一種拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米高分子材料領域，具體是一種拓樸異構酶Π雜化納米花的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]“納米花”屬控制合成花狀納米材料，獨特的形貌和卓越的性能近年來成為納米材料領域中最新研究熱點，主要應用于催化、電學、生物診斷、信息存儲、分析科學等領域。三維花狀結構的納米材料由于獨特的形貌和復雜的結構使其具有高比表面積、高活性、高穩定性等優于其他低維納米材料的性質。目前，在無機納米花的合成上面有了比較成熟的方法，但是有機-無機雜化納米花的合成仍在探索之中，有機-無機雜化納米花可以用于細胞成像、生物傳感器、醫學方法的改進等。將靶蛋白與無機離子雜化制備納米花具有極大的挑戰性，應用前景十分廣闊。目前蛋白納米花主要是通過固定化、接合、交聯、自組裝、螯合的方式合成，但由于蛋白質對環境的敏感性、實驗結果的低重現性、提純過程的復雜性的這些問題使蛋白雜化納米花的合成具有很大難度。
[0003 ]拓樸異構酶能夠影響DNA的空間構型動態變化來控制基因的復制、重組、表達。調節DNA的空間構型的拓樸異構酶有兩種，分別是拓樸異構酶I(TopoI)、拓樸異構酶Π (TopoΠ)。拓樸異構酶是明確的抗腫瘤藥物作用的靶點，一些抗癌藥物正是通過抑制拓樸異構酶的DNA合成功能，從而誘導細胞的凋亡促使癌細胞凋亡。
[0004]多穗金粟蘭金粟蘭屬植物多穗金粟蘭全草。金粟蘭植物多具有抗菌、抗腫瘤、增強免疫、抗病毒等活性。多穗金粟蘭在傳統醫學中用于治療多種癌癥，療效確切。
[0005]中草藥成分復雜，低含量的有效成分篩選分離難度大。將靶蛋白制成有機-無機雜化納米花后能很大程度的提高靶蛋白的穩定性和對有效成分的特異吸附性。使靶蛋白能在一些復雜的干擾條件下仍保持快速篩選與識別目標成分，這將極大地提高中草藥中有效成分的篩選效率。由于該納米材料具有高效、穩定和特異選擇性的特點，因而具有較廣的應用前景。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種提高酶穩定性、有效成分篩選高效性的拓樸異構酶Π雜化納米花的制備方法及應用，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0007]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
一種拓樸異構酶Π雜化納米花的制備方法，具體制備步驟如下:
(1)用超純水溶解CuSO4，配成濃度為115?125mmoL/L的CuSO4溶液；
(2)配置PBS緩沖液使其pH值為7.4，將20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓樸異構酶Π-PBS緩沖液，在24?26 °C下反應3天，將反應產物用超純水反復超聲5?8次，沖洗4?6次，冷凍干燥得固體粉末，即得拓樸異構酶Π雜化納米花(銅-拓樸異構酶雜化納米)。
[0008]一種所述的拓樸異構酶Π雜化納米花的應用，該拓樸異構酶Π雜化納米花用于分離多穗金粟蘭中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分的提取，其具體提取步驟如下:
(1)多穗金粟蘭粗提液的制備
取多穗金粟蘭粗粉18?22g，置于500mL圓底燒瓶，加240?260mL體積分數為95%的乙醇，加熱回流提取55?65min，重復提取2?3次，濾過，濃縮，回收乙醇得到浸膏，少量水稀釋后，用等體積的石油醚、氯仿依次萃取，用旋轉蒸發儀減壓回收有機溶劑，得到氯仿部位提取液，備用；
(2)固相萃取柱分離多穗金粟蘭氯仿提液中的拓樸異構酶抑制有效成分
將上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花(即銅-拓樸異構酶雜化納米)采用干法裝柱填充到固相萃取柱中，并用色譜純甲醇平衡柱子;取多穗金粟蘭氯仿提取液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液濃縮、干燥，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構；
(3)微型固相吸頭萃取小柱分離多穗金粟蘭粗提液中的拓樸異構酶抑制有效成分將上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花填充到Tip吸頭柱并固定，配合單道移液器，作為吸頭小柱微萃取裝置;先用色譜純甲醇活化萃取材料，再用體積分數為20%甲醇溶液平衡吸頭材料;吸入多穗金粟蘭粗提液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液氮氣吹干，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構。
[0009]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
本發明制備的銅-拓樸異構酶雜化納米花形貌為花型且單分散，粒徑5μπι左右，適合作為萃取的填料，對拓樸異構酶抑制成分具很好的識別性能，可用于中藥提取液中拓樸異構酶抑制成分的靶向篩選、分離和純化。
[0010]與現有技術的C18鍵合固相萃取柱、硅膠固相萃取柱及Al2O3固相萃取柱相比，銅_拓樸異構酶雜化納米花固相萃取柱對多穗金粟蘭中具有拓樸異構酶抑制作用的有效成分具有更好的選擇性。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為為銅-拓樸異構酶雜化納米花形態透射電鏡圖。
[0012]圖2為微型固相吸頭萃取小柱示意圖。
[0013]圖中:1-移液槍連接處;2-微孔濾膜;3-銅-拓樸異構酶雜化納米花;4-微孔濾膜。
【具體實施方式】
[0014]下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例
[0015]拓樸異構酶Π雜化納米花的制備步驟如下:
(I)用超純水溶解CUS04，配成濃度為120mmoL/L的CuS04溶液； (2)取1.5mg GOX溶解于3mLPBS緩沖液，配置PBS緩沖液使其pH值為7.4，將20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓樸異構酶Π -PBS緩沖液，在25°C下反應3天，將反應產物用超純水反復超聲7次，沖洗5次，冷凍干燥得固體粉末，即得。
