一種基于唾液中的孕酮的核酸適配體及檢測用金標試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及激素檢測技術領域，具體涉及一種基于唾液中的孕酮的核酸適配體及檢測用金標試紙條。
【背景技術】
[0002]孕酮(progesterone)亦稱黃體酮，是天然的孕激素，由卵巢和胎盤產生，分子量為314.46，它與雌激素共同維持女性生殖周期及女性生理特征。動態監測血清中的孕酮含量，有助于判定排卵期，了解黃體功能，研究各種類固醇避孕藥及抗早孕藥的作用機理。此外，近年來研究表明，孕酮的作用已遠超出生殖功能的范疇，它不僅可在神經系統中合成分泌，還能影響神經系統的結構和功能。
[0003]孕酮與人體的內分泌調整密切相關，孕酮在女性的不同生理周期階段起著關鍵的調節作用，孕酮的失調會直接影響人體健康。所以檢測人體孕酮濃度是女性健康診斷的重要指標。在現有的孕酮檢測方法中一般都是基于尿液或者血液來檢測，在取樣的過程中給用戶帶來了不便或痛苦。
[0004]由于孕酮對人身心健康的重大影響，醫學、生物、環境及食品安全等各領域對該物質進行了深入研究，并建立了多種測定方法。目前孕酮的檢測方法大致可以分為兩類:色譜法和免疫分析法。色譜法作為檢測血清中孕酮的標準方法，在準確性、選擇性、重現性、靈敏度等方面具有無可比擬的優勢，但同時也存在一些局限性:如儀器昂貴，操作技術要求高，需要復雜的樣品前處理等。因此，在臨床檢測中，色譜法不能滿足快速、簡便、低成本、高通量的要求。而免疫分析方法具有特異性好、簡便、低成本等優點，是目前臨床檢測孕酮的主要方法。放射免疫分析(rad1 immunoassay，RIA)、酶聯免疫分析(enzyme I inkedimmunoadsorbent assay ,ELISA)、焚光免疫分析(f luoroimmuno assay，FIA)、時間分辨焚光免疫分析(time resolved f luoro immuno assay，TRFIA)和化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)用于人血清中孕酮的檢測都有報道。RIA使用放射性核素，污染環境，有效期短，測量時間長，這些缺點限制了其進一步的應用。ELISA和FIA的靈敏度較低，不利于血清中低濃度孕酮的測定。TRFIA和CLIA克服了以上方法的缺點，國外已經實現了分析技術完全自動化，但這些進口的診斷試劑往往需要專門配套的儀器，試劑、儀器價格昂貴;此外，其專利保護也限制了這些技術在我國國內的研發。
[0005]中國專利申請公布號01^102095866六(公開日2011.06.15)公開了一種孕酮化學發光定量檢測試劑盒，包括孕酮檢測反應板，反應板包被有孕酮抗體，還包括酶結合物、發光底物、校準品、質控品和濃縮洗滌液。其適用的檢測樣本仍然為血清或血漿。
[0006]傳統的各種檢測方法，過程復雜，耗時長，成本高，并且不能保證批間的穩定性。

【發明內容】

[0007]為了解決現有檢測技術中的上述問題，本發明基于膠體金標記適配體識別孕酮特異性抗原的技術原理，提供了一種孕酮的核酸適配體，其相應的互補探針，以及由其組成的金標試紙條。
[0008]本發明提供的一種孕酮的核酸適配體，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中序列5’端經過巰基修飾。該核酸適配體能夠特異性識別孕酮并與其結合。
[0009]SEQ ID N0:15’-SH-GGCACGGCAAAGGGGTACAGCCTACCGAACCGTGGCTGTAAGGGTGGTTGTGGTGTG-3’ ο
[0010]本發明提供的一種互補探針A，與上述孕酮的核酸適配體互補配對，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，其中序列5’端經過生物素修飾。互補探針A能夠與孕酮競爭性結合上述核酸適配體。
[0011 ] SEQ ID NO:25 ’-b1tin-CACACCACAACCACC-3 ’。
[0012]本發明提供的一種互補探針B，與上述孕酮的核酸適配體互補配對，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其中序列5’端經過生物素修飾。互補探針B能夠與上述核酸適配體的另外一部分結合，該部分不同于與孕酮結合的序列段，也就是說，互補探針B與孕酮之間沒有競爭關系。
[0013]SEQ ID N0:35’-b1tin-CACACCACAACCACCCTTACAGCCACGGTT-3’。
