小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應用
【專利摘要】本發明屬于害蟲抗藥性機理與防治領域，具體涉及小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應用。本發明用prosalpha6基因RNAi后幼蟲的抗藥性水平明顯下降，用同樣劑量的溴氰菊酯處理后，干擾組幼蟲的存活率下降了2.5倍，與對照組之間有顯著差異。本發明通過個體和細胞水平分別證明該基因與溴氰菊酯的抗性密切相關，對進一步闡明溴氰菊酯的抗性機理以及在抗性的防治應用中均具有重要的意義。
【專利說明】
小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于害蟲抗藥性機理與防治領域，具體涉及小菜蛾泛蛋白酶體α6亞基基因 pro sa 1 pha6及一種治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技術】
[0002] 連續、大量、單一使用一種或一類藥劑是導致昆蟲產生抗藥性的主要原因。在連年 大量使用某一藥劑以后，對該藥耐藥力弱的昆蟲經自然選擇后被淘汰，而耐藥性強的個體 得以存活下來并得到迅速繁殖，從而相關的抗藥性基因也通過遺傳保留了下來，并且隨著 化學藥劑用量的增加，這些抗藥性基因又經過殺蟲劑作用和選擇，如此逐代的選擇作用，抗 藥性積累加強，昆蟲的抗藥能力也逐漸增強，這就產生抗藥性品系的昆蟲。但是有關這些基 因與抗藥性關系的分析主要是在基因表達水平的差異比較，沒有進行相關基因的敲減和增 強表達之后對殺蟲劑抗性水平影響的細胞和活體研究，缺乏直接的實驗證據，因此難以進 行開發和應用。
[0003] 小菜蛾prosalpha6基因是20S蛋白酶體的一個結構亞基，尚未有該基因與溴氰菊 酯抗性相關的報道。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供小菜蛾對溴氰菊酯的抗性相關基因及其應用。
[0005] 本發明首先以果繩Kc細胞作為模式系統，分析prosalpha6基因與溴氰菊酯抗性的 關系。根據GenBank中已有的果繩prosalpha6基因序列，設計引物克隆出果繩prosalpha6基 因的開放閱讀框序列，經過實驗證明果蠅prosalpha6基因是溴氰菊酯抗性相關基因。
[0000]發明人進一步實驗發現小菜蛾的Prosalpha6蛋白基因在溴氰菊酯抗性品系中的 表達水平明顯高于敏感品系。
[0007]本發明公開了小菜蛾prosalpha6基因在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的應用。 [0008] 小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA在制備小菜蛾對溴氰菊酯增敏劑 中的應用。
[0009] 一種利用蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步 驟是：
[0010] (1)用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit 說明書進行操作，合成小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA;
[0011] (2)核酸酶消化以去除DNA和ssRNA;
[0012] (3)純化 dsRNA;
[0013] (4)將prosalpha6的dsRNA噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上，通過滲透和取 食，dsRNA進入小菜蛾細胞，沉默prosalpha6基因；
[0014] (5)48小時后施溴氰菊酯類殺蟲劑。
[0015] 經研究表明：prosalpha6基因 RNAi后幼蟲的抗藥性水平明顯下降，用同樣劑量的 溴氰菊酯處理后，干擾組幼蟲的存活率下降了 2.5倍，與對照組之間有顯著差異。
[0016]我們通過個體和細胞水平分別證明該基因與溴氰菊酯的抗性密切相關，因此本發 明對進一步闡明溴氰菊酯的抗性機理以及在抗性的防治應用中均具有重要的意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1果繩Kc細胞中prosalpha6的mRNA表達水平（*代表ρ〈0·05)。
[0018]圖2 prosalpha6的RNAi對不同濃度溴氰菊酯脅迫下細胞存活率的影響。*代表ρ〈 0.05〇
[0019] 圖3小菜蛾成活率檢測。*代表ρ〈0 · 05。
【具體實施方式】
[0020] 實施例一
[0021] 1、實驗材料
[0022] 小菜蛾源自貴州省貴陽市花溪區中曹鄉的甘藍地，室內繁殖一代后測四齡幼蟲的 LD5q值，與武漢市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四齡幼蟲LD5Q值比較，發現小菜蛾田間種群 為敏感種群。將其作為敏感品系同步隔離培養。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系由點滴法處理小 菜蛾四齡幼蟲敏感品系經多代繁育選育而成。
[0023] 2、prosalpha6 的功能研究
