除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用圖
【專利摘要】本發明涉及一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，所述基因包括：(a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發明除草劑抗性蛋白質特別適合在植物中表達，尤其定位于葉綠體中表達，可以增強對麥草畏除草劑的耐受性，且應用前景廣。
【專利說明】
除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途
技術領域
[0001] 本發明設及一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，特別是設及一種對除草 劑麥草畏具有耐受性的蛋白質、其編碼基因及用途。
【背景技術】
[0002] 雜草可W迅速耗盡±壤中作物和其它目的植物所需要的有價值的養分。盡管目前 可W得到耐受除草劑草甘麟、草下麟、2,4-D和其它除草劑處理的轉基因植物，但是還存在 空白區域，如所控制的雜草范圍、開發額外的除草劑耐受性作物等。此外，耐受上述除草劑 的雜草的出現(盡管通常是局部的和可變的)造成了對額外或備選的雜草控制措施的需要。
[0003] 已經證明耐受除草劑性狀在商業上是有價值的，因此需要增加耐受其它除草劑的 植物和管理難W控制的雜草種類的選項，W避免過度依賴任何單一除草劑，尤其需要針對 環境友好的并且在控制雜草方面高度有效的除草劑而開發除草劑耐受性。麥草畏是有效且 環境友好的除草劑之一，其已經被農民使用40多年了，麥草畏可用于控制玉米、高梁、小米、 牧草、干草、牧場、甘薦、蘆算、草皮和草巧作物中一年生和多年生闊葉雜草和幾種窄葉雜 草;與此同時，麥草畏可W傷害許多商業作物和雙子葉植物，如大豆、棉花、魏豆、馬鈴馨、向 日葵和油菜，上述作物/植物對于低水平的麥草畏都是特別敏感的。盡管如此，麥草畏在控 制雜草生長中仍然是有效的，并且是重要的。
[0004] 已報道從嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltopMlia)分離了編碼麥草畏單加氧 酶(DMO)的基因，其為鐵氧還蛋白依賴型并賦予對麥草畏的耐受性。DMO參與將除草劑麥草 畏(3,6-二氯-鄰-茵香酸)轉化為無毒的3,6-二氯水楊酸(DCSA)，表達DMO基因的植物具有 對麥草畏的耐受性。
[0005] 由于目前發現的麥草畏耐受型基因均極其相似，所W需要更多新型的麥草畏耐受 型基因W避免過度依賴一種麥草畏耐受型基因，使麥草畏-麥草畏耐受型作物在商業上具 有更廣闊的應用空間。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，所述MTHFR66蛋 白在植物中對麥草畏除草劑具有較高的耐受性。
[0007] 為實現上述目的，本發明提供了一種基因，包括：
[000引（a)編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核巧酸序列;或
[0009] (b)在嚴格條件下與(a)限定的核巧酸序列互補的核巧酸序列;或
[0010] (C)沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[001 U 所述嚴格條件可為在6 X SSC術樣酸鋼）、0.5%SDS(十二烷基硫酸鋼）溶液中，在 65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜1次。
[0012]為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控 下的所述基因。
[0013] 進一步地，所述調控序列為葉綠體轉運膚，所述葉綠體轉運膚與所述基因有效連 接。
[0014] 優選地，所述葉綠體轉運膚的核巧酸序列具有SEQ ID N0:7所示的核巧酸序列。
[0015] 為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述基因或所述表達盒的重組載體。
[0016] 為實現上述目的，本發明還提供了一種增加耐受除草劑范圍的方法，包括:將SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質或所述表達盒編碼的蛋白質在植物中與至少一種 不同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質或所述表達盒編碼的蛋白質的第二種 蛋白質一起表達。
[0017] 進一步地，所述第二種蛋白質為草甘麟耐受性蛋白質、草錠麟耐受性蛋白質、a酬 戊二酸雙加氧酶、4-徑苯基丙酬酸雙加氧酶、乙酷乳酸合酶、細胞色素類蛋白質或原化嘟原 氧化酶。
[001引在本發明中，MTHFR66除草劑抗性蛋白質在一種轉基因植物中的表達可W伴隨著 一個或多個草甘麟耐受性蛋白質和/或草錠麟耐受性蛋白質的表達。運種超過一種的除草 劑耐受性蛋白質在同一株轉基因植物中共同表達可W通過遺傳工程使植物包含并表達所 需的基因來實現。另外，一種植物(第1親本)可W通過遺傳工程操作表達MTHFR66除草劑抗 性蛋白質，第二種植物(第2親本)可W通過遺傳工程操作表達草甘麟耐受性蛋白質和/或草 錠麟耐受性蛋白質。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基 因的后代植物。
[0019] 為實現上述目的，本發明還提供了一種選擇轉化的植物細胞的方法，包括:用所述 基因或所述表達盒轉化多個植物細胞，并在允許表達所述基因或所述表達盒的轉化細胞生 長，而殺死未轉化細胞或抑制未轉化細胞生長的除草劑濃度下培養所述細胞，所述除草劑 為麥草畏。
[0020] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制雜草的方法，包括:對種植植物的大田 施用有效劑量的麥草畏除草劑，所述植物包含所述基因、所述表達盒或所述重組載體。
[0021] 為實現上述目的，本發明還提供了一種保護植物免受由除草劑引起的損傷的方 法，包括:將所述基因、所述表達盒或所述重組載體導入植物，使導入后的植物產生足夠保 護其免受麥草畏損害量的除草劑耐受性蛋白質。
[0022] 為實現上述目的，本發明還提供了一種賦予植物麥草畏除草劑耐受性的方法，包 括:將所述基因、所述表達盒或所述重組載體導入植物。
[0023] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制草甘麟耐性植物的大田中草甘麟耐受 性雜草的方法，包括:對種植草甘麟耐受性植物的大田施用有效劑量的麥草畏，所述草甘麟 耐受性植物包含所述基因、所述表達盒或所述重組載體。
[0024] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生麥草畏耐受性植物的方法，包括向所 述植物的基因組中引入所述基因或所述表達盒，W產生麥草畏耐受性植物。
[0025] 具體地，所述產生麥草畏耐受性植物的方法包括:通過將親本植物自交或與第二 種植物雜交而產生麥草畏耐受性植物，所述親本植物和/或第二種植物包含所述基因或所 述表達盒，所述麥草畏耐受性植物遺傳了來自所述親本植物和/或第二種植物的所述基因 或所述表達盒。
[0026] 為實現上述目的，本發明還提供了一種培養對麥草畏除草劑具有耐受性的植物的 方法，包括：
