專利名稱：樅色卷蛾抗凍蛋白、基因及其使用方法
相關申請交叉文獻本申請是1996年6月3日提交的美國申請No.08/657,264的部分續展申請，該申請結合入本文作參考。
背景技術：
當今，制冷尤其是冷凍是常用的且較佳的保藏生物制品的方法。盡管制冷保留了樣品的一些重要性質，但是其它性質仍以緩慢但顯著的速度受損。冷凍雖然可阻止大多數這種損害，但是冷凍和解凍的結合會導致其它變化，破壞其它重要的性能。
在現今社會中，冷凍食品已經成為人類日常飲食的主要部分。為了確保高質量的產品，滿足消費者口味的需求，食品加工者已經對尤其是冷凍蔬菜以及冷凍甜點(如冰淇淋)進行了廣泛的研究。現已知道，再次結晶對冷凍食品的味道和質地產生很大的不利影響。運輸時更經常伴有溫度波動的無霜冷凍機的出現加劇了這種情況。保存在不低于0℃的溫度下或者即使維持在冰點溫度下相當短的時間后，許多冷凍食品會使人失去胃口，或會變壞而根本不適合人食用。
盡管已經采用了各種技術來減少再結晶帶來的損壞，但是取得的進展很有限，仍有大量問題存在。對冷凍食品的加工作改動常會顯著影響冷凍食品的質量、顏色、口味和/或質地。另外，額外的加工是非常昂貴和耗時的，從而使得加工方法不經濟。在食品中加入添加劑也會有類似問題。
對于生物制品，如治療藥物、血漿、組織培育用的哺乳動物細胞等，冷凍會引起大量的破壞。例如，冷凍本身會殺死大多數真核細胞，而且只經歷一次凍融的細胞就會表現出活力大大降低。在組織深低溫保藏中也普遍存在存活細胞功能受損的情況，從而給器官移植帶來缺點。同樣，在農業上霜凍或其它冷凍對作物的損傷也是一個嚴重的問題。最后，如果藥物不維持在所需的嚴格的溫度條件下，就會變得失效甚至有害。
雖然大約30年前就已首次描述了在黃粉蟲(Tenebrio molitor)中的蛋白質介導的熱滯后(TH)(Grimstone等，Philos.Trans.B 253:343(1968))，但是純化這些熱滯后蛋白質(THP)的許多嘗試并未獲得有足夠TH的純化組分來解釋血淋巴活性(Grimstone，等，(1968)；Patterson & Duman,J.Exp.Zool.210:361(1979)；Schneppenheim & Theede Comp.Biochem.Physiol.67B:561(1980)；Tomchaney，等，Biochemistry 21:716 (1982)；Paterson Duman J.Exp.Zool.219:381(1982)；以及(Horwath,et al.,Eur.J.Entomol.93:419(1996))。這些蛋白質的均一性并沒有得到證實，它們之間的氨基酸組成互不相同，也不與本文報道的組成相同。
當前需要促進生物體物質低溫保藏性質(包括冷凍食品和生物制品的保存)的合適的新技術和新組分。理想的是，這些方法和組分是廉價的，而且是完全安全的，適于人類消費或體內治療之用。也需要有合適的新方法和新組成來降低非生物體系統的冰點、或抑制其結冰(如除冰處理)。本發明滿足了這些需求以及其它需要。
發明慨述東樅色卷蛾(Choristoneura fumiferana)和西樅色卷蛾(Choristoneuraoccidentalis)是北美森林中的耐凍害蟲。它們的抗凍防御靠的是它們血淋巴中的熱滯后(TH)活性，熱滯后活性可以使昆蟲在冰或冰核存在下降低它們的冰點。這種活性用含冰溶液的冰點和融點間的溫度差(℃)來確定。樅色卷蛾幼蟲的血淋巴證明，冰點降低超過4℃。
本發明提供了編碼在樅色卷蛾幼蟲中起熱滯后作用的蛋白質的核酸分子，如SEQ ID NO:1中的核酸。本發明也提供可分離出的核酸編碼的抗凍蛋白，該蛋白質的性質如下計算分子量在7-15kDa間；在約1mg/mL濃度下其熱滯后活性大于約1.5℃；可與抗凍蛋白或其抗原片段的抗體特異性結合，此種抗原性片段選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或有至少60％氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。在一個較佳的實例中，分離出的核酸編碼計算分子量約為8-12kDa的蛋白質。在一個較佳的實例中，核酸編碼的蛋白質熱滯后活性在約1mg/mL濃度時大于2℃。在一個較佳的實例中，核酸編碼的蛋白質有至少80％的序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。在還有一個實例中，本發明提供了編碼有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的蛋白質的核酸。在另一個實例中，分離出的核酸可編碼在昆蟲中發現的蛋白質，在較佳的實例中該昆蟲是樅色卷蛾屬。本發明也提供了分離出的核酸，該核酸可在嚴格的條件下與SEQ ID NO:1特異性雜交。本發明還提供一種從純化的樅色卷蛾屬抗凍蛋白中分離的核酸，該抗凍蛋白可與針對選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3抗凍蛋白的抗體特異性結合。
本發明提供了THP蛋白質，其包括從本發明核酸衍生獲得的重組蛋白質。THP前體蛋白(SEQ ID NO:2)N端有18個殘基信號序列(SEQ ID NO:11)，該序列斷裂后生成成熟的THP蛋白(SEQ ID NO:3)(見圖2，在圖中顯示了樅色卷蛾THP的cDNA和相應的氨基酸序列)。前體蛋白質(SEQ ID NO:2)的分子量約為11000道爾頓，成熟THP(SEQ ID NO:3)蛋白質的分子量約為9060道爾頓。本發明也提供了一種分離的抗凍蛋白，該蛋白質的計算分子量約為7-15kDa；在約1mg/mL的濃度下其熱滯后活性大于約1.5℃；而且它可與選自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的抗凍蛋白產生的抗體特異性結合，或者有至少60％氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。在一個較佳的實例中，可在昆蟲中發現抗凍蛋白，而在一個更佳的實例中，該昆蟲是樅色卷蛾屬。在一個較佳的實例中，抗凍蛋白在約1mg/mL的濃度下其熱滯后活性大于約2℃。在另一個較佳的實例中，抗凍蛋白選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
本發明也提供了抗本發明蛋白質的抗體，該抗體可與本發明的蛋白質結合。本發明提供了在免疫反應條件下與包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白發生特異性免疫反應的抗體。本發明也提供了一種抗體，該抗體可在免疫反應條件下與包括權利要求1所述核酸編碼的蛋白質在內的抗凍蛋白發生特異性免疫反應。
在本發明的另一個實例中，提供了轉化的酵母、細菌和轉基因生物。許多冷凍食品會由于持續處于冰點下溫度或反復冷融而形成冰晶。本發明的THP的存在可提供更長的保藏期，使這些食品更加可口。預計轉基因動物和植物可在冰點下的溫度下更好地存活。本發明提供了一種生物，在該生物內引入外源核酸序列(該核酸序列可在嚴格的條件下與SEQ ID NO:1或權利要求1所述的核酸特異性雜交)，該生物可將外源核酸翻譯成一種抗凍蛋白。本發明還提供了一種有外源核酸序列的生物，該外源核酸序列可翻譯成抗凍蛋白表達到生物體外。在一個較佳的實例中，生物是魚。在另一個較佳的實例中，生物是生活在咸水環境中的魚，或該魚是鮭科家族成員。在其它較佳的實例中，生物可以是植物、真菌、酵母或細菌。在另一實例中，如果生物是酵母，則其選自Torulopsis holmil、Saccharomycesfragilis、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces lactis、以及Candida pseudotropicalis。在另一個實例中，如果生物是細菌，則其選自大腸桿菌(Escherichia coli)、堅忍鏈球菌(Streptococcus cremoris)、乳鏈球菌(Streptococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜檸檬酸明串球菌(Leuconostoccitrovorum)、腸系膜樣明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、Bifidobacteriumbifidum、Bifidobacteriu breve以及Bifidobacterium longum。
本發明提供了一種降低水溶液冰點的方法，該方法包括在水溶液中加入抗凍蛋白。在一個較佳的實例中，該方法包括將權利要求1所述的核酸編碼的抗凍蛋白加入水溶液中。在另一個較佳的實例中，將水溶液施用于生物；抗凍蛋白用重組體方法來制得；抗凍蛋白可與權利要求13或14所述的抗體特異性結合；抗凍蛋白選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；抗凍蛋白由與SEQ ID NO:1的核酸特異性雜交的核酸分子編碼。
此外，認為將本發明的THP加入水溶液中可更好地保藏運輸中的器官和其它生物制品。
也需要有合適的新方法和新組分來降低非生物系統的冰點或抑制其結冰(如去冰處理)。
參照說明書的其余部分，附圖和權利要求可進一步理解本發明的特征和優點。
附圖簡述

圖1是HPLC C18反相柱的洗脫曲線，在反相柱上加有樅色卷蛾第二齡期幼蟲的蛋白質混合物，該混合物預先在Sephadex G-75柱上進行分子篩分離(見文本)。
圖2表明樅色卷蛾THP的cDNA和相應的氨基酸序列。
圖3A是樅色卷蛾第二齡期幼蟲的粗提物上形成的冰的光學顯微照片。圖3B是含有約5mg/mL美洲大綿尉Ⅲ型THP蛋白質(在魚類中，THP蛋白也稱為AFP蛋白)的溶液形成的冰光學顯微照片。
發明詳述本發明涉及分離的核酸序列編碼的新一類的抗凍蛋白(THP)。獲得天然THP基因的步驟通常包括從樅色卷蛾屬(如東樅色卷蛾和西樅色卷蛾)構建或獲得基因文庫，檢測和分離所需的基因，將其克隆入合適的宿主細胞中，使其在宿主細胞中表達，然后純化獲得表達的蛋白質。天然的蛋白質可不經修飾加以使用，或是在不影響TH活性的條件下進行各種修飾。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請均結合入本文作為參考。
Hew等報道了東樅色卷蛾的THP粗品與絨林父魚(Hemitripterus americanus)的THP在胱氨酸含量高、分子量相近(約13kDa)、以及與絨林父魚THP抗原交叉反應性方面相似。本發明的新的東樅包卷蛾THP至少在兩個方面與Hew等描述的蛋白質不同。首先，其分子量約為9kDa。第二，它并不與抗-絨林父魚多克隆抗血清交叉反應(Slaughter,D.,等，Antifreeze proteins from the sea raven,Hemitripterus americanus,J.Biol.Chem.256:2022-2026(1981)；Dr.Choy Hew,University of Toronto饋贈)。這樣Hew等的制品與本發明的新型THP不同。
本發明的THP比至今為止公開的任何純化的抗凍蛋白更具活性。本發明的THP提供的冰點降低程度比魚類AFP(THP)或黃粉蟲THP(由Patterson制備，如Patterson,J.等在The role of the thermal hysteresis factor in Tenebrio molitor larvae,J.Exp.Biol.74:37-45(1978)所述)提供的高幾倍。
然而，和魚類抗凍蛋白一樣，樅色卷蛾THP看來是通過吸附-抑制機理來作用的。在THP存在下，直至超過不平衡的冰點時冰晶才生長。在此時，冰晶體從晶核中暴長，主要沿a軸形成固態冰，冰的前緣寬而光滑。相反，在魚類AFP存在下，一旦超過冰點，無數冰針將沿著和平行于c軸暴長。
另外，與魚AFP相似(DeVries,Annu.Rev.Physiol.45:245(1983)),TH活性和THP濃度間的關系呈雙曲線。然而，在THP存在時形成的冰晶是不同尋常的，因為它們的表面有明顯的弧度。相反，在魚類Ⅰ型和Ⅲ型AFP存在下形成的冰晶是六方雙錐形，有著多個界線清晰的小平面。
經純化的表達的THP蛋白可直接加入水溶液中以降低冰點，或在另一個實例中，可表達抗凍蛋白的經轉化生物可加入待冷凍保藏的物品(如冷凍甜點)中。在還有一個實例中，經轉化的生物(即魚、植物和酵母)不需要胞外表達THP蛋白，但是THP基因和胞內蛋白質的存在將提高生物在冰點溫度下的存活能力。例如，經轉化的生物可以是咸水魚。經轉化的咸水魚包括鮭魚亞科家族成員、大西洋庸鰈、裸蓋魚或任何沒有抗凍蛋白或蛋白水平不足的可食咸水動物。用THP序列轉化的植物包括葡萄、油籽植物如canola、谷類、柑橘類和甘蔗。
Ⅰ.定義術語“抗體”指可以特異性識別和結合分析物(抗原)的、基本上由一個或多個免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽。識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、μ恒定區基因以及無數個免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們依次確定了免疫球蛋白類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗體)結構單元包括一個四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每一對有一條“輕鏈(約25kD)”和一條“重鏈(約50-70kD)”。每條鏈的N端是有約100-110或更多的氨基酸的可變區，該可變區主要是起抗原識別作用。術語“可變輕鏈(VL)”和“可變重鏈(VH)”分別指這些輕鏈和重鏈。