[0016]該拓樸異構酶Π雜化納米花用于分離多穗金粟蘭中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分的提取，其具體提取步驟如下:
(1)多穗金粟蘭粗提液的制備
取多穗金粟蘭粗粉20g，置于500mL圓底燒瓶，加250mL體積分數為95%的乙醇，加熱回流提取60min，重復提取2次，濾過，濃縮，回收乙醇得到浸膏，少量水稀釋后，用等體積的石油醚、氯仿依次萃取，用旋轉蒸發儀減壓回收有機溶劑，得到氯仿部位提取液，備用；
(2)固相萃取柱分離多穗金粟蘭氯仿提液中的拓樸異構酶抑制有效成分
稱取20g上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花，采用干法裝柱填充到固相萃取柱中，并用色譜純甲醇平衡柱子;取多穗金粟蘭氯仿提取液ImL上樣，控制流速為0.5mL/min，用2mL體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再4mL的甲醇溶液洗脫，洗脫液濃縮、干燥，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構；
(3)微型固相吸頭萃取小柱分離多穗金粟蘭粗提液中的拓樸異構酶抑制有效成分稱取2mg上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花，填充到1yL Tip吸頭柱并固定，配合10
yL單道移液器，作為吸頭小柱微萃取裝置;先用色譜純甲醇活化萃取材料，反復吸入排出色譜純甲醇3次，再用體積分數為50%甲醇溶液平衡吸頭材料;吸入多穗金粟蘭粗提液1yL上樣，重復3次，確保萃取材料充分吸附目標成分；用1yL體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，以及1yL的甲醇溶液洗脫，重復2次，洗脫液氮氣吹干，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構。
[0017]對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。
【主權項】
1.一種拓樸異構酶Π雜化納米花的制備方法，其特征在于，具體制備步驟如下: (1)用超純水溶解CUS04，配成濃度為115?125mmoL/L的CuS04溶液； (2)配置PBS緩沖液使其pH值為7.4，將20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓樸異構酶Π -PBS緩沖液，在24?26 °C下反應3天，將反應產物用超純水反復超聲5?8次，沖洗4?6次，冷凍干燥得固體粉末，即得拓樸異構酶Π雜化納米花。2.一種如權利要求1所述的拓樸異構酶Π雜化納米花的應用，其特征在于，該拓樸異構酶Π雜化納米花用于分離多穗金粟蘭中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分的提取，其具體提取步驟如下: (1)多穗金粟蘭粗提液的制備 取多穗金粟蘭粗粉18?22g，置于500mL圓底燒瓶，加240?260mL體積分數為95%的乙醇，加熱回流提取55?65min，重復提取2?3次，濾過，濃縮，回收乙醇得到浸膏，少量水稀釋后，用等體積的石油醚、氯仿依次萃取，用旋轉蒸發儀減壓回收有機溶劑，得到氯仿部位提取液，備用； (2)固相萃取柱分離多穗金粟蘭氯仿提液中的拓樸異構酶抑制有效成分 將上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花采用干法裝柱填充到固相萃取柱中，并用色譜純甲醇平衡柱子;取多穗金粟蘭氯仿提取液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液濃縮、干燥，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構； (3)微型固相吸頭萃取小柱分離多穗金粟蘭粗提液中的拓樸異構酶抑制有效成分 將上述得到的拓樸異構酶Π雜化納米花填充到Tip吸頭柱并固定，配合單道移液器，作為吸頭小柱微萃取裝置;先用色譜純甲醇活化萃取材料，再用體積分數為20%甲醇溶液平衡吸頭材料;吸入多穗金粟蘭粗提液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液氮氣吹干，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構。
【專利摘要】本發明公開了一種拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花的制備方法及應用，用超純水溶解CuSO4，配成CuSO4溶液，再配制拓樸異構酶Ⅱ-PBS緩沖液，反應后將反應產物用超純水反復超聲沖洗，冷凍干燥得固體粉末。該拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花用于分離多穗金粟蘭中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分的提取，其具體步驟包括多穗金粟蘭粗提液的制備、固相萃取柱分離以及微型固相吸頭萃取小柱分離多穗金粟蘭粗提液中的拓樸異構酶抑制有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構。本發明制備的拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花形貌為花型且單分散，粒徑5μm左右，適合作為萃取填料，對拓樸異構酶抑制成分具很好的識別性能，可用于中藥提取液中拓樸異構酶抑制成分的靶向篩選、分離和純化。
【IPC分類】A61P35/00, C12N9/96, C12N9/90, A61K36/185
【公開號】CN105602926
【申請號】CN201610054030
【發明人】尹小英, 乾康, 金晨, 劉慶山, 程林, 張媛媛, 高淑婷
【申請人】尹小英
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月27日