[0027] 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括所述基因或所述表達盒；
[0028] 使所述植物種子長成植株；
[0029] 用有效劑量麥草畏除草劑噴灑所述植株，收獲與其他不具有所述基因或所述表達 盒的植株相比具有減弱的植物損傷的植株。
[0030] 在上述技術方案的基礎上，優選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜 或甘薦。
[0031] 為實現上述目的，本發明還提供了一種甲基四氨葉酸還原酶耐受麥草畏除草劑的 用途，所述甲基四氨葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0032] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生甲基四氨葉酸還原酶的植物耐受麥草 畏除草劑的用途，所述甲基四氨葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0033] 將所述的基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本發明中為將外源 DNA導入植物細胞，常規轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將 DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須娃介導的DNA導入。
[0034] 本發明可W增加植物對于氧化應激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麥草 畏或麥草畏單加氧酶所介導代謝的產物或其類似物，W改善植物的除草劑耐受性，例如，通 過將麥草畏代謝為DCSA。
[0035] 本發明"麥草畏"（Dicamba)是指3,6-二氯-鄰-茵香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲 酸及其酸和鹽。其鹽包括異丙胺鹽、二甘醇錠鹽、二甲胺鹽、鐘鹽和鋼鹽。麥草畏的商業制劑 包括但不限于，Baiwel⑥（作為DMA鹽）、Clarity? (BASF,作為DGA鹽）、VEレ58-cs-ll?和 伯Iiq 地 Sh? (BASF，作為DGA鹽）。
[0036] 目前已經報道的含甲氧基芳控化合物脫甲基酶有4種，分別是（1)畑OsUieske非 血紅素型氧化酶），降解麥草畏的DMO(GenBank: AY786443.1)屬于S組份畑0類型的氧化酶； (2)細胞色素P450，是一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超家族，它參與內源性物質和包括藥 物、環境化合物在內的外源性物質的代謝，很多含甲氧基芳控化合物脫甲基酶就是運一類 型；（3 )厭氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶，發現于厭氧細菌如熱醋穆爾氏菌 (Moorel Iathermoacetica)中，參與木質素降解中間產物如下香酸和香草酸的厭氧降解，也 有研究發現厭氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶也可W厭氧降解麥草畏；（4)好氧型四氨葉酸 依賴型的脫甲基酶（S地ingomonas paucimobilis SYK-6)，參與木質素降解中間產物如下 香酸和香草酸的厭氧降解，但目前還沒有運類好氧型四氨葉酸依賴型脫甲基酶能降解麥草 畏的報道。
[0037] MTHFR為5, lO-methylenetetr址y化ofolate reductase,亞甲基四氨葉酸還原酶 蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5,10-亞甲基四氨葉酸轉化為具有生物學 功能的5-甲基四氨葉酸及其逆反應。
[0038] 本發明所述基因用于植物表達后具有允許在植物中使用麥草畏除草劑的特性，所 述植物中固有耐性不存在或不足W允許使用麥草畏除草劑。此外，本發明所述MTHFR66基因 可W在天然耐性不足W允許選擇性時在植物中提供對麥草畏除草劑的防護。向田地使用的 施用量是大約0.0025磅/英畝Qb/a)到大約2(Ub/a麥草畏，更通常從0.25化/a至12化/曰。在 同一大田里(連續或罐混組合地)組合不同化學類別和具有不同作用模式和范圍的除草劑 可W提供對大多數需要除草劑控制的潛在雜草的控制。
[0039] 草甘麟被廣泛地使用，因為它控制非常廣譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在草 甘麟耐性作物和非作物應用中重復使用草甘麟已經(而且仍將繼續)選擇使雜草演替為天 然更具有耐性的物種或草甘麟耐受性生物型。多數除草劑耐受性管理策略建議使用有效用 量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現耐受性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對同一物種的 控制，但具有不同的作用模式。將MTHFR66基因與草甘麟耐性性狀(和/或其他除草劑耐受性 性狀)疊加可通過允許對同一作物選擇性使用草甘麟和麥草畏而實現對草甘麟耐受性作物 中草甘麟耐受性雜草物種(被麥草畏控制的闊葉雜草物種）的控制。運些除草劑的應用可W 是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時使用、在連續使用（如種植 前、出苗前或出苗后）中單個除草劑組合物的單獨使用(使用的間隔時間范圍從2小時到3個 月），或者備選地，可W在任何時間（從種植作物7個月內到收獲作物時(或對于單個除草劑 為收獲前間隔，取最短者））使用代表可應用每種化合類別的任意數目除草劑的組合。
[0040] 在控制闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時間、單個除草劑用量和控制 頑固或耐受性雜草的能力。作物中與草甘麟耐受性基因/MTHFR66基因疊加的草甘麟應用范 圍可W從250至2500g ae/ha;麥草畏可按照從0.25化/a至12化/a。運些應用的時間的最佳 組合取決于具體的條件、物種和環境。
[0041] 除草劑制劑(如醋、酸或鹽配方或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添 加劑(如佐劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。 任意前述除草劑的任意化學組合均在本發明的范圍內。