例如，抗體以完整的免疫球蛋白形式存在，或以由各種肽酶消化產生的許多特性明確的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區二硫鍵下消化抗體，形成Fab的二聚體F(ab)′2，該二聚體本身由輕鏈通過二硫鍵與VH-CH1相連。F(ab)′2可在溫和的條件下被還原，鉸鏈區內的二硫鍵斷裂，使F(ab)′2二聚體變成Fab′單體。Fab′單體基本上是帶部分鉸鏈區的Fab(參見FUNDAMENTALIMMUNOLOGY,3RD ED.,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。盡管在完整的抗體消化時可以產生明確的各種抗體片段，但是普通技術人員也應當理解，這些片段可用化學從頭合成或用重組體DNA方法來制得。因此，本文所用的術語“抗體”也包括通過對整個抗體進行修飾制得的或是那些用重組DNA法從頭合成的抗體片段(如單鏈Fv)。
“抗凍蛋白抗體”指能與本發明的抗凍蛋白或其亞序列特異性結合的抗體或抗體片段。
術語“抗凍蛋白”指在一些異型體溫生物(如樅色卷蛾屬，如東樅色卷蛾或西樅色卷蛾，黃粉蟲和植物)的體液中發現的蛋白質，它們有共同的已知性能，即它們可非依數性(non-colligatively)降低水的冰點。THP也稱為“熱滯后蛋白”。如本文所用的，“抗凍蛋白”或“THP”包括化學合成的以及重組產生的多肽，該多肽的蛋白質序列與天然存在的抗凍蛋白基本相似，而且保留了抗凍多肽的性質。
術語“降低水溶液冰點”指降低水溶液在形成冰晶時的溫度。冰點的降低程度取決于用來降低冰點的組分及其在水溶液中的濃度。冰點降低幅度隨著水溶液中加入的抗凍組分的增加而提高，直至達到特定的濃度而不再改變。再在水溶液中加入抗凍化學物質(如乙二醇)會使抗凍組分不溶，或是會提高混合物的冰點。另一方面，再加入本發明的THP不會對降低的溶液冰點有影響。
含有THP蛋白的溶液的冰點定義為含有冰晶成核劑的待測樣品變成固態冰時的溫度。冰晶可自發產生或從冰核擴張形成。沒有成核劑時固態冰的自發形成通常稱為THP的“過冷能力”。因為如果沒有冰成核劑來引發冰的形成，就會在更低的溫度下發生過冷。
除了用肉眼觀察冰晶的形成外，可用熱滯后測定法來測定溶液冰點和融點間的差值。溶液的融點是溶液僅有一片冰晶時的溫度(見下文，關于TH活性的更完整的描述)。
在本文重組體蛋白部分中術語“外部表達”指轉化細胞合成蛋白質并將其送到胞外基質中的能力。胞外基質可以是多細胞生物細胞的間質空間、細菌肉湯或組織培養基。對于細菌，外部表達也包括將重組蛋白表達入細菌的外周質中。外部表達可以是任何方式，例如分泌和運輸小泡、以膜蛋白形式表達等。
在本

發明內容
中的術語“序列相同性”、“序列相似性”和“同源性”均表示，當將兩個肽序列用例如GAP或BESTFIT程序以缺省的間隙重(default gapweight)進行最優對比時，它們有至少40％的序列相同，以至少50％序列相同為佳，至少60％序列相同為更佳。“氨基酸相同百分數”指兩個多肽的氨基酸序列比較結果，當對兩個多肽進行最佳對比排列時，它們的相同氨基酸接近指定百分數。例如“60％序列相同性”和“60％同源”指兩個多肽的氨基酸序列比較結果，當將它們進行最佳對比排列時，它們有60％的氨基酸相同。較佳的，不同的殘基位置是因保守氨基酸取代而不同。例如，化學性質(如電荷或極性)相似的氨基酸取代不太會影響蛋白質的性能。實例包括谷氨酰胺被天冬酰胺取代或谷氨酸被天冬氨酸取代。
術語“免疫反應條件”指抗體可以與抗原結合的環境。通常，它是免疫結合測定。
術語“分離的”在用于核酸或蛋白質時，表示核酸或蛋白質基本上不含其它在天然狀態下相關的細胞成分。最好呈均質狀態，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測得。在制品中占主要的蛋白質是基本上純的。
具體地說，分離的抗凍蛋白基因是從側接基因并編碼非抗凍蛋白的蛋白的開放讀框中分離獲得的。術語“純化的”表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上形成一條帶。它尤其指核酸或蛋白質至少有85％純，以至少95％純為佳，至少99％純為更佳。
術語“核酸分子”或“核酸序列”指脫氧核糖核酸或核糖核酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非另有特別限定，該術語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，該核酸有與參比核酸相似的結合性能，并以與天然存在的核苷酸相似的方式進行代謝。除非另有所述，特定的核酸序列也包括其保守性修飾的變體(如簡并密碼子取代物)和互補序列，以及顯式表示的序列。特別是，簡并密碼子取代可通過形成序列，使序列中一個或多個所選(或所有)密碼子的第三個位置被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代來實現的。(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。術語核酸可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換。
術語“外源核酸”通常指一種核酸，該核酸經分離、克隆并連接入在自然界中不會與其發生結合的核酸中，和/或導入細胞或細胞環境并在其中表達，而該種細胞或細胞環境不是通常自然界中發現含有所述核酸或蛋白質的細胞或細胞環境。該術語包括從與表達核酸的細胞類型不同的生物或細胞類型原始獲得的核酸，也包括從與表達核酸的細胞系相同的細胞系中獲得的核酸。
術語“核酸編碼序列”表示含有結構RNA(如rRNA、tRNA或mRNA)的序列信息的核酸，該信息可編碼特定蛋白質或肽的初級氨基酸序列或是反式調節因子的結合位點。該術語特別包括天然序列或引入特定宿主細胞中以符合密碼子優先的序列中的簡并密碼子(即編碼單個氨基酸的不同密碼子)。
術語“重組方法”指分離蛋白質、鑒定編碼蛋白質的cDNA序列并插入表達載體中的方法。然后將載體引入細胞中，使細胞表達蛋白質。重組方法也包括將不同來源的編碼或啟動子DNA連接入表達融合蛋白的載體中，使蛋白質組成型表達或誘導型表達。
術語“特異性或選擇性與抗體結合”或“發生特異性免疫反應”在指蛋白質或肽時，是指在大量異源蛋白質和其它生物制品存在下可測定蛋白質存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，特定的抗體與特定的蛋白質結合，而不會與樣品中其它蛋白質大量結合。在這樣的條件下與抗體的特異性結合可能需要選擇對特定蛋白質有特異性的抗體。例如，可選擇針對本發明THP或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示部分序列編碼產物的抗體，來與全長蛋白特異性免疫反應，而不與其它蛋白質(除非是多形性變體)結合。如下所述，可用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，通常用固相ELISA免疫測定來選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的單克隆抗體。參見Harlow和Lane(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborPublications,New York(“Harlow and Lane”)關于用來測定特異性免疫反應活性的免疫測定形式和條件部分。通常，特異性或選擇性反應的信號至少是本底信號或噪擾的兩倍，更通常的為大于本底的10倍-100倍以上。
術語“特異性雜交”指當細胞全部DNA或RNA的制品中存在靶序列時，核酸探針可以與特定的靶DNA或RNA序列雜交、組成雙鏈或結合。“互補的”或“靶”核酸序列指那些可選擇性與核酸探針雜交的核酸序列。合適的退火條件例如取決于探針的長度、堿基組成，以及錯配的數量及其在探針上的位置，通常必需靠試驗來確定。關于核酸探針設計和退火條件的描述，例如可參見Sambrook等，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)(“Sambrook”)，其內容結合入本文作參考，或CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.Ausubel等，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)(“Ausubel”)。
在核酸雜交實驗(如Southern和Northern雜交)中，“嚴格的雜交”和“嚴格的雜交洗滌條件”取決于序列，而且在不同的環境參數下有所不同。在Tijssen(1993)LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULARBIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES第2章第1部分(“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays”,Elsevier,New York)中有關于核酸雜交的廣泛的指導。通常，選擇高度嚴格的雜交和洗滌條件使得比在確定的離子強度和pH下特定核酸序列的熱融點(Tm)低大約5℃。Tm是在確定的離子強度和pH下，50％的靶序列與最佳匹配的探針雜交時的溫度。選擇非常嚴格的條件，使其等于特定探針的Tm。在Southern或Northern印跡法中過濾器上有100個以上互補殘基的互補性核酸雜交物的嚴格雜交條件實例是，42℃下50％福爾馬林和1毫克肝素，雜交過夜。高度嚴格的洗滌條件實例是72℃ 0.15M NaCl洗滌約15分鐘。嚴格的洗滌條件實例是65℃0.2×SSC洗滌15分鐘(參見Sambrook關于SSC緩沖液的描述)。通常，高嚴格性的洗滌前有低嚴格性的洗滌以除去背景探針信號。例如超過100個核苷酸的雙鏈體的中等嚴格性洗滌是45℃ 1×SSC洗滌15分鐘。例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴格性洗滌是40℃ 4-6×SSC洗滌15分鐘。通常在特定的雜交測定中，信噪比為不相關探針所測得的信噪比的2倍(或更高)，就表明檢測到有特異性雜交。如果核酸編碼的多肽是基本相同的話，則在嚴格條件下不相互雜交的核酸仍是基本相同的。例如當用基因密碼所允許的最大密碼子簡并性來生成核酸拷貝時，會發生這種現象。
術語“熱滯后活性”或“TH活性”指改變含冰溶液的冰點和融點間溫度差(℃)的能力。較佳的，TH活性可根據Lawson & Semler,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA88:9919(1991)中提出的步驟在納升滲壓計中觀察冰晶的形成來測定。或者，可根據deVries,METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.127,Packer(ed.),Academic Press,New York(1986)所述的方法或其變化方案來測定TH活性。
例如，在本發明中，天然樅色卷蛾屬(如東樅色卷蛾或西樅色卷蛾)血淋巴中的THP在1mg/mL下的TH活性大于約4℃。本發明的重組THP在1mg/mL時的TH活性約為4℃或更低。更佳的，TH活性低于約3℃。最佳的，TH活性在1.5-3℃間。據推測，天然THP和重組THP的TH活性間的小差別是因為在從細菌衍生獲得的重組蛋白質沒有最優的折疊。當蛋白質經適當折疊后，預計重組THP的TH活性將與天然THP的TH活性相似。
Ⅱ.編碼THP的核酸A．總體方法本發明的核酸組分，無論是RNA、cDNA、基因組DNA還是基因重組的雜交體，均可從天然來源中分離獲得，或可體外合成制得。權利要求所述的核酸可以存在于轉化細胞中，轉化細胞裂解物中或以部分純化或基本純的形式存在。
編碼抗凍蛋白的基因的核酸操作方法，如文庫的生成，亞克隆入表達載體，標記探針，DNA雜交等在Sambrook一書中均有大致描述。
本文中核酸和蛋白質的檢測和定量可采用本領域技術人員熟知的許多方法中的任何一種。這些方法包括生化分析方法(如分光光度法、放射顯影法、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散色譜法等)，以及免疫方法(如流體或凝膠沉淀素反應、免疫擴散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光測定等)。核酸的檢測可用熟知的方法如Southern分析、northern分析、凝膠電泳、PCR、放射標記、閃爍計數和親和層析來進行。
B．編碼THP的核酸的分離分離全部DNA或RNA的方法是本領域技術人員已知的。例如核酸的分離和純化方法如LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,P.Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)(“Tijssen”)中第3章所描述的。