[0014]本發明公開的一種檢測孕酮的金標試紙條，是在塑料襯板上依次搭接樣品玻璃纖維膜、核酸探針金標墊、硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜，并且硝酸纖維膜上劃有檢測線和參照線，參照線靠近吸水玻璃纖維膜一端;其中核酸探針金標墊上附著表面經修飾的膠體金，檢測線由核酸適配體A溶液劃成，參照線由核酸適配體B溶液劃成；
[0015]所述膠體金的表面經過活化了巰基的孕酮的核酸適配體修飾；
[0016]核酸適配體A溶液包括結合了鏈霉親和素的互補探針A;
[0017]核酸適配體B溶液包括結合了鏈霉親和素的互補探針B。
[0018]以上金標試紙條，特別適合于唾液中孕酮的檢測。通過適配體檢測唾液中的孕酮濃度，利用唾液中微量的孕酮濃度與血液中的孕酮濃度存在顯著相關性，從而推算出人體的孕酮水平，為一種非侵入式檢測方案，可用于監測女性的生理周期及健康狀態。
[0019]本發明的金標試紙條，檢測線中的互補探針A與孕酮競爭性結合核酸適配體。檢測時，將唾液樣品浸潤或滴加到樣品玻璃纖維膜，由于毛細現象，唾液向樣品玻璃纖維膜的對向端滲透，滲透的過程中孕酮會與核酸探針金標墊的核酸適配體結合并繼續一起移動，核酸適配體一端有連接著膠體金顆粒，核酸適配體與膠體金顆粒的結合體將吸附在檢測線和參照線上，最終顯色的深淺通過與標準色(梯度濃度標準品在金標試紙條上的顯色情況)對比就能得到孕酮的濃度。當唾液中含有高濃度的孕酮時，孕酮與互補探針A競爭性結合核酸適配體，從而檢測線顏色就會變弱。陰性對照(空白對照)是有兩條線都顯色，因為當唾液中不含有孕酮，兩條互補探針都會截留孕酮的核酸適配體。
[0020]優選地，上述金標試紙條，所述膠體金溶液的制備方法如下:
[0021]將醋酸緩沖液和TCEP溶液混合，再向其中加入孕酮的核酸適配體，進行巰基活化反應，反應結束后向其中加入金納米粒子溶液，震蕩；再加入dATP，25 °(:震蕩反應后靜置30分鐘，再在4°C下靜置6小時;然后離心，沉淀用磷酸緩沖液溶解既得。
[0022]優選地，上述金標試紙條，所述醋酸緩沖液濃度為0.5M，pH值6.5，用量IyL;所述TCEP溶液的濃度為10mM，用量1.5yL;所述dATP濃度ΙΟμΜ，用量85yL;所述金納米粒子粒徑30?40nm，用量10yL;所述磷酸緩沖液濃度0.01M，pH值7.4，用量520yL。
[0023]優選地，上述金標試紙條，所述互補探針A溶液制備方法為:將40?SOyLI?100D值的生物素修飾的互補探針A溶液和200?300yL I?5mg/mL鏈霉親和素溶液混合后在25°C下靜置I小時，在向其中加入500?600yL 0.001?1.000M pH值6.0?8.0的磷酸鹽緩沖溶液。
[0024]優選地，上述金標試紙條，所述互補探針B溶液的制備方法為:將40?SOyLI?100D值的生物素修飾的互補探針B溶液和200?300yL I?5mg/mL鏈霉親和素溶液混合后在25°C下靜置I小時，在向其中加入500?600yL 0.001?I.000Μ pH值6.0?8.0的磷酸鹽緩沖溶液得到結合了鏈霉親和素的生物素修飾的互補探針B溶液。
[0025]本發明還提供了以上任一所述的金標試紙條的制備方法，是將樣品玻璃纖維膜、核酸探針金標墊、硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜依次粘貼到塑料襯板上，相鄰兩粘貼物之間的重疊部分長度為2mm，干燥封裝，在4°C?25°C條件下保存。
[0026]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0027]1、本發明將納米粒子比表面積大這一顯著特點應用于傳統的金標試紙條的建立和相應的檢測方法，建立了可用于現場快速超靈敏檢測的基于核酸探針的膠體金標記試紙條和相關的檢測方法，通過肉眼直接觀察實現目標檢測物的快速定性檢測和通過檢測條帶上顯色程度的降低對目標檢測物進行定量檢測。無需其他輔助儀器設備，檢測工作可在10?15分鐘內完成并得到檢測結果。
[0028]2、本發明為通用型基于膠體金標記適配體的膠體金標記試紙條，只需將試紙條中適配體進行相應替換，即可實現其他目標物的檢測。
[0029]4、本發明還具有特異性高，穩定性好，應用范圍廣，成本低廉，操作使用方法簡單易于推廣應用。可應用于醫院、家庭、以及食品安全與檢驗檢疫的海關、機場等口岸等需要現場快速檢測機構。
[0030]5、本發明中的檢測方法不需要穿刺取血或取尿液，只需要取唾液，取樣簡單，屬于非侵入式檢測，檢測方法簡單，成本低廉。
[0031 ] 6、本方法檢測的靈敏度和高，監測濃度可以達到pmol級別。
【附圖說明】
[0032]圖1為基于膠體金標記抗體的金標試紙條的側面結構示意圖，圖中序號:I樣品玻璃纖維膜、2核酸探針金標墊、3硝酸纖維膜、4檢測線、5參照線、6吸水玻璃纖維膜、7塑料襯板；
[0033]圖2為基于膠體金標記抗體的金