[0042] 本領域技術人員所熟知的，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或 天然更具耐受性物種或耐受性雜草物種上的益處還可擴展到通過人工（轉基因或非轉基 因）在作物中產生除草甘麟耐性作物外的除草劑耐性的化學品。事實上，可W單獨或W多重 組合疊加編碼W下耐受性的性狀W提供有效控制或防止雜草演替對任意前述類別的除草 劑的耐受性的能力:草甘麟耐受性(如耐受性植物或細菌6?5?5、60乂、641')、草錠麟耐受性 (如PAT、Bar )、苯氧基生長素耐受性(如2，4-D、二甲四氯耐受性基因如AAD-I、AAD-12等）乙 酷乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑耐受性(如咪挫嘟酬、橫酷脈、S挫喀晚、橫苯胺、喀晚硫代 苯甲酸和其它化學品耐受性基因如AHAS、Csr 1、SurA等）、漠草臘耐受性(如Bxn )、對HPPD (4- 徑苯基丙酬酸雙加氧酶)酶抑制劑的耐受性、對八氨番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的耐受 性、對光系統n抑制性除草劑的耐受性(如PSbA)、對光系統I抑制性除草劑的耐受性、對原 化嘟原氧化酶K(PPO)抑制性除草劑耐受性（如PPO-I )、對苯脈除草劑的耐受性（如 CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0043] 關于其他除草劑，一些其它優選的ALS抑制劑包括S挫喀晚橫苯胺(氯醋橫草胺、 雙氯橫草胺、挫喀橫草胺、橫草挫胺和喀晚并=挫類橫胺）、喀晚硫代苯甲酸和氣挫橫隆。一 些優選的HPPD抑制劑包括甲基橫草酬、異惡挫草酬和橫草酬。一些優選的PPO抑制劑包括丙 烘氣草胺、氣丙喀草醋、挫草酬、甲橫草胺和二苯酸(如=氣簇草酸、氣橫胺草酸、乳氣禾草 靈和乙氧氣草酸）。
[0044] 此外，可W將MTHFR66基因單獨或與其它除草劑耐受作物特征疊加后再與一種或 多種其它輸入(如昆蟲耐受性、真菌耐受性或脅迫耐性等)或輸出（如提高的產量、改進的油 量、提高的纖維品質等)性狀疊加。因此，本發明可用于提供W靈活且經濟地控制任何數目 的農學害蟲的能力和提高作物品質的完整農學解決方案。
[0045] 本發明MTHFR66基因能降解麥草畏除草劑，是重要的除草劑耐受作物和選擇標記 物特征可能性的基礎。
[0046] 本發明可進行轉基因表達，可W控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合。MTHFR66基 因可作為優秀的除草劑耐受作物性狀與例如其它除草劑耐受作物性狀(如草甘麟耐受性、 草錠麟耐受性、苯氧基生長素耐受性、ALS抑制劑(如咪挫嘟酬類、橫酷脈類、=挫并喀晚橫 酷胺類)耐受性、漠草臘耐受性、HPPD抑制劑耐受性、PPO抑制劑耐受性等)和昆蟲耐受性性 狀(CrylAb、CrylF、Vip3、其它蘇云金芽抱桿菌蛋白質或非芽抱桿菌屬來源的昆蟲耐受性蛋 白等)疊加。此外，MTHFR66基因可作為選擇標記物輔助選擇用另一個基因或基因群遺傳改 造的植物的原代轉化體。
[0047] 本發明的除草劑耐性作物性狀可用在與其它除草劑耐性作物性狀(包括但不限于 草甘麟耐性)的新組合中。由于對除草劑(如草甘麟)的新獲得的耐受性或固有的耐性，運些 性狀組合產生控制雜草物種的新方法。因此，除了除草劑耐性作物性狀，本發明的范圍包括 使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉基因作物中的所述酶產生對所述除草劑的耐 性。
[0048] 本發明可應用于多種植物中，如擬南芥、煙草、大豆、棉花、稻、玉米和蕓臺。本發明 還可用于多種其它單子葉（如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如首猜、=葉草、 喬木物種等）。類似的，麥草畏(或其它MTHFR66底物)可更積極地用于耐性適中的禾本科作 物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能W更有效的用量和更廣的施用時間來 使用運些除草劑而無作物損傷風險的可能性。
[0049] 本發明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物 細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。
[0050] 本發明中所述"耐受性"和所述"抗性"是可遺傳的，并允許植物在除草劑對給定植 物進行一般除草劑有效處理的情況下生長和繁殖。正如本領域技術人員所認可的，即使植 物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認為"耐受性"或"抗性"。本發明中術 語"耐性"比術語"耐受性"更廣泛，并包括"耐受性"，W及特定植物具有的抵抗除草劑誘導 的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導致相同基因型野生型植物 損傷。
[0051] 本發明中所述的多核巧酸和/或核巧酸形成完整"基因"，在所需宿主細胞中編碼 蛋白質或多膚。本領域技術人員很容易認識到，可W將本發明的多核巧酸和/或核巧酸置于 目的宿主中的調控序列控制下。
[0052] 本發明中所述調控序列包括但不限于啟動子、轉運膚、終止子、增強子、前導序列、 內含子W及其它可操作地連接到所述MTHFR66基因的調節序列。
[0053] 所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的"植物中可表達的啟動子"是指確保 與其連接的編碼序列在植物細胞內進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型 啟動子。指導植物內組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花挪菜花葉病毒的 35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可 為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表 達水平高于植物的其他組織(可通過常規RNA試驗進行測定），如PEP簇化酶啟動子。備選地， 植物中可表達的啟動子可為創傷誘導啟動子。創傷誘導啟動子或指導創傷誘導的表達模式 的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲哨食引起的創傷時，啟動子調控下的編碼序列的表 達較正常生長條件下有顯著提高。創傷誘導啟動子的示例包括但不限于，馬鈴馨和西紅柿 的蛋白酶抑制基因（pin巧PpinII)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0054] 所述轉運膚(又稱分泌信號序列或導向序列）是指導轉基因產物到特定的細胞器 或細胞區室，對受體蛋白質來說，所述轉運膚可W是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉運膚 序列祀向葉綠體，包括但不限于擬南芥葉綠體轉運膚AtCTP2,或者利用'邸EL'保留序列祀 向內質網，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP祀向液泡。
[0055] 所述前導序列包含但不限于，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列（腦屯、肌炎病 毒5 '非編碼區）；馬鈴馨Y病毒組前導序列，如MDMV(玉米矮縮花葉病毒)前導序列;人類免疫 球蛋白質重鏈結合蛋白質(BiP);首猜花葉病毒的外殼蛋白質mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導序列。