1．DNA文庫的制備和篩選可采用許多方法來分離編碼本發明的抗凍蛋白的DNA序列。例如，可用含有與本文公開的序列或亞序列(SEQ ID NO:4或5)互補序列的標記寡核苷酸探針來從基因組或cDNA文庫中分離DNA。這些探針可直接用于雜交測定來分離編碼同種型THP的DNA。或者，探針可用于擴增方法如PCR，并可用例如PCR方法(見下文)來分離編碼THP的DNA。
為了制備cDNA文庫，將mRNA從樅色卷蛾屬幼蟲或在組織培養物中生長的幼蟲細胞中分離出來，用本領域熟知的方法從mRNA逆轉錄并插入載體中。將載體轉染入重組的宿主中進行繁殖，然后篩選和克隆。制備和篩選cDNA文庫的方法是熟知的。參見Gubler和Hoffman,Gene 25:263-269,(1983)和Sambrook。
為了制備基因組文庫，用熟知的方法從幼蟲中抽提出全部DNA并進行純化(例如參見Sambrook)。用已知的方法(如機械剪切或酶消化)產生適當大小的DNA，獲得約12-20kb的DNA片段。然后用梯度離心將片段與不需要的片段分離，并插入λ噬菌體或其它載體中。這些載體和噬菌體如Sambrook所述的在體外包裝。用Benton & Davis,Science,196:180(1977)中所述的噬斑雜交分析重組的噬菌體。按照M.Grunstein，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,72:3961-3965(1975)中大致描述的方法進行菌落雜交。
可用與核酸探針(例如，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1 3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)在Southern印跡法上雜交的能力來鑒定cDNA或基因組文庫中的編碼THP的DNA。這些DNA區域一旦被鑒定就可用本領域技術人員熟知的標準方法來分離獲得。或者，可用RNA在Northern印跡法中與核酸探針雜交的能力(參見Sambrook)來鑒定編碼抗凍蛋白的RNA。
用作探針的寡核苷酸可根據由Beaucage和Carruthers首先提出的固相亞磷酰胺三酯方法用自動合成儀(如Needham-VanDevanter,D.R.,等，Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述)來化學合成。寡核苷酸的純化可采用非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC(如Pearson,J.D.和Regnier,F.E.,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述)。合成的寡核苷酸序列可用化學降解方法(Maxam,A.M.和Gilbert,W.,METHODS IN ENZYMOLOGY,65:499-560,(Grossman,L.和Moldave,D.,eds.),Academic Press,New York(1980))來驗證。
也可用本領域技術人員已知的其它方法來分離編碼抗凍蛋白的DNA。參見Sambrook和Ausubel中對于其它可用來分離編碼特定蛋白質分子的DNA的方法。
2．編碼THP的核酸的擴增可用核酸序列(SEQ ID NO:1)和蛋白質序列信息(SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3)來設計用來鑒定抗凍蛋白(如樅色卷蛾THP)序列的PCR引物。可用已知可生成樅色卷蛾屬THP序列的PCR引物對(如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；SEQID NO:13和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)來直接擴增新的抗凍蛋白種類和同種型。在東樅色卷蛾的一種同種型中，SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5引物對將擴增全長THP cDNA編碼序列。
可用PCR引物對(如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)來直接擴增新的抗凍蛋白種類及其同種型，或用PCR引物對來生成包括信號序列、成熟蛋白質編碼區和大部分3′非翻譯區(即poly-A附著位點)的DNA探針。這些引物，無論是用來直接擴增新的THP種類，直接用作探針，還是用來生成(通過PCR擴增)較長的DNA探針，均還可以與各種不同的THP種類及其同種型(尤其是包括那些在信號序列和3′非翻譯區的保守性比成熟蛋白質編碼區的保守性好的THP序列變體)雜交。估計這些23聚體的引物的Tm為62℃。
PCR引物(如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)也可用來直接擴增新的抗凍蛋白種類及其同種型，或用來生成包括THP編碼序列內部亞系列的DNA探針。在東樅色卷蛾的一種同種型中，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16引物對可擴增獲得編碼成熟THP蛋白質內部模塊的191堿基對的PCR產物。這些引物的估計Tm為62-64℃。
采用不同的雜交方法和條件，可用PCR生成的寡核苷酸來鑒定和檢測編碼抗凍蛋白的新的核酸。本領域技術人員應當知道，無論采用何種擴增方法，如果希望獲得定量的結果，就必須注意采用可維持或控制擴增核酸的相對頻率的方法。合適的擴增方法包括但不局限于聚合酶鏈反應PCR(PCR PROTOCOLS,AGUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,Innis，等，Academic Press,Inc.N.Y.,(1990)(“Innis”))，連接酶鏈反應(LCR)(參見Wu和Wallace,Genomics,4:560(1989)(“Wu”),Landegren等，Science,241:1077(1988)(“Landegren”)以及Barringer等，Gene 89:117(1990)(“Barringer”)；轉錄擴增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173(1989)(“Kwoh”))；以及自動維持序列擴增(Guatelli，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990)(“Guatelli”))。
上述所有的方法均可用來制備編碼抗凍蛋白的DNA。在PCR技術中，合成與待擴增DNA區域兩端互補的寡核苷酸引物。然后用這兩個引物進行聚合酶鏈反應(參見Innis)。PCR可用于各種擴增、鑒定和分離編碼THP核酸的過程。在這些過程中，通過分析本文列出的DNA序列，制成可鑒定可擴增編碼抗凍蛋白的DNA的合適的引物和探針。例如寡核苷酸5′-CATATGCATATGGATGGCTCGTGTACAAACAC-3′(SEQ ID NO:4)和5′-AAGCTTAAGCTTTTAATTAGCACTGAAAGTACA-3′(SEQ ID NO:5)可用于PCR程序，以鑒定和擴增THPcDNA的不同種類和同種型。在東樅色卷蛾的一個同種型中，該引物對可擴增全長THP cDNA編碼區。應注意，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5中有下劃線的密碼子分別表示THP同種型中發現的起始密碼子和終止密碼子。
如上所述，用來鑒定和擴增THP不同種類和同種型的其它引物對例子包括寡核苷酸5′-TGAAGTGTTTAATGCTGATCATG-3′(SEQ ID NO:13)和5′-CATTAGAGTAGCATAATGTAAGC-3′(SEQ ID NO:14)；和5′-TCCAAGTGCGAAAAATCGACG-3′(SEQ ID NO:15)和5′-GCTGATGGAGCAGGTACACC-3′(SEQID NO:16)。
PCR擴增的序列也可被標記并用作可檢測的寡核苷酸探針，這些核酸探針可如上所述用本領域熟知的擴增方法來生成。另外，用熟知的方法，還可用標記的擴增DNA作為探針來進一步從各種cDNA或基因組文庫中鑒定和分離其它抗凍蛋白種類或同種型。
DNA擴增的另一種方法是“RACE”方法。簡單地說，該方法包括用隨機的5′引物和確定的3′引物(5′RACE)或隨機的3′引物和確定的5′引物(3′RACE)通過PCR來擴增DNA序列。然后將擴增后的序列亞克隆入載體中，再用標準方法在載體中對擴增序列進行測序。RACE方法是本領域技術人員所熟知的，用來進行RACE的試劑盒是商業上可獲得的(例如，5′RACE系統，GIBCO BRL,GrandIsland,New York,USA)。
3．將編碼THP插入物插入細菌中如上所述，使全部DNA斷裂，以制備和篩選基因組DNA，并將其插入噬菌體中。一旦確定(用PCR、雜交等方法)了含有所需的抗凍核酸序列的插入物，就將它們從λ噬菌體載體中切下，然后插入細菌載體中進行擴展。合適的細菌載體是本領域工作人員已知的，可從商業上購得。最合適的載體取決于采用的細菌、插入物的大小、對含有所需的插入物的細菌的檢測方法以及從業者的偏好。
為了簡化對含有插入物的載體所轉化細菌菌落的鑒定，許多載體在酶(尤其是β-半乳糖苷酶)的編碼區中有限制性酶切位點或其它剪接位點。如果插入物成功地插入載體的限制性或剪接位點，則酶被滅活。在用載體轉化細菌后(見下文)，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(β-半乳糖苷酶的底物)存在下生長的菌落呈白色，而不含插入物的細菌長成的菌落呈藍色。因此，如果插入物連接入載體的頻率非常低，則只能從眾多不含插入物的菌落中挑取到少量含插入物的菌落。
然后將載體引入大腸桿菌變體中。將外源DNA引入細菌細胞中的方法是本領域技術人員已知的，但是最常用的方法是電穿孔和感受態細胞的熱休克。更通常的，感受態大腸桿菌是由商業上購得的(例如購自Invitrogen,San Diego,CA)。或者，可用本領域熟知的方法(Sambrook)使細菌成為感受態，以接受外源DNA。為了將含有感興趣的插入物的載體引入細菌中，使感受態細菌經歷熱休克過程。簡單地說，將細菌放置在冰浴中，在加入DNA后，將細菌溫度升高至40-50℃(42℃較佳)。將細菌放回冰浴進行培育。關于將DNA引入細菌的更詳細描述可參見Sambrook。
使細菌培養物生長并在瓊脂糖上劃平板。通常，載體編碼區中的基因可使經轉化的細菌能夠耐受抗生素。因此，接受了載體的細菌可在摻有抗生素的瓊脂糖平板上存活并形成菌落。存活菌落可用來肉湯培育，擴展成大量轉化細菌的培養物。
用本領域熟知的方法可從細菌裂解液中獲得純化質粒和其它載體。有許多商業供應商出售可從全部細菌DNA獲得純化小的環化DNA(質粒)的試劑盒。這些試劑盒按照生產商的說明很容易使用，而且得率通常非常高。
4．THP DNA的測序對新分離的DNA進行測序就可鑒定本發明的THP核酸、該核酸編碼的THP種類或其等位基因變異體、以及本發明的抗凍蛋白并明確它們的特性。如果蛋白質有至少60％氨基酸序列與SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3確定的東樅色卷蛾THP序列相同，則認為該蛋白質是THP蛋白的同種型。
當抗凍蛋白編碼序列仍為載體中的插入物、或從載體釋放、或從載體分離時，就可對抗凍蛋白編碼序列進行測序。THP編碼插入物可通過限制性酶切或PCR擴增從載體中釋放出。為了對插入物測序以求尋找那一個插入物含有全長抗凍編碼序列，可用根據N端或C端而定的引物(如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)或根據原始λ噬菌體中的插入點而定的引物作為引物。更佳的是，可合成其它引物以提供重疊的序列。通常，采用雙脫氧測序方法(Sequenase,U.S.Biochemical)。然而，也可采用其它本領域技術人員已知的試劑盒和方法。
上述細菌克隆的另一種方法是，用輔助噬菌體(如R408(Stratagene))對cDNA文庫的陽性λ噬菌斑進行斑內切割。然后可對雙鏈DNA純化、測序或用衍生自λ噬菌體的引物進行PCR擴增。
C．核酸雜交方法本文公開的雜交方法可用來鑒定、分離和表征編碼本發明的抗凍蛋白(包括不同的THP種類和等位基因變異)的基因和基因產物(即mRNA)。
采用核酸雜交方法來測定特定的DNA和RNA的各種方法是本領域技術人員已知的。參見NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION,A PRACTICAL APPROACH,Ed.Hames,B.D.和Higgins,S.J.,IRL Press,1985；Gall和Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.63:378(1969)；John，等，Nature 223:582(1969)；和Sambrook。雜交形式的選擇并不是關鍵。
例如，評價樣品中編碼抗凍蛋白的DNA是否存在的方法包括Southern轉移法。簡單地說，使消化的細菌基因組DNA在緩沖液中的瓊脂糖板凝膠上走電泳，并轉移到膜上。用核酸探針進行雜交。對于本發明的THP，核酸探針可根據這類蛋白質中的保守的核酸序列來設計。核酸探針宜有20個堿基或更長。(參見Sambrook關于選擇核酸探針序列用于核酸雜交部分。)雜交部分的顯現使得能夠定性地確定編碼抗凍蛋白的DNA是否存在。
