃牛FLII基因第9461位的單核 苷酸多態性的方法。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指基因組DNA序列 中由于單個核苷酸（A/T/C/G)的變化而引起的多態性。它的變異形式有：顛換、轉換、插入 和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。SNP屬于第三代分子標記，具有密度高、 雙等位基因、易實現自動化檢測等優點。由于SNP具有其它標記無法比擬的優點，所以它作 為一種研究工具已經在生命科學的各個領域得到廣泛應用。
[0003] 目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs，即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與 DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。PCR-RFLP方法是一種 檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后使用限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖或聚 丙烯酰胺電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確 性，又克服了費用昂貴、操作繁瑣、假陽性的缺點。
[0004] 分子育種，即分子標記輔助選擇（molecularmark-assistselection,MAS)，是借 助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良。在畜 禽育種中，通過對生長性狀密切相關的、并且與數量性狀緊密關聯的DNA標記的選擇，達到 早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。
[0005] FLII(flightlessI)屬于凝溶膠蛋白超家族，是凝溶膠蛋白和Ras信號轉導通路 的搭橋蛋白，參與信號轉導、細胞凋亡等調控，在脂肪分化、腫瘤發生和創傷愈合中發揮重 要作用。最新研究發現，FLII可通過競爭性結合RXRα負調控脂肪分化的關鍵基因PPARγ， 提示FLII可能調控牛的脂肪分化關鍵基因的功能發揮，影響牛的生長性狀。
[0006] 目前，關于黃牛FLII基因遺傳變異的研究，國內外尚未見相關報道。由于FLII基 因功能涉及脂肪代謝、信號轉導、細胞凋亡等眾多進程，因此，研究該基因遺傳變異及其與 黃牛重要生長性狀進行關聯分析至關重要，可以為黃牛分子育種提供理論依據，便于黃牛 生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種快速檢測黃牛FLII基因SNP的RFLP方法及其應用。
[0008] 為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0009] 一種快速檢測黃牛FLII基因SNP的RFLP方法，包括以下步驟：以黃牛基因組DNA 為模板，以引物對P為引物，PCR擴增所述FLII基因內含子22區的部分片段，再用限制性 內切酶SacII對PCR擴增產物進行酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據電泳 結果鑒定黃牛FLII基因的單核苷酸多態性；
[0010] 所述的引物對P為：
[0011] 上游引物F:5' -TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3'，
[0012] 下游引物R:5' -CCGTCCAGGTCCTCGTT-3'。
[0013] 所述PCR擴增的反應程序為：95°C預變性4min;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，33個循環；72°C延伸lOmin。
[0014] 所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為3. 5%。
[0015] 所述的SNP位點為C/A單核苷酸多態性，位于所述FLII基因的內含子22區，是所 述FLII基因的第9461位核苷酸位點。
[0016] 所述瓊脂糖凝膠電泳檢測后，電泳條帶表現為：CC基因型表現為102bp和69bp，CA 基因型表現為171bp、102bp和69bp，AA基因型表現為171bp。
[0017] 上述快速檢測黃牛FLII基因SNP的RFLP方法在黃牛分子育種中的應用，從而加 快良種選育速度。
[0018] 所述FLII基因的單核苷酸多態性與24月齡黃牛的生長性狀顯著相關，該單核苷 酸多態性所在位點具有AA、AC以及CC3種基因型，不同基因型的黃牛個體在體長、體高、胸 圍、十字部高和尻長上存在顯著差異，并且，優勢基因型為AA型。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0020] 本發明提供的黃牛FLII基因單核苷酸多態性檢測方法，針對第9461位C到A的 顛換突變，PCR擴增FLII基因內含子22區171bp的基因片段后，當由C突變成A時，不能 形成SacII識別位點，而沒有發生突變時，則含有SacII識別位點，可以被SacII酶切， 從而能夠簡單、快速、成本低、精確地檢測其單核苷酸的多態性，可用于黃牛的分子育種。
【附圖說明】
[0021] 圖1為黃牛FLII基因第9461位點測序圖，框內所示為突變位點；
[0022] 圖2是本發明中黃牛FLII基因酶切電泳結果圖；泳道1為MarkerI，表現為 lOObp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp;泳道 2、8、11 為CC基因型，表現為 102bp和 69bp; 泳道1、3、4、5、6、7、9、10為0厶基因型，表現為17讓？、102匕？和6%?;泳道12為厶厶基因型， 表現為171bp。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明。
[0024] 本發明利用PCR-RFLP方法檢測黃牛FLII基因第9461位的單核苷酸多態性，并將 其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記， 從而加快良種選育速度。本發明對4個黃牛品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析， 對上述SNP位點與黃牛重要生長性狀進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高黃牛生 長性狀的分子標記。
[0025] 1、黃牛樣本采集
[0026] 本發明具體以4個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 : 河南南陽牛（62)，陜西秦川牛（165)，河南郟縣紅牛（210)，晉南牛（107);
[0027] 表1黃牛樣本的采集
[0028]
[0029] 2、基因組DNA的分離、提取、純化
[0030] 參考文獻Sambrocketal(2002)方法。
[0031] 3、擴增引物設計
[0032] 以NCBI數據庫（//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛FLII基因序列 (GenBankAccessionNo.AC_000176)為參考序列，利用Primer5.0設計PCR引物擴增FLII 基因內含子22區171bp片段，其引物對序列信息如下：
[0033] 上游引物F:5' -TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3' （SEQ.ID.N0. 1)
[0034] 下游引物R:5，-CCGTCCAGGTCCTCGTT-3，（SEQ.ID.NO. 2)
[0035] 4、PCR克隆黃牛FLII基因內含子區171bp片段
[0036] PCR反應體系采用混合加樣法，即根據每一個反應體系所需的各種組分的數量和 1次反應所需的PC