[0056] 所述增強子包含但不限于，花挪菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增 強子、康乃馨風化環病毒(CERV)增強子、木馨脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫萊莉花葉病毒 (MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨巧 草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生稱綠線條花葉病毒(P化SV)增強子。
[0057] 對于單子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，玉米hsp70內含子、玉米泛 素內含子、A化內含子1、薦糖合酶內含子或水稻Actl內含子。對于雙子葉植物應用而言，所 述內含子包含但不限于，CAT-I內含子、pKANNIBAL內含子、PIV2內含子和"超級泛素"內含 子。
[0058] 所述終止子可W為在植物中起作用的適合多聚腺巧酸化信號序列，包括但不限 于，來源于農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)姻脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺巧酸化 信號序列、來源于蛋白酶抑制劑n (Pinn)基因的多聚腺巧酸化信號序列、來源于魏豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺巧酸化信號序列和來源于a-微管蛋白（a-tubulin)基因的多聚 腺巧酸化信號序列。
[0059] 本發明中所述"有效連接"表示核酸序列的聯結，所述聯結使得一條序列可提供對 相連序列來說需要的功能。在本發明中所述"有效連接"可W為將啟動子與感興趣的序列相 連，使得該感興趣的序列的轉錄受到該啟動子控制和調控。當感興趣的序列編碼蛋白并且 想要獲得該蛋白的表達時"有效連接"表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到 的轉錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉錄物融合并且想要實現編碼的蛋白 的表達時，制造運樣的連接，使得得到的轉錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始 密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現編碼的蛋白的表 達時，制造運樣的連接，使得5'非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結， 并且連接方式使得得到的翻譯產物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀 碼框的。可W "有效連接"的核酸序列包括但不限于:提供基因表達功能的序列（即基因表達 元件，例如啟動子、5'非翻譯區域、內含子、蛋白編碼區域、3'非翻譯區域、聚腺巧化位點和/ 或轉錄終止子）、提供DNA轉移和/或整合功能的序列（即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶 識別位點、整合酶識別位點）、提供選擇性功能的序列（即抗生素耐受性標記物、生物合成基 因）、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內協助序列操作的序列（即多接頭序列、位點 特異性重組序列）和提供復制功能的序列（即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序 列）。
[0060] 本發明可賦予植物新除草劑耐受性性狀，并且未觀察到對表型包括產量的不良影 響。本發明中植物能耐受住如至少一種受試除草劑1倍的應用水平。運些耐性水平的提高在 本發明的范圍之內。例如可對本領域已知的多種技術進行可預見到的優化和進一步發展， W增加給定基因的表達。
[0061] 本發明中，所述除草劑抗性蛋白質為MTHFR66氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO: 2所示。所述除草劑抗性基因為MTHFR66核巧酸序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述除 草劑抗性基因為用于植物，除了包含由MTHFR66核巧酸序列編碼的蛋白質的編碼區外，也可 包含其他元件，例如編碼轉運膚的編碼區、編碼選擇性標記的蛋白質或賦予昆蟲耐受性的 蛋白質的編碼區。
[0062] 本發明中MTHFR66除草劑抗性蛋白質對麥草畏除草劑具有耐性。本發明中的植物， 在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含MTHFR66核巧酸序列，通過表達有效量的該蛋 白而保護其免受除草劑的威脅。有效量是指未損傷的或輕微損傷的劑量。同時，植物在形態 上應是正常的，且可在常規方法下培養W用于產物的消耗和/或生成。
[0063] 本發明提供了一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，具有W下優點：
[0064] 1、對除草劑耐受性強。本發明MTHFR66基因可W降解麥草畏除草劑，優化MTHFR66 基因采用玉米和大豆的偏好密碼子，使其特別適合在植物中表達;優化MTHFR66基因可W賦 予轉基因植物麥草畏除草劑耐受性，且所述優化MTHFR66基因定位于葉綠體中表達可W增 強轉基因植物對麥草畏除草劑的耐受性。
[0065] 2、應用前景廣闊。本發明除草劑抗性蛋白質MTHFR66為甲基四氨葉酸還原酶，其不 同于已知的麥草畏耐受型基因，因此可W擴大麥草畏耐受型在植物上應用范圍。
[0066] 下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【附圖說明】
[0067] 圖1為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的MTHFR66基因在表達宿主菌 BL21 (DE3)中表達的蛋白SDS-PAGE電泳圖；
[0068] 圖2為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的誘導表達的MTHFR66蛋白降 解麥草畏的HPLC圖譜；
[0069] 圖3為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的誘導表達的MTHFR66蛋白在 不同濃度的四氨葉酸條件下降解麥草畏的HPLC圖譜；
[0070] 圖4為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的誘導表達的MTHFR66蛋白代 謝5-甲基四氨葉酸的HPLC圖譜；
[0071] 圖5為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的誘導表達的MTHFR66蛋白代 謝5-甲基四氨葉酸的中間產物鑒定一級質譜圖；