同樣，可用northern轉移法來檢測編碼抗凍蛋白的mRNA。例如，用酸性胍-苯酚-氯仿抽提方法可從給定的細胞樣品中分離出mRNA。然后對mRNA進行電泳，分離出mRNA類，將mRNA從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上。如同Southern轉移法，可用標記的探針或PCR來鑒定編碼抗凍蛋白的核酸是否存在。
夾心測定法是用來檢測或分離核酸序列的商業上有用的雜交測定法。這些測定法采用共價固定在固體支持物的“捕獲”核酸，以及溶液中標記過的“信號”核酸。臨床樣品則提供靶核酸。“捕獲”核酸和“信號”核酸探針與靶核酸雜交，形成“夾心式”雜交復合物。為了使該方法有效，信號核酸不能與捕獲核酸雜交。
通常，用標記信號核酸來檢測雜交。互補核酸或信號核酸可用通常用來檢測雜交多核苷酸存在與否的幾種方法中的任一種來作標記。最常用的檢測方法是用3H、125I、35S、14C或32P標記的探針等進行放射自顯影或熒光自顯影。其它標記包括與標記過的抗體結合的配體、熒光團、化學發光劑、酶和作為標記配體的特異性結合對成員的抗體。
雜交復合體的檢測可能需要使產生信號的復合體與靶和探針多核苷酸或核酸的二聚體結合。通常，在交聯探針的配體和交聯信號的抗配體間通過配體和抗配體間的相互反應會產生這樣的結合。
標記也可間接地檢測雜交復合體。例如，當標記是半抗原或抗原時，可用抗體來檢測樣品。在這些體系中，通過使熒光素或酶分子與抗體結合，或在一些情況下是通過與放射性標記連接(例如參見Tijssen,pp.9-20)來產生信號的。
用核酸擴增系統使被檢測的靶核酸倍增，可增強雜交測定法的靈敏度。適用于擴增序列(用作分子探針或產生核酸片段以進行以后的亞克隆)的體外擴增方法是已知的。足以指導本領域技術人員進行這些體外擴增(包括PCR、LCR、Qβ-復制酶擴增和其它RNA聚合酶介導的方法(如NASBA))的方法實例在Berger，Sambrook以及Ausubel和Mullis等，(1987)；美國專利No.4,683,202；Arnheim &Levinson,C & EN 36-47(1990)；Lomell等，J.Clin.Chem.,35:1826(1989)；VanBrunt,Biotechnology,8:291-294(1990)；Wu和Wallace,Gene 4:560(1989)；Sooknanan和Malek,Biotechnology 13:563-564(1995)；Innis；Kwoh；Guatelli；Landegren；以及Barringer中有所描述。克隆體外擴增核酸的改進方法在Wallace等，美國專利No.5,426,039中有所描述。目前在本領域中提出的其它方法是核酸序列為基礎的擴增(NASBATM,Cangene,Mississauga,Ontario)和Qβ復制酶體系。這些系統可用來直接鑒定突變體，只有當有選擇序列存在時設計PCR或LCR引物才能延伸或連接。或者，選擇序列通常可用例如非特異性PCR引物來擴增，擴增后的靶區域再探測表示突變體的特異性序列。
例如在體外擴增方法中用作探針、在診斷方法中用作基因探針或者用作抑制成分(見下文)的寡核苷酸通常是根據Beaucage和Caruthers描述的固相亞磷酰胺三酯方法，如用自動合成儀來化學合成制得的(如Needham-Vandevanter中所述)。寡核苷酸的純化(如果需要)通常用非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC(如Pearson和Regnier中所述)來進行。合成的寡核苷酸序列可用Maxam和Gilbert的化學降解法來驗證。
應當理解，核酸雜交測定法也可以排列為基礎(array-based)的方式進行。在該方法中，將有多個不同的“探針”核酸排列后與一個靶核酸雜交。通過這種方式，大量不同的雜交反應可基本上“平行地”進行。這就可迅速地、基本同時評價大量反應物。以排列方式進行雜交反應的方法是本領域技術人員所熟知的。(例如參見Jackson，等，Nature Biotechnology 14:1685(1996)，以及Chee，等，Science274:610(1995))。
測定編碼蛋白質基因表達水平的另一種方法是原位雜交。原位雜交測定法是眾所周知的，該方法在Angerer等，Methods Enzymol.,152:649(1987)中有所描述。在原位雜交測定中，將細胞固定在固體支持物(通常是載玻片)上。如果要探測DNA，則用熱或堿來使細胞變性。然后使細胞在適當的溫度下以雜交溶液接觸，以使對編碼蛋白質的核酸序列有特異性的標記探針退火。探針最好用放射性同位素或熒光報道分子作標記。
D．THP的表達在鑒定出抗凍蛋白基因的編碼區后，使抗凍蛋白基因的編碼區與啟動子(組成型或誘導型)相連，將構建物插入表達載體中，將載體引入合適的宿主細胞中，就可使天然或合成的編碼抗凍蛋白的核酸表達。典型的載體含有用來調節特定的核酸表達的轉錄和翻譯終止子、轉錄和翻譯的起始序列以及啟動子。載體任選地包含基因表達盒，該盒含有至少一個獨立的終止子序列以及適于真核生物和原核生物的選擇標記，該序列允許盒在真核生物或原核生物或兩者(如穿梭載體)中進行復制。載體適于在原核生物或真核生物中復制和整合，或最好在兩者中均能進行復制和整合。參見Giliman和Smith,Gene 8:81(1979)；Roberts，等，Nature328:731(1987)；Berger和Kimmel,GUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES,METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol 152,Academic Press,Inc.,SanDiego,CA(“Berger”)；Schneider,B.,等，Protein Expr.Purif.6435:10(1995)；Sambrook和Ausubel。生物試劑和實驗設備的生產商提供的產品信息也為已知的生物方法提供了有用的信息。這些生產商包括SIGMA chemical company(SaintLouis,MO),R&D systems(Minneapolis,MN),Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)，和AppliedBiosystems(Foster City,CA)，以及許多其它技術人員所知的商業來源。
用于本發明方法的核酸(如啟動子和載體)可從天然來源分離獲得，從ATCC或GenBank庫獲得，或用合成方法制得。合成的核酸可用各種液相或固相方法制得。用亞磷酸三酯、磷酸三酯和H-膦酸酯化學物質固相合成核酸的程序的詳細描述可從許多文獻獲得。例如參見Itakura,美國專利No.4,401,796；Carruthers,等，U.S.Pat.Nos.4,458,066和4,500,707；Beaucage和Carruthers；Matteucci；Carruthers,等，Genetic Engineering 4:1-17(1982)；Jones,chapter 2,Atkinson，等，第3章，和Sproat，等，第4章，in OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS:A PRACTICALAPPROACH,Gait(ed.),IRL Press,Washington D.C.(1984)；Froehler，等，Tetrahedron Lett.27:469-472(1986)；Froehler，等，Nucleic Acids Res.14:5399-5407(1986)；Sinha，等，Tetrahedron Lett.24:5843-5846(1983)；以及Sinha，等，Nucl.Acids Res.12:4539-4557(1984)，這些內容均結合入本文作為參考。
有幾種熟知的方法可將核酸引入細菌細胞中，其中任何一種可用于本發明(參見Sambrook)。這些方法可以包括使受體細胞與含有DNA、DEAE葡聚糖的細菌原生質體融合，用病毒載體感染等。
核酸體外輸送入細菌宿主，可以是輸送入在培養物中生長的任何細胞中。細胞和基因工程化的核酸構建物在體外進行接觸時，接觸可在生物相容的基質中進行。核酸的濃度可根據特定應用在很大范圍內變化，但通常在約1μM-10mM間。細胞用核酸處理通常在生理溫度(約37℃)下進行約1-48小時(以約2-4小時為佳)。
可用來表達外源核酸的細菌菌株包括大腸桿菌、堅忍鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱鏈球菌、嗜檸檬酸明串球菌、腸系膜樣明串球菌、嗜酸乳酸桿菌、乳酸乳桿菌、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacteriu breve以及Bifidobacterium longum。
除了細菌表達體系外，本發明的THP還可以在其它體系中，尤其是酵母和桿狀病毒中表達，而且還可在哺乳動物和植物細胞中表達。體系的采用將取決于在其它體系中是否能夠成功表達、使THP適當折疊的能力以及THP的最終用途。例如，如果用THP來防止面包酵母(bread dough yeast)結凍(參見美國專利No.5,118,792)，可采用酵母體系。如果希望使植物在冰點溫度下存活，可用轉基因技術來形成轉基因植物。然而，當然采用的體系應使THP有與在樅色卷蛾屬幼蟲中發現的相當的熱滯后活性。
可用來表達外源核酸的酵母菌株包括Torulopsis holmil、Saccharomycesfragilis、釀酒酵母菌、Saccharomyces lactis、以及Candida pseudotropicalis。
表達體系的另一個實例可參見國際出版物WO96/11586(美國專利申請08/321,991,1994年10月12日提交)，該文內容結合入本文作參考，它描述了用魚AFP(THP)轉化的Lactobacillus bulgaricus和Streptococus thermophilus來分泌AFP，以防止發酵的冷凍食品(尤其是冷凍酸乳)放置在無霜冷凍機中時由于凍融而形成冰晶。
1．重組載體的制備為了采用上述方法中的分離的序列，制備適于細胞轉化的重組DNA載體。轉化入各種動物和植物細胞中的方法是眾所周知的，這些方法在技術和科學文獻中均有描述。例如參見Weising等,Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)關于植物細胞部分和Sambrook關于動物和細菌細胞部分。
編碼所需的抗凍蛋白的DNA序列(例如編碼全長THP的cDNA序列)最好與轉錄和翻譯起始調控序列組合，該調控序列可指導此基因序列在細胞內或轉基因高級生物的預定組織中轉錄。選用來表達本發明THP的載體中也可包括各種熟知的轉錄調控元件(如啟動子和增強子)。指導本發明THP處于其天然狀態的啟動子可通過分析與本文所述抗凍蛋白基因相對應的基因組克隆的5′序列來鑒定。啟動子序列的序列特征可用來鑒定啟動子。已經對控制真核生物基因表達的序列進行了深入得研究。例如，啟動子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，該共有序列通常是轉錄起始位點上游的20-30個堿基對。在大多數情況下，要準確地引發轉錄就需要有TATA盒。
在構建本發明的重組表達盒時，可采用與本發明THP相關或異源的啟動子片段，該片段可使基因在轉基因生物所有組織中表達。在本文中，這些啟動子稱為“組成型”啟動子，它們在大多數環境條件下以及發育或細胞分化狀態下具有活性。植物的組成型啟動子實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉錄起始區、衍生自根癌膿桿菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1′或2′啟動子、煙草花葉病毒的啟動子和本領域技術人員已知的各種植物基因的轉錄起始區。
或者，啟動子可在特異性組織中使本發明的多核苷酸表達(組織特異性啟動子)或可以使其在更精確的環境控制條件下表達(誘導型啟動子)。在發育控制條件下的組織特異性植物啟動子實例包括只引發某些組織(如果實、種子或花)中的轉錄。來自西紅柿的組織特異性E8啟動子特別適用于指導基因表達，使所需的基因產物位于果實中。其它合適的啟動子包括那些編碼胚胎儲藏蛋白的基因。可影響誘導型啟動子轉錄的環境條件例子，包括厭氧條件、高溫或有光存在。
如果需要表達合適的多肽，編碼區3′端的聚腺苷酸化區應被包括在內。聚腺苷酸化區可以從天然的基因、各類或其它植物基因或從T-DNA衍生獲得。
含有本發明基因序列(如啟動子或編碼區)的載體通常包括一個賦予轉化細胞可選擇性表型的標記基因。例如，標記物可編碼出對抗生素，尤其是卡那霉素、G418、博來霉素和潮霉素的抗性。
植物可用病毒載體(例如煙草花葉病毒)轉化，以表達本發明的THP蛋白。選擇和構建載體以及轉化入各類植物細胞的方法是眾所周知的，例如參見Hamamoto等，美國專利5,618,699。
