一種羅伊乳酸桿菌無抗性標記基因整合體系的建立方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種羅伊乳酸桿菌無抗性標記基因整合 體系的建立方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌是公認的安全級（GenerallyRegardedAsSafeOrganisms，GRAS) 微生物，是動物消化道中的優勢益生菌群；乳酸桿菌對動物有益，可以產生乳酸菌素 Lactocidin，Lactacin，Acidophilucin以及Acidocin等活性物質，并通過生物詰抗、改善 動物腸道的生態環境及提高動物免疫力等機制發揮其作用。同時，乳酸菌具有諸多特性，如 能夠分泌細胞表面疏水物質和胞外基質分子、基因操作方便、來源于動物消化道的乳酸桿 菌還有很好適應消化道復雜內部環境的能力等，已成為表達外源基因的理想宿主。
[0003]目前乳酸桿菌的基因工程操作技術還不成熟，已報道的無抗性標記基因整合手 段主要利用cre-loxP系統進行篩除抗性基因。此方法存在一定弊端：在篩除抗性利用 cre-loxP系統篩除抗性基因時，在宿主菌基因組中保留有一個loxP位點，這可能會引起許 多突變，如截短、點突變，蛋白融合等。
[0004]pheS基因是苯丙氨酰-tRNA合成酶a亞基編碼基因，該基因的一個點突變基 因（GCC-GGC)編碼的PheS突變蛋白質（Ala-Gly)能夠氨酰化苯基丙氨酸類似物，如 對-氯-苯丙氨酸（P-Cl-Phe)，這些氨酰化的苯基丙氨酸類似物會插入細胞蛋白而對對宿 主菌有毒性致死作用。因此，可利用pheS基因作為反向篩選基因，以對-氯-苯丙氨酸作 為負向篩選底物建立細菌基因組無痕編輯技術體系，目前該技術已被用于糞腸球菌和變形 鏈球菌基因編輯系統。
[0005] 由于PheS蛋白在細菌中是高度保守，因此，基于pheS點突變基因的細菌基因組編 輯技術具有廣泛的應用潛力。
[0006] 采用pheS點突變基因為反向篩選基因在Lactobacillusreuteri中進行基因插 入的技術以及整合體系構建的方法國內未見有相關報道。

【發明內容】

[0007] 為解決上述問題，本發明提供了一種羅伊乳酸桿菌無抗性標記基因整合體系的建 立方法及其應用。
[0008] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為： 一種羅伊乳酸桿菌無抗性標記基因整合體系的建立方法，包括如下步驟： 51、 根據Genebank中公布的羅伊乳酸桿菌pheS基因序列設計特異引物，然后以羅伊乳 酸桿菌L.reuteriXNY基因組DNA為模板擴增得到L.reuteriXNY的pheS基因； 52、 利用軟件將Lactobacillusreuteri的pheS基因與其它細菌的pheS基因進行比 對，確定基因突變位點，再設計點突變引物利用重疊PCR技術獲得pheS基因的點突變基因 pheSM; 53、 選取目的基因插入位點，以羅伊乳酸桿菌L.reutcriXNY基因組DNA為模板 PCR擴增獲得插入位點上下游700bp同源臂片段LR和RR;然后擴增啟動子片段P、紅霉 素抗性基因EM片段，再利用重疊PCR技術將其與pheSM基因和同源臂片段連接，得到 LR-P-pheSM-EM-RR整合框架； 54、 將LR-pheSM-EM-RR整合框架電轉化至L.reuteriXNY感受態細胞，利用紅霉素抗 性篩選得到pheSM基因重組羅伊乳酸桿菌； 55、 利用重疊PCR技術將所需插入的目的基因與插入位點兩端的同源臂序列連接， 得到目的基因整合框架，再將其電轉化至PheSM基因重組羅伊乳酸桿菌感受態細胞，利用 對-氯-苯丙氨酸（P-Cl-Phe)抗性篩選即可獲得無抗性標記的目的基因整合菌株。