[0072] 圖6為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有優化MTHFR66核巧酸序 列的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0073] 圖7為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有優化MTHFR66核巧酸序 列的重組表達載體DBNl 11101構建流程圖；
[0074] 圖8為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸序 列的重組表達載體DBNl 11 IOlN結構示意圖；
[0075] 圖9為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的轉基因擬南芥Tl植株除草 劑耐受性效果圖；
[0076] 圖10為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有優化MTHFR66核巧酸 序列的重組表達載體DBN-HT130066構建流程圖；
[0077] 圖11為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸 序列的重組表達載體DBN-HT130066N結構示意圖。
【具體實施方式】
[0078] 下面通過具體實施例進一步說明本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的 技術方案。
[0079] 第一實施例、甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的體外高效表達及功能鑒定
[0080] 1、細菌表達載體的構建和重組微生物獲得 [0081 ] (1)MTHFR66 基因的 PCR 擴增
[00劇設計一對引物：
[0083] 引物 1:5-GGAATTCCATATGGGCTCGCCCGTTATGG-3 (下劃線為Nde I酶切位點），如序列 表中沈Q ID NO:4所示；
[0084] 引物2:5-CCGCTCGAGGTGCTTTCGAGCGTAGTCAG-3 (下劃線為趾〇I酶切位點，如序列表 中沈Q ID NO:5所示；
[0085] 用下述PCR擴增體系擴增MTHFR66基因：
[0086]
12345 模板DNA(即天然MTHFR66核巧酸序列）如序列表中SEQ ID N0:3所示。PCR反應條件 為:98°C變性Imin;然后進入下列循環:98°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸Imin,共29個 循環;最后72°C延伸lOmin，冷卻至室溫。 2
[008引（2)細菌表達載體的構建和重組微生物獲得 3 用限制性內切酶NdeI和趾Ol分別酶切上述PCR擴增產物和細菌表達載體pET-29a ( + )，將切下的MTHFR66核巧酸序列片段與酶切后的細菌表達載體祀T-29a( + )進行酶連，將 酶連產物轉化到表達宿主菌化21 (DE3)，獲得重組微生物化21 (MTHFR66)。 4 2、MTHFR66蛋白在大腸桿菌中的表達及純化 5 所述重組微生物化2UMTHFR66)在IOOmL的LB培養基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物 5g/L，化C110g/L，卡那霉素100mg/L，用化0H調pH至7.5)中培養至濃度為0D600nm = 0.6- 0.8,加入濃度為0.4mM的異丙基硫代半乳糖巧（IPTG)，在溫度16°C下誘導20小時。離屯、，收 集菌體，用 20ml Tris-HCl buffer(100mM，pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎（X0-900D ultrasonic processor ultrasonic processor,30%intensity)lOmin，然后離屯、，收集上 清，用儀離子親和層析柱對MTHFR66蛋白進行純化，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化結果，條 帶大小和理論預測的條帶大小(31.79kDa)-致(如圖1所示）。
[0092] 3、測定MTHFR66蛋白的酶活力
[OOW] 酶活反應體系（300化）：含有ImM底物（麥草畏）、0.2mg MTHFR66、lmM四氨葉酸 (THF)，緩沖體系為濃度1 OOmM的化iS-肥1 (抑8.0)，溫度30°C下在水浴鍋中反應1小時，然 后在沸水中放置Imin，終止反應。反應液冷凍干燥后加入30化L甲醇溶解凍干物，高效液相 色譜化PLC)檢測麥草畏中間代謝產物3,6-二氯水楊酸(DCSA)的生成量。一個酶活力單位定 義為:在抑8.0、溫度30°C條件下Imin內降解麥草畏生成Inmol產物DCSA所需要酶的量，Wu 表不。
[0094] 上述實驗結果表明：純化后的MT冊R66蛋白能在1小時內產生0.15mM的DCSA， MTHFR66蛋白的比酶活為3.7抓/mg(如圖2所示）。
[00M] 4、測定MTHFR66蛋白在微量四氨葉酸存在條件下的麥草畏脫甲基功能
[0096] 酶活反應體系（300化）：含有ImM底物(麥草畏）、0.2mg MTHFR66和分別含O.OlmM、 0.02mM、0.OSmM和ImM四氨葉酸(THF)，緩沖體系為濃度IOOmM的Tris-肥KpH 8.0)，溫度30 °C下在水浴鍋中反應1小時，然后在沸水中放置Imin，終止反應。反應液冷凍干燥后加入300 化甲醇溶解凍干物，高效液相色譜化PLC)檢測麥草畏中間代謝產物DCSA的生成量。
[0097] 上述實驗結果表明：純化后的MTHFR66蛋白在0.0 lmM的四氨葉酸存在時，就能夠將 麥草畏脫甲基形成DCSA，在0.5mM的四氨葉酸存在時能夠將ImM的麥草畏全部脫甲基產生 DCSA(如圖3所示）。
[009引第二實施例、甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的水解酶功能鑒定及產物鑒定
[0099] 1、MTHFR66蛋白的水解酶功能測定
[0100] 酶活反應體系（300化）：含有0.2mg MTHFR66、lmM 5-甲基四氨葉酸巧-C曲-H4F)，緩 沖體系為濃度IOOmM的化iS-HCl(pH 8.0)，溫度30°C下在水浴鍋中反應1小時，然后在沸水 中放置Imin，終止反應。反應液冷凍干燥，干燥物加入30化L的0.1mol/L的K此P〇4(pH 6.8， 1%抗壞血酸、〇.l%0-琉基乙醇）溶解，用濾膜(孔徑0.22WI1)過濾，采用高效液相色譜進行 檢測。液相色譜條件為：流動相為0.05mol/L的K此P〇4(pH 3.0):乙臘（90:10，V/V) ,Zorbax C2180DS S地erex反相柱（5皿，4.6mm X 250mm，Agi lent，USA)，柱溫為23°C，紫外檢測器，測 定波長為298nm，進樣量為20化，流速為1. OmL/min。外標法按峰面積定量。
[0101] 上述HPLC結果表明：純化后的MTHFR66蛋白能夠在沒有電子受體NAD+存在的條件 下，將5-甲基四氨葉酸轉化成其他的物質(如圖4所示）。
[0102] 2、產物鑒定