2．轉基因生物的制備本發明的DNA構建物可用各種常規方法引入宿主生物的基因組中。例如，在植物中，用植物細胞原生質體電穿孔和微注射方法可以將DNA構建物直接引入植物細胞的基因組DNA中，或者，用彈道方法(如DNA顆粒轟擊方法)可將DNA構建物直接引入植物組織中。如上所述，可用含有本發明的THP序列的植物病毒載體(如煙草花葉病毒)可接種入植物。或者，DNA構建物可與合適的T-DNA側翼區結合，然后引入常規的根癌膿桿菌宿主載體中。當植物細胞被細菌感染時，根癌膿桿菌宿主的侵入功能會將構建物及其毗鄰的標記物插入植物細胞DNA中。
根癌膿桿菌介導轉化的方法(包括去臂和二載體(binary vector)的采用)在科學文獻中已有描述。例如參見Horsch,等，Science 233:496(1984)，以及Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。
用上述任一轉化方法獲得的轉化植物細胞可培育再生成有轉化基因型和所需表型(例如增強的耐凍性)的整個植物。本發明的轉化的植物也可用作“活工廠”來大量表達抗凍蛋白。這種植物再生方法需要對組織培養生長培養基中的某些植物激素進行控制，通常需要將抗生計和/或除草劑標記和所需的核苷酸序列一起引入。從培育的原生質體中再生植物的方法在Evans等，PROTOPLASTSISOLATION AND CULTURE,HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURE,pp.124-176,Macmillian Publishing Company,New York,1983；以及Binding,REGENERATION OF PLANTS,PLANT PROTOPLASTS,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985中有所描述。也可從植物愈傷組織如外值體、器官或其部分獲得再生。這些再生方法在Klee等，Ann.Rev.of Plant Phys.38:467(1987)中有大致描述。
制備轉基因植物或動物例如咸水魚的微注射方法是本領域中已知的，并在科技和專利文獻中有詳細地描述。用聚乙二醇沉淀將DNA構建物導入細胞的方法在Paszkowski等，EMBO J.3:2717(1984)中有所描述。電穿孔方法在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)中有所描述。彈道轉化方法在Klein等，Nature 327:70(1987)中有所描述。
Ⅲ．本發明THP種類的檢測和特性通過采用下述測定方法，本發明的THP具有從東樅色卷蛾和西樅色卷蛾第二齡期幼蟲血淋巴分離獲得的熱滯后蛋白的特性。用這些測定方法可檢測其它新的THP是否與這些原型蛋白足夠相關而包括在本發明范圍內。這些測定方法也可用來檢測和測定細菌肉湯、組織培養液和植物及動物組織中存在的THP蛋白質的量。
A．THP的檢測表達的THP可用各種方法來檢測或定量。較佳的方法包括功能活性測定法和采用特異性抗體的免疫測定法。
1．抗體產生單克隆和多克隆抗體的方法是本領域已知的。參見例如Coligan,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY(1991)；Stites等編輯。BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第7版)，Lange Medical Publications,Los Altos,CA和本文引用的參考文獻(“Stites”)；Goding,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press,New York.NY(1986)；Kohler和Milstein,Nature 256:485(1975)；和Harlow和Lane。此類技術包括通過從噬菌體之類載體重組抗體文庫中挑選抗體來制備抗體。參見，Huse等，Science 246:1275(1889)(“Huse”)；和Ward等，Nature 341:544(1989)。
要制備用于(例如)免疫親和純化的大量抗體，可能要使用大量免疫原。本文所述來自樅色卷蛾屬或來自轉化細胞的抗凍蛋白是生產單克隆抗體或多克隆抗體的優選免疫原。也可以使用純或不純形式的來自其它微生物的天然抗凍蛋白。利用本文所述抗凍蛋白序列片段制造的合成肽也可以用作生產所述蛋白質的抗體的免疫原。這些肽可以單獨使用，也可以與其它組份結合后使用。
生產多克隆抗體的方法對本領域技術人員來說是已知的。簡而言之，如前文所述，將免疫原與佐劑混合，然后免疫動物。動物對免疫原制劑的免疫應答反應通過測試血樣和對免疫原反應的效價來監測。如果獲得了適當高效價的抗免疫原的抗體，就收集動物的血液并制備抗血清。根據需要，可以進一步分離血清以富集對蛋白質具有反應性的抗體。(參見Harlow和Lane，同上)。
用于免疫親和純化或免疫試驗的大量單克隆抗體可以通過各種本領域眾所周知的技術獲得。簡而言之，以所需抗凍蛋白免疫動物，取其脾細胞通常與骨髓瘤細胞融合而無限繁殖化(參見Koler和Milstein,Eur.J.Immnolo.6:511(1976)，本文參考了其中內容)。無限繁殖化的其它方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或逆轉錄病毒轉化，或其它本領域的已知方法。篩選出產生具有所需特異性和對THP親和性的抗體的無限繁殖化的單細胞形成的克隆。可以利用各種技術來提高由此類細胞生產單克隆抗體的得率，其中包括對脊椎動物宿主進行腹膜腔內注射。或者，可以根據Huse中的總大綱所述，通過篩選人B細胞DNA文庫來分離編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列。
THP的濃度可以利用多種免疫試驗方法來測定。若要總覽免疫學和免疫試驗的方法，可參見Stites。而且，本發明的試驗過程可以數種構型中的任何一種進行，ENZYME IMMUNOASSAY,E.T.Maggio編輯，CRC Press,Boca Raton,Florida(1980)中對此有充分論述；對Tijssen；和Harlow和Lane，本文進行了參考。
例如，為了生產用于抗凍蛋白免疫試驗的抗血清，如本文所述生產并分離重組的樅色卷蛾抗凍蛋白或其免疫原性片段。用SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3多肽、或其同種型或它們的免疫原性片段，免疫近交品系的小鼠或家兔，使用Freund氏佐劑之類的標準佐劑，并使用標準免疫程序。或者，可以將衍生自本文所述序列的合成肽與載體蛋白質交聯用作免疫原。收集多克隆抗血清，并在免疫試驗中滴定抗THP的效價，例如將THP固定在固相載體上的固相免疫試驗。選出效價為104或更高的多克隆抗血清，利用競爭結合免疫試驗測試它們對其它微生物的同源蛋白和/或非抗凍蛋白的交叉反應性。特異性的單克隆和多克隆抗體及抗血清的結合力效價KD一般至少約為0.1mM，更多情況至少約1μM，較好的是至少約0.1μM或更小，最好至少約0.01μM或更小。
2．免疫結合測試在優選實施方案之一中，可用任何一種已被充分認可的免疫效價結合測試檢測和/或定量測定THP(參見例如美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。有關一般免疫試驗的論述，還可參見METHOD IN CELL BIOLOGY第37卷:Antibodies in Cell biology,Asai編輯，Academic Press,Inc.,NewYork(1993)；和Stites。免疫結合測試(或免疫試驗)通常使用一種“捕捉劑”來特異性結合分析物并將其固定化(以THP或其片段為例)。捕捉劑是一種特異性結合分析物的物質。在優選實施方案之一中，捕捉劑是特異性結合THP的抗體。此抗體(抗-THP)可以利用本領域技術人員熟知的任何一種方法以及前文所述的方法來生產。
免疫試驗還經常使用標記試劑來特異性結合由捕捉劑和分析物構成的復合物，將它們標記。標記試劑本身可以是包含抗體/分析物復合物的一個部分。這樣，標記試劑可以是經標記的THP多肽或經標記的抗THP抗體。或者，標記試劑可能是第三種物質，例如特異性結合抗體/THP復合物的另一種抗體。
在優選實施方案之一中，標記試劑是帶有標記的第二THP抗體。或者，第二THP抗體可以沒有標記，但它又被經標記的第三抗體結合，該第三抗體對衍生出第二抗體的原抗體具有特異性。可以用生物素之類的可測物質修飾第二抗體，生物素修飾的第二抗體可被酶標記的鏈霉親和素之類第三標記分子特異性地結合。
能夠特異性結合免疫球蛋白恒定區的其它蛋白質，例如蛋白A或蛋白G也可以用作標記試劑。這類蛋白質是葡萄球菌和鏈球菌細胞壁的正常組份。它們表現出很強的與多種動物免疫球蛋白恒定區的非免疫原性反應性(參見，Kronval等，J.Immunol.111:1401-1406(1973)，和Akerstrom,等，J.Immunol.135:2589-2541(1985))。
在試驗全過程中，在每一次反應試劑混合后可能都需要進行孵育和/或洗滌。孵育時間可能約5秒至數小時不等，以約5分鐘至約24小時為佳。但是，孵育時間取決于孵育方式、分析物、溶液體積、濃度等。通常，試驗在環境溫度下進行，雖然它們可以在例如10℃至40℃的溫度范圍內進行。
a．非競爭性試驗方式檢測THP的免疫試驗可以是競爭性的或非競爭性的。非競爭性試驗即直接測定被捕獲的分析物(以THP為例)的試驗。例如，在優選的“夾心”試驗中，捕捉劑(抗THP抗體)可以直接與固相基質結合而固定在上面。這些固定化的抗體然后捕捉測試樣品中的蛋白質。由此被固定的THP然后被標記試劑(例如帶有標記的第二THP抗體)結合。或者，第二THP抗體沒有標記，但它又被經標記的第三抗體結合，該第三抗體對產生第二抗體的動物具有特異性。可以用生物素之類的可測物質修飾第二抗體，而生物素則被酶標記的鏈霉親和素之類第三經標記分子特異性地結合。
b．競爭性試驗方式在競爭性試驗方式中，樣品中分析物(THP)的量是間接測定的，即測定加入的(外源)分析物(THP)被樣品中的分析物從捕捉劑(抗THP抗體)上取代掉(或被排擠掉)的量。在一競爭性試驗中，在樣品中加入已知量的分析物例如THP，然后此樣品與捕捉劑(此處即特異性結合THP的抗體)接觸。與固定化抗體結合的THP的量與樣品中THP的量成反比。
在一特別優選的實施方案中，抗體被固定在固相基質上。與抗體結合的THP量可以通過測定THP/抗體復合物中的THP量來測定，或者通過測定未被復合的THP量來測定。可以通過使用標記過的THP分子來測定THP量。
半抗原抑制試驗是另一種較好的競爭性試驗。其中，已知量的分析物(此處即THP)被固定在固相基質上。在樣品中加入已知量的抗THP抗體，然后，樣品與固定的THP接觸。此時，與固定THP結合的抗THP抗體量與樣品中的THP量成反比。同樣，被固定的抗體的量可以通過測定抗體被固定的分數或留在溶液中抗體的分數來測定。如果抗體被標記，可以直接檢測，或如前文所述，通過再加入特異性結合抗體的被標記物質來間接檢測。
競爭性結合方式的免疫試驗可以用于交叉反應性測定，技術人員因而能夠確定一種新的THP是否與屬于本發明權利要求范圍內的THP充分相關。例如，可以將SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的THP固定在固相基質上。在試驗中加入蛋白，該蛋白與抗血清競爭與固定抗原的結合。蛋白同抗血清競爭與固定THP結合的能力，與包被固相載體所用THP的結合能力相比較，利用標準計算法計算出上述蛋白質的交叉反應性百分比。挑選并匯集與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的THP的交叉反應性低于10％的抗血清，可以利用上述蛋白進行免疫吸附從匯集的抗血清中去除交叉反應性抗體。
經免疫吸附和匯集后的抗血清可以用于上述競爭性免疫試驗來分析第二蛋白是否是本發明的抗凍蛋白。在競爭性免疫試驗中，用于產生抗血清的蛋白質或免疫原在抗體結合反應中與第二、未鑒定蛋白或肽競爭。兩種蛋白質都在一較寬濃度范圍內接受測試，并測定抑制50％抗血清與固定蛋白結合所需的各蛋白的量。如果第二種蛋白的所需量比已鑒定的免疫原(例如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的THP)的所需量低10倍以上，就認為該第二種蛋白與所產生的針對已鑒定免疫原(抗凍蛋白)的抗體有特異性結合。
c．其它試驗方式Westen印跡(免疫印跡)分析可以用來檢測和定量樣品中的抗凍蛋白。該技術一般包括用凝膠電泳按分子量分離樣品蛋白，將分離后的蛋白轉移到合適的固相載體上(例如硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜或尼龍類濾膜)，將樣品與特異性結合THP的抗體孵育。抗抗凍蛋白抗體特異性結合固定在固體載體上的THP。可以直接標記這些抗體，或者繼而用特異性結合抗抗凍蛋白的標記抗體(例如標記的綿羊抗鼠抗體)檢測。
除了利用核酸探針來鑒定本申請權利要求的蛋白質的新類型之外，還可以使用抗體探測表達文庫。這是一種已知技術。(參見Young & Davis，美國科學院院報80:1194(1982))。簡而言之，可以利用市售試劑盒或利用可方便得到的成份來制備cDNA表達文庫。優選噬菌體載體，但是還有許多用于蛋白質表達的其它載體。這類載體包括但不限于酵母、動物細胞和蟾屬卵母細胞。從用目標蛋白富集的原料中挑選mRNA，產生cDNA，連接到載體中，再轉化到用于免疫篩選的文庫宿主細胞中。篩選包括結合，和顯現與細胞上或固定在固相載體(例如硝酸纖維素或尼龍薄膜)上的特定蛋白結合的抗體。選出陽性克隆，純化至均一，然后制備分離的cDNA，并在所希望的宿主細胞內表達。對該技術較好的論述可參見METHODSOF CELL BIOLOGY，第37卷，題為Antibody in Cell biology,Assai編輯，1993。