[0024 ] (1)不同濃度溴氰菊酯對pr 〇 sa 1 pha6的誘導作用
[0025] 用不同濃度的溴氰菊酯處理果蠅Kc細胞，采用熒光定量PCR技術，檢測不同濃度處 理細胞中prosalpha6基因的表達水平。結果顯示，prosalpha6的表達量隨著藥物濃度的升 高而不斷被上調，呈現出一定的線性關系（圖1);
[0026] (2)prosalpha6基因 RNAi對細胞存活率的影響
[0027] RNA干擾48h后，用不同濃度的溴氰菊酯處理干擾組(dsRNA)和對照組(control)細 胞24h，臺盼藍試劑檢測細胞存活率，結果表明：在一系列濃度的溴氰菊酯脅迫下，干擾組細 胞的存活率明顯低于對照組細胞的存活率(圖2)。
[0028] (3)小菜蛾prosalpha6基因 RNAi對溴氰菊酯抗性水平的影響
[0029] ①小菜蛾prosalpha6基因 RNAi的合成
[0030]根據prosalpha6基因的保守序列利用pp5軟件設計下列引物，合成出小菜蛾 prosalpha6 基因的dsRNA。
[0031] 上游引物：
[0032] S^TAATACGACTCACTATAGGGATGTTTCGCAACCAGTACGA-S7 (SEQ ID N0.1)
[0033] 下游引物：
[0034] S^TAATACGACTCACTATAGGGCTATGGACGCTGCTCGGT-S7 (SEQ ID NO.2)
[0035] ②構建表達載體
[0036] 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA。
[0037] ①冰上加樣消化液如下
[0039] ②置于37Γ孵育lh;
[0040] 純化 dsRNA。
[0041 ]①組裝反應液
[0043] ②輕輕吹打混勻組裝反應液，室溫13000rpm條件下離心2min，棄濾液；
[0044] ③吸取500yL Wash Solution加入到制備管中，室溫下13000rpm離心2min，棄濾 液；
[0045] ④重復步驟③一次；
[0046] ⑤再空管離心30sec以盡可能的去除多余的液體；
[0047]⑥將制備管放入一個新的收集管中，向其中加入50yL預先加熱至大于95°C的 Elution Solution，最大轉速離心2min，收集濾液；
[0048]⑦重復步驟⑥一次；
[0049]⑧分光光度計測定產物的A26Q以檢測dsRNA的濃度將擴增的prosalpha6基因的 dsRNA插入pET_2P (購自promega公司）構建雙鏈RNA表達載體pET-2P_pros。
[0050] ③雙鏈RNA在大腸桿菌中的表達
[0051 ] 取5yL pET-2P-pros質粒加入到50yL解凍后的HT115感受態細胞中，加入IPTG使終 濃度為〇. ImM，37°C條件下連續培養5h，對照組不加 IPTG誘導，相同條件下培養5h。
[0052]④小菜蛾抗溴氰菊酯品系幼蟲喂食dsRNA
[0053]將菌液和超純水以1:10的比例混合至菌體沉淀完全溶解，將大小相同的新鮮甘藍 葉片置于菌液中浸泡l〇s，晾干后放于直徑9cm，高1.5cm的玻璃培養皿中，每個培養皿放置 15頭幼蟲。未經IPTG誘導組和只用超純水處理組作為對照組，同樣每個培養皿15頭幼蟲。各 設3個重復，每個重復60頭幼蟲，連續喂食dsRNA浸漬的新鮮葉片3天。
[0054]④毒力測定
[0055] 將溴氰菊酯以丙酮作為溶劑配成濃度2500ppm，分別對prosalpha6基因干擾組、未 經IPTG誘導組和只用超純水處理組的小菜蛾幼蟲進行毒力測定。適宜條件下培養48小時， 統計不同處理組的幼蟲死亡數。用鑷子觸動蟲體，不活動者計為死亡，統計死亡率。結果表 明，干擾了 prosalpha6基因的小菜蛾的成活率均明顯低于對照組，并且有統計學差異。水處 理對照組設為1(圖3)。
【主權項】
1. 蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6在治理溴氰菊酯抗性中的應用。2. -種利用蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步驟 是： (1) 用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit說明 書進行操作，合成小菜蛾蛋白酶體妨亞基基因 prosalpha6的dsRNA; (2) 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA; (3) 純化 dsRNA; (4) 將prosalpha6的dsRNA噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上，通過滲透和取食， dsRNA進入小菜蛾細胞，沉默prosalpha6基因； (5) 48小時后施溴氰菊酯類殺蟲劑。3. 小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA在制備小菜蛾對溴氰菊酯增敏劑中 的應用。
【文檔編號】C12N15/90GK105969808SQ201610304811
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】程羅根, 胡俊麗, 程晨, 焦東旭, 李風良
【申請人】南京師范大學