[0103] 代謝產物通過HPLC-MS(高效液相色譜和質譜聯用）進行鑒定，條件為：流動相為 0.05mol/L的KH2P〇4(pH 3.0):乙臘（90:10，V/V) ,Zorbax XDB-C18，5cmX0.46畑1，1.8mm反相 柱（5皿，4.6mmX250mm，Agilent，USA)，流速為0.25mL/min。MS分析使用ESI模式，檢測器為 Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer〇
[0104] 結果表明：純化后的MTHFR66蛋白能夠在沒有電子受體NAD+的條件下將5-甲基四 氨葉酸水解產生四氨葉酸(如圖5所示）。
[0105] 第=實施例、基因序列的優化和合成
[0106] 1、植物優化序列的獲得
[0107] 保持所述甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的氨基酸序列（289個氨基酸，如序列表中 SEQ ID NO: 2所示)不改變，對編碼相應于所述甲基四氨葉酸還原酶MTHFR66的氨基酸序列 的MTHFR66核巧酸序列(870個核巧酸)進行密碼子優化改造。
[0108] 密碼子優化改造的策略主要包括:依據單子葉植物玉米和雙子葉植物大豆的偏好 密碼子、不穩定序列的改造、G+C含量的提高等。天然基因的G+C含量較低，A巧含量很高，一 方面，如果直接將天然基因序列導入植物基因組中可能會被誤認為是植物基因調控序列， 同時在運些天然基因中會出現A+T富含區域，類似于基因啟動子中的TATA盒，運些區域則會 導致基因的異常轉錄;另一方面，在轉錄的mRNA中聚腺巧酸化信號序列(AAUAAA)、與mRNA剪 接相關的小RNA互補序列會導致RNA不穩定。因此，改造后的基因序列除了有較高的G+C含量 夕h還改變DNA和轉錄成mRNA中出現的不穩定結構，從而保證蛋白的正常翻譯;再一方面，應 用玉米和大豆的偏好密碼子改造天然基因序列，排除酶切位點和一些序列的修飾。
[0109] 基于W上優化策略，得到優化MTHFR66核巧酸序列，優化MTHFR66核巧酸序列共含 有870個核巧酸，編碼289個氨基酸，其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0110] 2、合成優化MTHFR66核巧酸序列
[0111] 優化MTHFR66核巧酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;合成的所述優化 MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO: 1)的5'端還連接有SacI酶切位點，所述優化MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID NO: 1)的3'端還連接有KasI酶切位點。
[0112] 第四實施例、擬南芥重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0113] 1、構建含有優化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組克隆載體
[0114] 將合成的優化MTHFR66核巧酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA， CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM-T載體說明書進行，得到重組克隆載體 DBN01-T，其構建流程如圖6所示(其中，Amp表示氨節青霉素抗性基因；fl表示隧菌體n的復 制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；17為T7RNA聚合酶啟動子； mMTHFR66為優化MTHFR66核巧酸序列(SEQ ID N0:1);MCS為多克隆位點）。
[0115] 然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞(Transgen， Bei jing，化ina，CAT:CD501)，其熱激條件為:50化大腸桿菌Tl感受態細胞、10化質粒DNA(重 組克隆載體DBNOI-T )，42 °C水浴30秒;37 °C振蕩培養1小時（100巧m轉速下搖床搖動），在表 面涂有IPTG(異丙基硫代-P-D-半乳糖巧)和X-gal (5-漠-4-氯-3-日引噪-P-D-半乳糖巧）的氨 節青霉素（lOOmg/L)的LB平板(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，化Cl lOg/L，瓊脂15g/L， 用化OH調抑至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，氨節青霉素lOOmg/L，用化OH調pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養過 夜。堿法提取其質粒:將菌液在1200化pm轉速下離屯、Imin,去上清液，沉淀菌體用10化1冰預 冷的溶液I (25mM hiS-HCl，IOmM EDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，P冊.0)懸浮;加入200 化新配制的溶液II (0.2M化OH，1 % SDS(十二烷基硫酸鋼）），將管子顛倒4次，混合，置冰上 3-5min;加入15化L冰冷的溶液III(3M醋酸鐘，5M醋酸），立即充分混勻，冰上放置5-lOmin; 于溫度4 °C、轉速1200化pm條件下離屯、5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫 放置5min;于溫度4°C、轉速120(K)rpm條件下離屯、5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70% 的乙醇洗涂后驚干；加入30化含RNase (20yg/mL)的TE(IOmM IYiS-肥1，ImM EDTA，抑8.0)溶 解沉淀;于溫度37 °C下水浴30min，消化RNA;于溫度-20°C保存備用。
[0116] 提取的質粒經SacI和KasI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組 克隆載體DBNOl-T中插入的所述優化MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的核 巧酸序列，即優化MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0117] 2、構建含有優化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組表達載體DBNl 11101