如果產生的抗體是針對一段短肽的，可將被測蛋白(未鑒定的)變性來充分測定抗體的選擇性結合性能，而且，可能最好測定抗體對與被測蛋白大小相似的蛋白的選擇性結合能力，例如測試抗體對全長THP與原型全長THP的選擇性結合能力，即使抗血清是針對原型THP片段產生的。這就簡化了測試，并且在確定競爭性免疫試驗結果時無需考慮構象問題和分子量/摩爾濃度。
其它試驗方式包括脂質體免疫試驗(LIA)，該試驗使用的脂質體設計成能結合特定分子(例如抗體)，并能釋放出包裹的反應劑或標記物。然后根據標準技術檢測釋放出的化學物質。(參見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.5:34(1986))。
B．THP的純化可以利用標準技術將來自例如幼蟲勻漿、組織培養基、轉基因植物和動物、酵母和細菌等多種來源的本發明多肽純化至基本純。標準純化程序包括利用硫酸銨之類物質選擇性沉淀；柱色譜，免疫純化及其它方法可參見例如R.Scopes,PROTEN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,Springer-Verlag:NewYork(1982),U.S.專利4,673,641,Ausubel和Sambrook，本文參考了以上全部內容。
1．從細菌培養物中純化THP如果是分泌蛋白質，無需借助于以下所述的細胞裂解就可以從培養有細菌的肉湯培養液中分離和純化所要的蛋白質。
2．從細菌周質中純化THP據估計，大腸桿菌的抗凍蛋白表達水平較低，而且，該蛋白被分泌在細菌的周質中。除了其它本領域已知方法之外，還可以利用低溫滲透休克法來分離細菌周質組份。(參見Ausubel和Trayer,H.R.和Buckley,Ⅲ,C.E.,J.Biol.Chem.245(18):4842(1970))。
為了從周質中分離蛋白質，離心細菌細胞生成沉淀。將沉淀重懸在含有20％蔗糖的緩沖液中。為了裂解細胞，離心細菌，并將沉淀重懸在冰冷的5mM MgSO4中，并在冰浴中保持約10分鐘。離心細胞懸浮液，傾出上清液進行保存。可以利用本領域眾所周知的標準分離技術將上清液中的蛋白質與宿主細胞蛋白質分離。
3．包涵體的分離當轉化細菌大量表達重組蛋白質時，(一般是在啟動子誘導之后，但表達可能是組成型的)，蛋白質可能形成不溶性凝集體。
凝集蛋白(后文稱為包涵體)的純化涉及通過破壞細胞(通常但不限于將細胞培養在含約100-150μg/mL溶菌酶和非離子除垢劑NONIDET P40的緩沖液中)來提取、分離和/或純化包涵體。可以用Polytron粉碎機(Brinkman Instruments,Westbury,N.Y.)粉碎細胞懸浮液。或者，可以對細胞進行冰上超聲波處理。Ausubel和Sambrook還說明了其它裂解細胞的方法，這些對本領域技術人員來說是顯而易見的。
離心細胞懸浮液，將含有包涵體的沉淀重懸在緩沖液(例如20mMTris-HCl(pH7.2),1mM EDTA,150mM NaCl和2％非離子除垢劑TRITON-X 100)中。可能需要反復洗滌以盡可能去除細胞碎片。將留下的包涵體沉淀重懸在合適的緩沖液中(例如20mM磷酸鈉，pH6.8,150mM NaCl)。其它合適的緩沖液是本領域技術人員熟知的。
洗滌之后，通過加入既是強氫受體又是強氫供體的溶劑(或分別具有兩種特性之一的溶劑的混合物)來溶解包涵體，同時加入DTT之類的還原劑。然后可以通過用相容性緩沖液稀釋或透析來復性形成包涵體的蛋白質。合適的溶劑包括但不限于尿素(約4M至約8M)，甲酰胺(至少約80％(v/v))和鹽酸胍(約4M至約8M)。有些能夠溶解形成凝集體的蛋白質的溶劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)，70％的甲酸是不適用于該過程的，因為可能導致蛋白質的不可逆變性，伴有免疫原性和/或活性的喪失。雖然鹽酸胍之類試劑是變性劑，但這種變性不是不可逆的，在去除(例如通過透析)或稀釋變性劑后，即可發生復性，重新形成免疫活性和/或生物活性的蛋白質。
溶解后，可以利用標準分離技術將所需蛋白質與其它細菌蛋白質分離。
4．標準蛋白質分離技術a．溶解度分級分離經常作為最初步驟，而且如果蛋白質混合物較復雜時，初步的鹽分級分離可以從所需重組蛋白中分離掉許多不需要的宿主細胞蛋白質(或來自細胞培養基的蛋白質)。優選鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效去除蛋白質混合物的含水量來沉淀蛋白質。然后，蛋白質根據它們的溶解度沉淀。蛋白質越疏水，越可能在較低的硫酸銨濃度沉淀。典型的方案是在蛋白質溶液中加入飽和硫酸銨溶液，使得硫酸銨的終濃度介于20-30％。這將沉淀出疏水性最強的蛋白質。棄去沉淀(除非所需蛋白是疏水性的)，在上清液中加入硫酸銨，至已知可沉淀所需蛋白的濃度。然后將沉淀溶解在緩沖液中，根據需要利用透析或滲濾去除過量的鹽。其它依賴于蛋白質溶解度的方法，例如低溫乙醇沉淀法，是本領域眾所周知的，并可以用于分級分離復雜的蛋白質混合物。
b．分子大小差異過濾如果所需蛋白質的分子大小是已知的，或者可從其cDNA序列估計，可用不同孔徑的膜(例如Amicon或Millipore薄膜)超濾去除過大和過小的蛋白質。作為第一步，蛋白質混合物透過孔徑的分子量截留值低于所需蛋白分子量的膜進行超濾。然后用分子量截留值大于所需蛋白分子量的膜超濾滯留物。重組蛋白將透過濾膜進入濾液。然后可以如下色譜分離濾液。
c．柱色譜可以根據分子大小、表面凈電荷、疏水性和與配體的親和性分離蛋白質。此外，產生的抗蛋白質抗體可以與色譜柱基質交聯來免疫純化蛋白質。所有這些方法都是本領域熟知的。參見Scope,R.K.,Protein Purification:Principles and Practice第2版，Springer Verlag(1987)。
對技術人員來說顯而易見的是，可以進行各種規模的色譜技術，而是使用各種不同生產商的設備(例如Pharmacia Biotech)。
在一優選實施方案中，從大腸桿菌上清液中純化抗凍蛋白是通過凝膠過濾進行的，而蛋白質濃度測定方法是根據Bradford,Anal.Biochem.72:248-257(1976)。
d．氨基酸序列本發明THP的氨基酸序列可以通過Edman降解，一種本領域眾所周知的技術來測定。
除了內部測序之外，N末端測序可利用本領域的已知技術進行。
e．分子量/等電點蛋白質的分子量可利用本領域眾所周知的多種方法來測定。其中包括SDS凝膠電泳、非變性凝膠電泳、分子量排阻色譜、區帶離心、質譜法和根據測序結果計算。由于各技術本身的原因，不同技術所得結果之間會有差異。例如，非變性凝膠電泳、分子量排阻色譜和區帶離心是根據蛋白質的大小。本發明蛋白質富含半胱氨酸，估計可能形成大量胞間和胞內的二硫鍵。SDS凝膠電泳依賴于SDS與蛋白質中氨基酸的結合。有些氨基酸與SDS的結合比其它的強，所以，蛋白質會因其氨基酸組成的不同而發生差異性遷移。質譜法和根據序列計算分子量是利用蛋白質中的氨基酸的出現頻率，然后將該頻率乘以氨基酸的分子量。如果蛋白質被糖基化，質譜法會反映出這一點，而不能計算得到該分子量。
在本發明中，THP同種型的表觀分子量經分子量排阻色譜分析估計約為5kD至20kD；利用SDS凝膠電泳測定，約為6kD至14kD。這與根據氨基酸序列算得的分子量一致。但是，本發明范圍內的各種THP或同種型不局限于上述分子量范圍。
蛋白質等電點的測定可以利用非變性(或圓盤)電泳、等電聚焦，或者更好的是，以蛋白質的氨基酸含量來計算。本發明兩種THP同種型的等電點(Ip)經計算約為6至9。但是，本發明范圍內的各種THP或同種型不局限于上述等電點范圍。
f．功能試驗本發明各種THP和同種型可以通過至少兩種功能特性，例如熱滯后和獨特的冰晶形成，進行鑒定和特征描述(1)熱滯后在熱滯后試驗中本發明THP蛋白比已知的魚類(AFP)抗凍蛋白活性高約10至50倍。熱滯后的定義為溶液冰點和熔點之間的溫度差。冰點即發生不可控晶體或針狀冰晶生長的溫度。熔點即保持冰晶穩定但不融化的最高溫度。TH活性可以利用本領域眾所周知的技術(例如，參見Ghakrabartty & Hew,Eur.J.Biochem.202:1057(1991))以納升滲透壓力計(Clifion Technical Physics,Martford,NY)測定。起始冰晶的直徑通常約20至50微米。所用的緩沖液典型的是100mMNH4HCO3(pH7.9)，但是滲透壓相近的其它緩沖液也可使用。或者，可以測定細菌肉湯培養液、組織培養液、或血淋巴中的TH活性。但是，所得的TH活性值將取決于被測溶液的滲透壓。
滲透壓力計是一套熱電冷卻組件(module)，具有分開但相聯的可變溫度控制。該儀器允許在0℃至-9℃范圍內作溫度調節，具有低至-40℃的深冷模式。可將冷卻組件安裝在顯微鏡的平臺上，可以直接觀察冰晶的生長和熔解方式。樣品容器可以是一7mm×7mm×0.75的小板，具有許多小的樣品孔(直徑約0.35mm)。可以在樣品孔下部加一滴Cargille氏B浸漬油之類的浸漬油，將樣品孔填滿。然后用毛細管將1至5nL樣品注入被油填滿的孔的中心。
為了測定TH活性，先冷凍樣使其快速降溫至-40℃，然后溫熱至熔解溫度。一旦達到熔點，以每10至15秒約0.02℃(10毫滲克分子(mosmole))的速度冷卻樣品，直至到達冰點溫度。“滲克分子”向“℃”的轉換是1.00滲克分子等于1.86℃。在多數情況下，當達到THP樣品的冰點時，樣品內的冰晶會自發而且迅速生長。這使得整個樣品凍結。
或者，可能在溶液的表面凍結少量冰晶，而溶液的溫度立即降至冰點以下。成核冰晶開始生長的冰點以下的溫度即冰點降低或熱滯后量度(參見，Patterson& Duman,J.Exp.Zool.210:361(1979)；和Wu等，J.Comp.Physiol.B161:271(1991))。溶液的熱滯后活性取決于抗凍蛋白的濃度，抗凍蛋白的濃度越高，溶液表現出的活性越高。但是，提高THP濃度只略微提高TH活性，而且具有極限最大值。換言之，THP與TH之間的關系是雙曲線型的，而非線性的。
本發明蛋白質宜在1mg/mL時具有約1.5℃的熱滯后值，1mg/mL時高于約2℃更好，達1.5℃至3.0℃之間則最好。
(2)獨特的冰晶形成除比已知魚抗凍蛋白活性高約10至50倍之外，本發明蛋白可產生不同形狀的冰晶。在顯微分析下，魚抗凍蛋白形成的冰晶為六方雙錐體，具有界面清晰的多個小平面。相比之下，本發明THP形成圓形晶體，沒有明顯的界面。Ⅳ．抗凍蛋白及相關基因的用途THP蛋白或其編碼基因可以多種方式用來抑制冰晶的生長。關于抗凍蛋白的全面論述可參見美國專利5,118,792。本發明的THP可以蛋白質的形式加入，或者以基因形式引入，以一定的水平作內源性表達，在細胞內，在適合生產蛋白質的強啟動子調控下，表達抗凍蛋白達到一定的水平。合適的THP濃度根據用途而不同，但一般在約每十億一份至約每一千一份的范圍內(即1微克/升至1克/升)。
在本發明實施方案之一中，該蛋白被引入食物。這包括許多方面。其一是引入植物性食物，或者是引入整個植株，提供某種程度對冰點以下氣候條件造成的損害的總體抵抗能力，或者引入植物的某部分，例如果實或蔬菜，盡可能減小冷凍對這些特定植物器官造成的特殊傷害。植物部分例如莖、根、葉、花、柄、果皮、種子、營養組織、維管等。
冷凍蔬菜例如芹菜、馬鈴薯、蘆筍、豌豆、胡蘿卜、菜豆、椰菜、甜玉米和菠菜等的質地、口味和保質期將得以改善。草莓、藍酶、懸鉤子、柑橘類水果、香蕉、葡萄、獼猴桃、梨、菠蘿、李子、櫻桃、西紅柿和芒果等水果的質地、口味和保質期將得以改進。
這樣引入植株或其它產品，最方便的是將合適的核酸遺傳性引入目標生物來實現。在食品加工開始之前或在收獲和開始加工食品之后，組成型或誘導性的核酸表達將產生足夠高水平的多肽，可有效地保護食物，例如，產生高達總植物蛋白質量的0.5％的多肽，高達約0.1％則更好。表達也可以是組織特異性的。例如，中將其與水果成熟基因連鎖，可能導致生產植株甚至在采摘后也會表達。
該多肽還可以加入欲冷凍的食品中。許多冷凍食品希望在冷凍狀態下食用，例如冰淇淋、凍酸奶、冰牛奶、冰糕、冰棒、冷凍鮮奶油、冷凍奶油餡餅、冷凍布丁等。特別是，在多數家用無霜冰箱的凍融循環中或長期以冷凍狀態保存，大冰晶的形成會破壞質地和口味。通過加入抗凍多肽，可以完全避免，或者盡可能減小這種冰晶生長過程。純化的抗凍蛋白可以加入整個食物中，也可以用于被認為最易發生縮水和結晶的表面。
在另一實施方案中，編碼本發明THP的基因被用于轉化加入食物的微生物，保護食物或微生物不被凍結。例如，嗜熱性鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌可以加在乳制品中，以冷凍酸奶出售。除發酵乳制品生產酸奶之外，由細菌表達的THP將保護產品免受家用冰箱凍融循環的破壞，并產生更可口的產品。
另一種用途是用編碼THP的核酸轉化面團發酵酵母。將該基因引入酵母并表達后，并將這些酵母用于冷凍面團中時，面團會在解凍時自然發酵，因為在解凍過程中，酵母將保持高活性。由于因冷凍保存所累積的損害較少，而且解凍后樣品保留了高活性，或可延長保存時間，或可將需要保存的東西分成更小的等份。