[0009] 其中，所述步驟S1中所述的pheS基因特異引物序列為： a：ATGGGACTAAGAGAGAAATTAG d：TTATCCTTTCTGGTCAAATTGG 其中，所述步驟S2中所述的pheS基因點突變引物序列為：c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT 其中，所述步驟S2中所述的pheSM基因是pheS基因第312位Arg突變為Gly的點突 變基因：GCC312GGC。
[0010] 其中，所述步驟S3中所述的基因插入位點是羅伊乳酸桿菌基因組中的任意位點。
[0011] 其中，所述步驟S4中所述的pheSM基因重組羅伊乳酸桿菌具有紅霉素抗性、 p-Cl-Phe敏感性。
[0012] 其中，所述步驟S5中所述的目的基因整合菌株具有p-Cl-Phe抗性，對紅霉素敏 感。
[0013] 其中，所述步驟S5中所述的利用p-Cl-Phe抗性篩選目的基因整合菌株的濃度為 25mM〇
[0014] 其中，pheSM基因重組羅伊乳酸桿菌，是將構建的LR-P-pheSM-EM-RR整合框架電 轉化至L.reuteriXNY感受態細胞，涂布于含有紅霉素的MRS平板后，篩選獲得的具有紅霉 素抗性的雙交換轉化子（圖3)。此次交換是將pheSM基因和紅霉素抗性基因整合到基因 組上，獲得的重組菌具有紅霉素抗性、P-Cl-Phe敏感性；目的基因整合菌株，是將構建基因 整合框架電轉化至pheSM基因重組羅伊乳酸桿菌感受態細胞，涂布于含有p-cl-phe的MRS 平板后，篩選獲得的具有p-cl-phe抗性的雙交換轉化子（圖4)。此次交換是將目的基因與 pheSM基因和紅霉素抗性基因交換并整合到基因組上，獲得的重組菌具有p-cl-phe抗性、 紅霉素敏感性。
[0015] 本發明具有以下有益效果： 本發明建立的基于PheS負向篩選標記基因的羅伊乳酸桿菌基因整合技術體系，可將 目的基因整合到宿主菌基因組的任意位點，不引入任何冗余序列到宿主菌基因組中，避免 了冗余片段引起的突變；利用該整合體系可以在同一菌株的任意位點進行多次染色體基因 插入；本發明的有益之處還在于該技術體系可用于宿主菌染色體基因無痕敲除和替代。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明實施例中不同細菌pheS基因編碼蛋白序列比對結果； 圖中，丨為pheS基因突變位點。
[0017] 圖2為本發明實施例中pheS點突變基因pheSM構建示意圖。
[0018] 圖3為本發明實施例中pheSM基因重組菌構建示意圖。
[0019] 圖4為本發明實施例中目的基因重組菌構建示意圖。
【具體實施方式】 為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細 說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0021] 本發明實施例提供了一種羅伊乳酸桿菌無抗性標記基因整合體系的建立方法，包 括如下步驟： 51、 根據Genebank中公布的羅伊乳酸桿菌pheS基因序列設計特異引物，然后以羅伊乳 酸桿菌L.reuteriXNY基因組DNA為模板擴增得到L.reuteriXNY的pheS基因；所述的 pheS基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，所述的pheS基因特異引物序列為： a：ATGGGACTAAGAGAGAAATTAG d：TTATCCTTTCTGGTCAAATTGG 52、 利用軟件將Lactobacillusreuteri的pheS基因與其它細菌的pheS基因進行比 對，確定基因突變位點，再設計點突變引物利用重疊PCR技術獲得pheS基因的點突變基因 pheSM;所述的pheS基因點突變引物序列為： c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT 53、 選取目的基因插入位點，以羅伊乳酸桿菌L.reuteriXNY基因組DN