[0118] 用限制性內切酶Sac巧日KasI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-Ol (載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構可W提供）），將切下的優化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表達載體DBNBC-Ol的SacI和KasI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技 術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN111101，其構建流程如圖7所示化an:卡那霉素基 因；RB:右邊界;prAtUbilO:擬南芥Ubiquitin(泛素）10基因啟動子（SEQ ID N0:6);AtCTP2: 擬南芥葉綠體轉運膚(SEQ ID N0:7);mMTHFR66:優化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:1); tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO: 8);prCaMV35S:花挪菜花葉病毒35S啟動子 (沈Q ID N0:9);PAT:草下麟乙酷轉移酶基因（SEQ ID N0:10);tCaMV35S:花挪菜花葉病毒 35S終止子(SEQ ID N0:11);LB:左邊界）。
[0119] 將重組表達載體DBN111101用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條件 為:5化L大腸桿菌Tl感受態細胞、1化L質粒DNA(重組表達載體DBNl 11101)，42°C水浴30秒； 37°C振蕩培養1小時（10化pm轉速下搖床搖動）；然后在含50mg/L卡那霉素化anamycin)的LB 固體平板(膜蛋白腺1 Og/L，酵母提取物5g/L，NaCl lOg/L，瓊脂15g/L，用化OH調抑至7.5)上 于溫度37°C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH調抑至7.5)中于溫度37°(：條件下培養過夜。 堿法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶SacI和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進 行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN111101在SacI和KasI位點間的核巧酸序列為序列 表中SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即優化MTHFR66核巧酸序列。
[0120] 3、構建含有天然MTHFR66核巧酸序列的擬南芥重組表達載體DBNl 11 IOlN
[0121] 按照本實施例中1所述的構建含有優化MT冊R6 6核巧酸序列的重組克隆載體 DBNOl-T的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID ^:3)構建含有天然^邸366核巧酸 序列的重組克隆載體DBNO1R-T。對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBNO1R- T中插入的天然MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然 MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0122] 按照本實施例中2所述的構建含有優化MTHFR66核巧酸序列的重組表達載體 DBNl 11101的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列構建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組 表達載體DBN111101N，其載體結構如圖8所示(載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構可W提 供）；Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；prAt師ilO:擬南芥師iquitin(泛素）10基因啟動子 (沈Q ID N0:6);AtCTP2:擬南芥葉綠體轉運膚（SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8);prCaMV35S:花挪 菜花葉病毒35S啟動子（SEQ ID N0:9);PAT:草下麟乙酷轉移酶基因（SEQ ID N0:10); t化MV35S:花挪菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:11);LB:左邊界）。對陽性克隆進行測序 驗證，結果表明重組表達載體DBNl 11 IOlN中插入的天然MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序列正確插入。
[0123] 4、擬南芥重組表達載體轉化農桿菌
[0124] 對己經構建正確的重組表達載體DBNl 11101和DBNl 11 IOlN用液氮法轉化到農桿菌 GV3101中，其轉化條件為：100化農桿菌GV310U3化質粒DNA(重組表達載體）；置于液氮中10 分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉化后的農桿菌GV3101接種于LB試管中于溫度28°C、轉速為 20化pm條件下培養2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB 平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養并提取其質粒，用限制性內切酶酶切 DBNl 11101和DBNl 1110 IN后進行酶切驗證，結果表明重組表達載體DBNl 1110 ^roBNllllOlN 結構完全正確。
[0125] 第五實施例、轉基因擬南芥植株的獲得
[0126] 將野生型擬南芥種子懸浮于0.1%瓊脂糖溶液中。將懸浮的種子在4°C下保存2天 W完成對休眠的需要W保證種子同步萌發。用賠石混合馬糞±并用水地下灌概至濕潤，使 ±壤混合物排水24小時。將預處理后的種子種在±壤混合物上并用保濕罩覆蓋7天。使種子 萌發并在恒溫(22°C)恒濕(40-50%)光強度為120-150皿ol/m2秒的長日照條件（16小時光 照/8小時黑暗）下在溫室中培養植物。開始用霍格蘭營養液灌概植物，接著用去離子水灌 概，保持±壤潮濕但不濕透。
[0127] 使用花浸泡法轉化擬南芥。用選取的農桿菌菌落接種一份或多份15-30mL含卡那 霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L)的YEP培養液的預培養物。W 22化pm將培養物在28 °C恒速 搖動解育過夜。每個預培養物用于接種兩份500ml含卡那霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L) 的YEP培養液的培養物并將培養物在28°C持續搖動解育過夜。室溫W約8700Xg離屯、10分鐘 沉淀細胞，棄去得到的上清液。將細胞沉淀輕柔重懸于SOOmL滲透培養基中，所述滲透培養 基含有1/2 XMS鹽/B5維生素、10% (w/v)薦糖、0.044測節氨基嚷嶺（10化/L( Img/血DMSO中 的原液））和30化L/L SiIvet L-77。將約1月齡的植物在培養基中浸泡15秒，確保浸沒最新 的花序。接著將植物側面放倒并覆蓋(透明或不透明）24小時，接著用水洗涂并豎直放置。在 22°CW16小時光照/8小時黑暗的光周期培養植物。浸泡約4周后收獲種子。