除了食品冷藏之外，還有許多實施方案。其一是利用THP保護植物免受氣候性冰凍情況的傷害。THP可以通過引入基因的表達來內部摻入細胞質中，也可以從外部將該蛋白用于植物。外部使用可以直接將該蛋白用于植物，或者將分泌該蛋白的微生物沉積在植物外部。這些不同的引入方法也可以用于其它用途。
除植物之外，可以看出，本發明的THP可以用來生產可耐受零℃以下溫度的轉基因魚。雖然有些南北極魚類的確合成抗凍蛋白，但是大多數魚類不生活在水溫低于0℃的環境中。但是，含有THP外源核酸的轉基因魚可以保持在低于零點的咸水中，而且可能會生長。具體地說，即在養殖場中培養咸水魚類，特別是鮭魚。
除以上實施方案之外，可以看出，本發明THP可以用來調節耐寒生物的內源性THP基因的表達。為制備(例如以后的分離)內源抗凍蛋白，應提高抗凍蛋白基因產物的表達。相反，負調節內源性抗凍蛋白基因的表達，可以將本來耐寒的害蟲轉化侵害性較低的表型。
改變內源基因表達的方法是本領域眾所周知的。典型的是，此類方法涉及改變或替換全部或部分調控序列，所述調控序列調控特定基因的表達。在一優選實施方案中，一個或數個THP上游的調控序列(例如天然啟動子)被改變。
這通常是通過同源重組將異源核酸引入天然調控序列內。要負調節一個或多個THP基因產物的表達，宜進行簡單突變來改變讀碼框或破壞啟動子。要正調節THP基因產物的表達，可用能夠誘導高于正常轉錄水平的異源啟動子替代天然啟動子。
在一特別優選的實施方案中，用含有所述結構基因或上游序列的核酸序列來尋找異源重組結構。使用SEQ IN NO:1中提供的結構基因序列信息，本領域技術人員僅用常規實驗即可構建出同源重組結構。
美國專利5,272,071,WO91/09955,WO93/09222,WO96/29411,WO95/31560,WO91/12650詳細說明了同源重組作用改變內源基因表達的用途。Azad等，美國科學院院報93:4787(1996)；Baulard等，J.Bacteriol.178:3091(1996)和Pelicic等，Mol.Microbiol.20:919(1996)中說明了分枝桿菌內的同源重組。Moynahan等在Hum.Mol.Genet.5(7):875(1996)中說明了動物的同源重組，Offringa等，EMBO.J.9(10):3077(1990)說明了植物的同源重組。
另一實施方案是將抗凍蛋白引入器官、組織或其它生物樣品周圍的水性液體中。具體用途之一是在去醫院進行移植手術的運輸途中，或用于保存這些材料。抗凍蛋白將允許這些材料在冰點以下短期或長期保存，因此盡可能減低了這些材料的天然代謝或變質，但是基本消除了冰晶生長造成的細胞傷害。其它醫藥上重要的溫度敏感性生物樣品是血液和血制品，藥物、蛋白質類藥、生物測試試劑和疫苗。
另一種實施方案是將抗凍蛋白引入需要冷凍保存的細胞或其提取物。例如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞，尤其是動物細胞，它們含有THP后提高了細胞或組織的活性，盡可能減少或避免因凍融過程而致的天然特性的損失。亞細胞樣品或細胞提取物可能對冷凍具有類似的敏感性，尤其是長期保存的話。典型的例子是，體外蛋白質翻譯系統、酶制劑和含有敏感性膜組份的樣品(例如葉綠體和線粒體膜制劑)。尤其是，加入這些抗凍蛋白后，含細胞器的樣品會表現出提高的抗冷凍損傷能力。在本發明多肽存在下，動物軟組織將表現出較輕的凍傷，而且，在經凍融后細胞完整性很重要或必須的情況下，例如細胞或組織的保藏，可加入該多肽。所以，要求冷凍保存的樣品，例如細胞或組織保藏物，最好常規性添加這些抗凍蛋白。經常要保藏的細胞類型中包括細菌的遺傳變種、真菌(包括酵母)，特別是高級真核細胞(例如雜交瘤細胞株或組織培養細胞系)。
本發明還包括基于THP與本領域眾所周知的穩定劑和其它添加劑的混合物的組合物和用途。這些化合物可以用來抑制變質、抑制氧化、防止褪色、抑制微生物的生長、穩定乳液等。
本發明還包括基于THP的適合在非有機系統中降低冰點或抗凍的組合物，例如用于除冰處理。
應該將所述的實施方案和實施例理解是為了說明，對于本領域技術人員來說可以由此做出許多修改和變換，這些都應包涵在本申請和后文權利要求的宗旨和范圍內。
實施例以下實施例是為了說明而不是限定本發明。
實施例1樅色卷蛾屬幼蟲的THP以下實施例詳細說明了從翎翅目東樅色卷蛾的血淋巴中分離THP，該物種是已知最靠北寒帶的物種。樅色卷蛾屬下兩種，樅色卷蛾屬和西樅色卷蛾屬的勻漿在實驗室中已經表現出了特別高的抗凍活性。
東樅色卷蛾(C.fumiferana)二齡幼蟲購自Insect Production Unit of the ForestPest Management Institute,Forestry Canada,Sault Ste.Marie,Ontario,Canada。與2至4℃保持20至30周后，從粗棉布上收集血細胞滲出(diapausing)的幼蟲并如下使用。
根據Chakrabartty等(1991)的方法，使用Clifton直接讀數納升滲透壓力計(Clifton Technical Physics,hartford,NY)，在提取和純化THP過程中以熱滯后測定抗凍活性(即，溶液冰點和熔點之間的溫度差(℃))。在測試過程中，通過視頻顯微鏡監測和記錄AFP對冰晶形態的影響。利用比色法(Bradford,1976)或230納米的吸光度(A230)來檢測總蛋白濃度。
將所有溶液和樣品保持在冰上，在250微升0.1M NH4HCO3,pH8.0(含1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制劑)和0.5mM苯硫脲(苯基氧化酶抑制劑))中將100毫克二齡東方東樅色卷蛾勻漿化。在微型離心機中以10,000×g于4℃離心2分鐘，然后用勻漿緩沖液透析過夜。將透析液上樣在濾膜旋轉柱上(Bio-Rad,Hercules,CA)，去除細胞碎片和顆粒物質。
利用色譜法從所得的濾液中純化出THP，該方法是從血清中分離魚AFP的標準方法(Fourney等，1984；Li等，1985；Ng等，1986)。首先，在勻漿緩沖液中，在Sephadex G-75柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上，通過4℃的凝膠過濾對THP作分子篩篩選。THP緊接著空白峰被洗出。然后，匯集具有最高熱滯后活性的流份，低溫干燥，懸浮在1mL水中，再低溫干燥，重懸在100微升的水中。然后，在C18反相柱上，以0.1％三氟乙酸(TFA)對樣品進行高效液相色譜(HPLC)(Beckman)，用0至65％(v/v)的乙腈線性梯度洗脫。如圖1所示，THP從柱上洗脫成一簇峰，標以22、23和24，它們顯示有熱滯后活性。這與一組THP同種型組份一致。
在特定實驗中，同種型以HPLC再分級分離來提高它們的純度。該過程產生各同種型的單一分子量的蛋白質產品，這是根據MALDI(基質-輔助激光吸收/離子化)質譜法測定的。在Finnigan TSQ700三倍四重質譜儀(Finnigan,San Jose,CA)上用電子噴射(Electrospray)質譜法鑒別了至少三種AFP同種型，分子量都約為9,000Da。還對THP同種型進行了氨基酸分析(920型、Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA).
實施例2THP的蛋白質測序取2微克圖1中峰24的THP同種型，與碘乙酰胺反應將半胱氨酸還原并堿化。共價修飾后的THP用胰蛋白酶充分消化，并在Vydac C18柱上以0.1％三氟乙酸(TFA)作反相HPLC分離消化產物。在三個波長210納米、277納米和292納米監測洗脫形式。在Finnigan Lasermat質譜儀(Finnigan,San Jose,CA)上進行MALDI質譜法對幾個單獨、充分分離的胰酶酶解肽進行分析。用AppliedBiosystems,Inc.,477A型蛋白質測序儀和120A型乙內酰胺苯硫脲(PTH)-氨基酸分析儀通過自動化Edman降解法(Harvard Microchem,Harvard University)對三種此類肽進行了測序。所得的肽序列顯示在SEQ ID NO6,SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。此外，通過對非消化蛋白質的測序測定了該同種型的N末端序列，列于SEQ ID NO:9。短線表示不能用所述方法完全確定的氨基酸殘基；但是，在大多數情況下，該殘基是半胱氨酸。本發明者認識到，SEQ ID NO:9顯示與內部胰酶酶解肽序列之一即SEQ ID NO:7有重迭。
與圖1流份23對應的同種型的N末端序列已測定，顯示在SEQ ID NO:10。雖然所得序列延伸的不夠遠，沒有顯示與SEQ ID NO:7有任何重迭，本發明者認識到，該序列與SEQ ID NO:9的N末端具有明顯的同源性。這證實了相鄰HPLC峰的同種型地位。
實施例3THPcDNA的克隆和測序SEQ ID NO:1的核酸序列信息和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的蛋白質序列信息可用來設計鑒定樅色卷蛾抗凍基因和cDNA的PCR引物和寡核苷酸。已知產生THP序列的PCR引物對，例如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以及SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14，可直接用來擴增新種THP和同種型。
或者，利用多種雜交技術和條件，可用寡核苷酸檢測THP編碼核酸序列。這些寡核苷酸可以用已知技術來產生，其中包括PCR、分離DNA的限制性酶消化，或者有機合成。如前文所述，這些核酸可以被標記用于檢測，并經各種已知技術與DNA雜交。可以從樅色卷蛾屬幼蟲回收總RNA，并用QuickPrep MicromRNA純化試劑盒(Phamacia,Piscataway,NJ)，根據制造商的說明富集mRNA。然后，如Sambrook所述，利用例如禽成髓細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶(Phamacia)，將mRNA用于逆轉錄產生cDNA模板。
可以用例如PHC-3熱循環儀(Techne,Princeton,NJ)，利用以一已知THP序列(例如SEQ ID NO:1)為基礎的任何一組引物，或已知能擴增THP序列的引物對(例如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，以及SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)在cDNA上進行PCR。
擴增可能涉及多種退火條件，例如，52℃退火40秒，然后72℃延伸15秒，然后94℃變性1分鐘。這樣重復30至40輪，產生DNA產物，將其純化。PCR產物可以利用各種已知技術測序，例如雙脫氧鏈終止法，使用Dye終止儀循環測序試劑盒TM快速反應試劑盒(Applied Biosystem,Foster City,CA)和373A型DNA測序儀(Applied Biosystem)。如前所述，PCR產物一經鑒定為THP序列，就可以進一步標記，用作雜交探針。
可以使用計算機數據庫和程序來分析所得DNA序列與已知THP序列是否一致或同源。例如，PC/Gene TM軟件(IntelliGenetics Inc.,Mountain View,CA)將序列列隊，并顯示開放式讀碼框。可使用BLAST N和BLAST D檢索算法來檢索GeneBank數據庫(NIH,Bethesda,MD)，查找該衍生THP與數據庫中已知序列之間有無任何匹配。
實施例4產生針對THP的抗體本發明者鑒定到了一段9,060Da成熟THP的親水肽(SEQ ID NO:3)，將其作為可產生有用抗體的優良候選抗原決定基。該肽具有SEQ ID NO:12氨基酸序列。具有所示乙酰化N末端和酰胺化C末端的該肽是利用標準技術化學合成的。在Core Facility,Queen’s University,Kingston,ON,Canada，利用Harlowd和Lane(1988)所述的方法，在新西蘭白兔中產生了抗該肽的多克隆抗體。如前所述，該抗血清已在Western印跡法中用于檢測THP，并用在重組表達文庫中篩選THP。
實施例5THP對冰晶形成的影響如實施例1所述，利用視頻顯微鏡記錄了THP的熱滯后試驗。得到了以下有意義的發現當含有本發明THP的溶液真的凍結時，冰形成光滑的波紋或前緣，這顯示在圖3A二齡云杉食心幼蟲粗制提取物所成冰的顯微照片。相反，當含魚THP的溶液凍結時，冰形銳利而呈針狀。例如，海撅魚Ⅲ型抗凍蛋白(5mg/ml)，如圖3B所示。如此銳利的冰形可切破細胞。
以上實施例是實施方案應理解成僅是為了說明，據此，本領域技術人員可以據此提出各種修改和變換，這些都包括在本申請和后文權利要求的宗旨和范圍內。為了此種目的，本文參考了文中引用的所有出版物、專利和專利申請。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Queen’s University at Kingston(B)街道Queen’s University(C)城市Kingston(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼K7L 3N6(G)電話(613)545-2342(H)電傳(613)545-6853(I)電報(A)姓名Walker,Virginia K.
(B)街道R.R.#1(C)城市Sydenham(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼KOH 2TO(G)電話(H)電傳(I)電報(A)姓名Davies.Peter L(B)街道100 Dickens Drive(C)城市Kingston(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼K7M 2M8(G)電話(H)電傳(I)電報(A)姓名Rahavard,Mitra(B)街道10e-244 Sir John A.MacDonald Blvd.
(C)城市Kingston(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼K7M 5W9(G)電話(H)電傳(I)電報
(A)姓名Tyshenko.Michael G.
(B)街道3 Toronto street(C)城市Kingston(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼K7L 4A3(G)電話(H)電傳(I)電報(ⅱ)發明名稱樅色卷蛾抗凍蛋白、基因及其使用方法(ⅲ)序列數目17(ⅳ)通信地址(A)收件人Parteq Innovations(B)街道Queen’s University(C)城市Kingston(D)州(省)Ontario(E)國家Canada(F)郵政編碼K7L 3N6(ⅴ)計算機可讀形式(A)記錄介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0.Version#1.30(ⅵ)本申請資料(A)申請號PCT/CA97/00371(B)申請日03-JUN-1997(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請號US 08/657,264(B)申請日03-JUN-1996(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Steeg,Carol Miernicki(B)登記號39.539(C)參考/案卷號Q1669(ⅸ)通訊信息(A)電話(613)545-2342
(B)電傳(613)545-6853(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1388堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CGGCACGAGG AAAGACATAT TTTTTTTTTA GTTTCAAAAG TTGTGTACAT TTTTCTCAAG 60TATCATGAAG TGTTTAATGC TGATCATGGC TCTAGCCATT ATCAACACTG TATCTTCTGA 120TGGCTCGTGT ACAAACACGA ACTCTCAGCT CAGCGCAAAC TCCAAGTGCG AAAAATCGAC 180GTTGACCAAC TGCTACGTCG ATAAAAGCGA GGTTTACGGC ACTACCTGTA CAGGAAGCCG 240ATTCGACGGA GTCACTATAA CGACTTCAAC ATCTACCGGT TCACGTATTT CAGGCCCTGG 300ATGCAAGATT TCCACTTGCA TTATCACCGG GGGTGTACCT GCTCCATCAG CTGCTTGCAA 360GATTTCTGGA TGTACTTTCA GTGCTAATTA TAGCCATGAA AGTCGTCCGA GATTGAGTTT 420GGCCATTTCA TATGTAAGTA GAATAGGCTA GTGGCTTAAA AAATGTAATG AGTCCCGTCA 480GTTAGAATAT CAAAAAACAT GTATTTTTTC GGTTACCTAT ATAATGATTC GCCGACAATT 540CTTACGCAGA TTATTGATTG GCAGACAACG TTTCGCCGAG TAAAGGTACG CTGATGAATT 600TGAGCGCATA TGTATTGTTT CGCGTACTAA CGTTTAATTG ACTATTTATT CATTCAGTTG 660GCTTATGGGT CAGTAAGCCG AGCAACTAAT AACAGAAATT CGTTTAGCCG ATTAATCACT 720ACACATTTTG AACGTTTACT CAAACAAGTT TTCGCTTTAG AATTTGTGAT TATTTTAAAT 780TTAAAGTCAA AACAAACCAC GTCGCGACAC GCCAGCAGTT CGGTTATTGT TTGCCGCAAT 840TCTACCTAAC ACTCCTCCTC GCTGACGCTC GTCGTTGCAC CTAACTATAT TTCGGTGCCA 900TGTGATAACT CTGCTTATCA TGTTCCGGCG AACAGTTGTT CGCTTAACTC AAACAATTAC 960GAACCAAACA ATCGAATAAA CGTAAATCTG CATACCGCAA TTCTTTCGTA CCGACTACTC1020GGCGAAATGA ATAATAGGCG TAACAATATT ATACCAAACG TTGCTCGGCC AAAAGAAAAA1080TCTGCGTAAT CAAACTCGGC GAATCGACCG GTCACCATTA TCACTGAAAT AGATGGCCGT1140AAATTGTAAT CTATTAATTT AATCGATTAA CATGTTTATA ATAGAATAAT AAATATTACT1200TAACATTACT TAGTATTAAA TGATAGTAAC ATATTTTAAC ACTAGAGGGC TAGAAAATTA1260AAATAAAGCT TACATTATGC TACTCTAATG ACGGACTAAA AAGATTTTTT TTCCCCAATT1320ACCACTGTAC TTACTGTTTT TAAATATTTT AAAATACAGA AATTGTAACC AAAAAAAAAA1380AAAAAAAA 1388(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度108氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Lys Cys Leu Met Leu Ile Met Ala Leu Ala Ile Ile Asn Thr Val1 5 10 15Ser Ser Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn20 25 30Ser Lys Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser35 40 45Glu Val Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr50 55 60Ile Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys65 70 75 80Lys Ile Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala85 90 95Ala Cys Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn100 105(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度90氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Lys1 5 10 15Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val20 25 30Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr35 40 45Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys Ile50 55 60Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala Cys65 70 75 80Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn85 90(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CATATGCATA TGGATGGCTC GTGTACAAAC AC 32(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:AAGCTTAAGC TTTTAATTAG CACTGAAAGT ACA 33(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val Tyr Gly Thr1 5 10 15Thr Cys Thr Gly Ser Arg20(2)SEQ ID NO:8的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Ile Ser Ser Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala1 5 10 15Cys Lys(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Asp Gly Thr Xaa Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Gln1 5 10 15Xaa Asp Lys Ser Thr Leu Thr Asn Xaa20 25(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Asp Gly Thr Xaa Arg Asn Thr Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ser Gln Gly1 5 10 15Xaa Asp Arg(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Met Lys Cys Leu Met Leu Ile Met Ala Leu Ala Ile Ile Asn Thr Val1 5 10 15Ser Ser(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)姓名/關鍵修飾位點(B)位置1(D)其它信息/產物=“其它”/注意=“Xaa=N-乙酰半胱氨酸”(ⅸ)特征(A)姓名/關鍵修飾位點(B)位置16(D)其它信息/產物=“其它”
/注意=“Xaa=纈氨酰胺”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Xaa Asp Lys Ser Thr Leu Thr Asn Ala Tyr Val Asp Lys Ser Glu Xaa1 5 10 15(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TGAAGTGTTT AATGCTGATC ATG 23(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CATTAGAGTA GCATAATGTA AGC 23(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:TCCAAGTGCG AAAAATCGAC G 21(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GCTGATGGAG CAGGTACACC 20(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度327堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:ATGAAGTGTT TAATGCTGAT CATGGCTCTA GCCATTATCA ACACTGTATC TTCTGATGGC 60TCGTGTACAA ACACGAACTC TCAGCTCAGC GCAAACTCCA AGTGCGAAAA ATCGACGTTG 120ACCAACTGCT ACGTCGATAA AAGCGAGGTT TACGGCACTA CCTGTACAGG AAGCCGATTC 180GACGGAGTCA CTATAACGAC TTCAACATCT ACCGGTTCAC GTATTTCAGG CCCTGGATGC 240AAGATTTCCA CTTGCATTAT CACCGGGGGT GTACCTGCTC CATCAGCTGC TTGCAAGATT 300TTCGGATGTA CTTTCAGTGC TAATTTA 32權利要求
1．一種分離的編碼抗凍蛋白的核酸，所述蛋白的定義如下(ⅰ)計算分子量在7至15kDa之間；(ⅱ)在約1mg/mL的濃度下，熱滯后活性大于約1.5℃；和(ⅲ)(a)可與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白的抗體特異性結合；或(b)有至少60％的氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。
2．根據權利要求1所述的分離的核酸，其中編碼的蛋白質的計算分子量在約8至12kDa間。
3．根據權利要求1所述的分離的核酸，其中在約1mg/mL的濃度下，熱滯后活性大于2℃。
4．根據權利要求1所述的分離的核酸，其中編碼的蛋白質有至少80％的氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。
5．根據權利要求1所述的分離的核酸，其中編碼的蛋白質選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
6．根據權利要求1所述的分離的核酸，其中抗凍蛋白可在昆蟲體內發現。
7．根據權利要求6所述的分離的核酸，其中抗凍蛋白可在樅色卷蛾屬中發現。
8．一種分離的核酸，該核酸可在嚴格的條件下與SEQ ID NO:1特異性雜交。
9．一種分離的核酸編碼的純抗凍蛋白，該抗凍蛋白可與針對選自SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白的抗體特異性結合。
10．一種分離的抗凍蛋白，所述蛋白的定義如下(ⅰ)計算分子量在7至15kDa之間；(ⅱ)在約1mg/mL的濃度下，蛋白的熱滯后活性大于約1.5℃；和(v)(a)可與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白的抗體特異性結合；或(c)有至少60％的氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗凍蛋白相同。
11．根據權利要求10所述的分離的抗凍蛋白，其中抗凍蛋白可在昆蟲體內發現。
12．根據權利要求10所述的分離的抗凍蛋白，其中抗凍蛋白可在樅色卷蛾屬中發現。
13．根據權利要求10所述的分離的抗凍蛋白，其中在約1mg/mL的濃度下，抗凍蛋白的熱滯后活性大于約2℃。
14．根據權利要求10所述的分離的抗凍蛋白，其中蛋白選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
15．一種抗體，該抗體可在免疫反應條件下與包括SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的所述抗凍蛋白發生特異性免疫反應。
16．一種抗體，該抗體可在免疫反應條件下與抗凍蛋白發生特異性免疫反應，所述抗凍蛋白包括由權利要求1所述的核酸編碼的蛋白。
17．一種生物，向該生物內引入在嚴格條件下與SEQ ID NO:1特異性雜交的外源核酸序列或權利要求1所述的核酸，該生物將外源核酸表達成抗凍蛋白。
18．根據權利要求17所述的生物，其中外源核酸序列被翻譯成表達到生物體外的抗凍蛋白。
19．根據權利要求17所述的生物，其中所述生物是魚。
20．根據權利要求19所述的生物，其中所述的魚生活在咸水環境中。
21．根據權利要求19所述的生物，其中所述的魚是鮭科家族成員。
22．根據權利要求17所述的生物，其中所述生物是植物。
23．根據權利要求17所述的生物，其中所述生物是真菌。
24．根據權利要求17所述的生物，其中所述生物是酵母。
25．根據權利要求24所述的生物，其中酵母選自Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、釀酒酵母菌、Saccharomyces lactis和Candidapseudotropicalis。
26．根據權利要求17所述的生物，其中生物是細菌。
27．根據權利要求26所述的生物，其中細菌選自大腸桿菌、堅忍鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱鏈球菌、嗜檸檬酸明串球菌、腸系膜樣明串球菌、嗜酸乳酸桿菌、乳酸乳桿菌、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacteriu breve和Bifidobacteriumlongum。
28．一種降低水溶液冰點的方法，所述方法包括將權利要求10所述的抗凍蛋白加入所述水溶液中。
29．一種降低水溶液冰點的方法，所述方法包括將權利要求1所述的核酸編碼的抗凍蛋白加入所述水溶液中。
30．根據權利要求28或29所述的方法，其中將水溶液施用于生物。
31．根據權利要求28或29所述的方法，其中抗凍蛋白用重組方法生產。
32．根據權利要求28或29所述的方法，其中抗凍蛋白還可與權利要求15或權利要求16所述的抗體特異性結合。
33．根據權利要求28所述的方法，其中抗凍蛋白選自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3。
34．根據權利要求28所述的方法，其中抗凍蛋白由與SEQ ID NO:1特異性雜交的核酸分子編碼。
全文摘要
已經從樅色卷蛾屬(包括東樅色卷蛾)中分離純化獲得一類熱滯后抗凍蛋白(THP)。本發明提供編碼這些抗凍蛋白的核酸。本發明也提供了與這些抗凍蛋白反應的抗體。本發明還包括通過在溶液中加入這些抗凍蛋白來降低水溶液冰點的方法。
文檔編號C12N15/09GK1221450SQ97195223
公開日1999年6月30日 申請日期1997年6月3日 優先權日1996年6月3日
發明者V·K·沃克, P·L·戴維斯, 密特勒·拉哈瓦德, M·G·泰申克 申請人:金斯頓女王大學