[012引將新收獲的（優化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列）Tl種子在室溫 干燥7天。將種子種在26.5 X51cm萌發盤中，每盤接受200mg Tl種子(約10000個種子），所述 種子事先已懸浮于40mL 0.1%瓊脂糖溶液并在4°C下保存2天W完成對休眠的需要W保證 種子同步萌發。
[0129] 用賠石混合馬糞±并用水地下灌概至濕潤，利用重力排水。用移液管將預處理后 的種子(每個40mL)均勻地種在±壤混合物上，并用保濕罩覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草 錠麟(選擇共轉化的PAT基因）進行最初轉化體選擇前1天移去罩。
[0130] 在7個種植天數后（DAP)并于IlDAP再次使用DeVi化iss壓縮空氣噴嘴WlOmL/盤 (70化Aa)的噴灑體積用Libedy除草劑(200g ai/L的草錠麟）的0.2%溶液噴灑Tl植物(分 別為子葉期和2-4葉期），W提供每次應用280g ai Aa有效量的草錠麟。在最后噴灑后4-7天 鑒定存活株(生長活躍的植物），并分別移植到用馬糞上和賠石制備的7cm X 7cm的方盆中 (每盤3-5棵）。用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天，并如前置于22 °C培養室中或直接移入溫室。 接著移去罩并在測試MTHFR66基因提供麥草畏除草劑耐受性的能力之前至少I天將植物栽 種到溫室(22 ± 5°C，50 ± 30%RH，14小時光照：10小時黑暗，最小50化E/WV天然+補充光）。
[0131] 第六實施例、轉基因擬南芥植株的除草劑耐受性效果檢測
[0132] 用MTHFR66基因進行首次擬南芥轉化。首先使用草錠麟選擇方案從未轉化種子背 景中選擇Tl轉化體。轉化重組表達載體DBN111101的為定位于葉綠體的轉入優化MTHFR66核 巧酸序列的擬南芥植株(At mMTHFR66)，轉化重組表達載體DBN111101N的為定位于葉綠體 的轉入天然MTHFR66核巧酸序列的擬南芥植株（At MTHFR66)。篩選了約20000個At mMTHFR66的Tl種子，并鑒定了 197株Tl代陽性轉化子(PAT基因），約1.0 %的轉化效率;篩選了 約20000個At MTHFR66的Tl種子，并鑒定了 182株Tl代陽性轉化子(PAT基因），約0.91 %的轉 化效率。將轉入優化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥Tl植株(At-mMTHFR66)、轉入天然MTHFR66 核巧酸序列的擬南芥Tl植株(At-MTHFR66)和野生型擬南芥植株(播種后18天)對麥草畏進 行除草劑耐受性效果檢測。
[0133] 分別將轉入優化MTHFR66核巧酸序列的擬南芥Tl植株、轉入天然MTHFR66核巧酸序 列的擬南芥Tl植株和野生型擬南芥植株用麥草畏（560gae/ha，l倍大田濃度）和空白溶劑 (水)噴灑。噴施7天和14天后統計植株耐受性情況:7天后生長狀況和空白溶劑(水)一致的 劃為高抗植株，7天后有蓮座葉卷曲的劃為中抗植株，14天后仍不能抽苔的劃為低抗植株， 14天后死亡的劃為不抗植株。由于每株擬南芥Tl植株是獨立的轉化事件，可W預計在給定 劑量內個體Tl應答的顯著差異。結果如表1和圖9所示。
[0134] 表1、轉基因擬南芥Tl植株除草劑耐受性實驗結果
[0135]
[0136] 對于擬南芥，560g ae/ha麥草畏是將敏感植物與具有平均耐受性水平的植物區分 開來的有效劑量。表1和圖9的結果表明：優化MTHFR66基因賦予個體擬南芥植物麥草畏除草 劑耐受性（只有部分植株具有耐受性的原因是由于Tl代植物插入位點是隨機的，因而耐受 性基因的表達水平有差異，表現出耐受性水平的差異）；相比于At-MTHFR66的Tl植株，At- mMTHFR66的Tl代擬南芥后代部分能夠產生更高的麥草畏除草劑耐受性，表明所述MTHFR66 基因經植物密碼子優化可W增強擬南芥植物對麥草畏除草劑的耐受性;而野生型擬南芥則 不具有麥草畏除草劑耐受性。
[0137] 第屯實施例、玉米重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0138] 1、構建含有優化MTHFR66核巧酸序列的玉米重組表達載體DBN-HTl 30066
[0139] 用限制性內切酶Sac巧日KasI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-02 (載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構可W提供）），將切下的優化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表達載體DBNBC-02的SacI和KasI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技 術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN-HT130066，其構建流程如圖10所示化an:卡那霉 素基因；RB:右邊界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因啟動子(SEQ ID ^:12);41口？2:擬 南芥葉綠體轉運膚（SEQ ID NO:7);mMTHFR66:優化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO:l); tNos:姻脂堿合成酶基因的終止子（SEQ ID NO:8);PMI:憐酸甘露糖異構酶基因（SEQ ID N0:13);LB:左邊界）。
[0140] 將重組表達載體DBN-HT130066用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條 件為：50化大腸桿菌Tl感受態細胞、10化質粒DNA(重組表達載體DBN-HT130066)，42°C水浴 30秒;37 °C振蕩培養1小時（10化pm轉速下搖床搖動）；然后在含50mg/L卡那霉素的LB固體平 板(膜蛋白腺1〇旨/1，酵母提取物5旨/1，化(：110旨/1，瓊脂15旨/1，用船0的周抑至7.5)上于溫度 37 °C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/ L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH調抑至7.5)中于溫度37°C條件下培養過夜。堿法提 取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶SacI和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序 鑒定，結果表明重組表達載體DBN-HT130066在Sac巧日KasI位點間的核巧酸序列為序列表中 SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即優化MTHFR66核巧酸序列。
[0141] 2、構建含有天然MTHFR66核巧酸序列的玉米重組表達載體DBN-HTl 30066N
[0142] 按照本實施例中1所述的構建含有優化MTHFR66核巧酸序列的重組表達載體DBN- HT120066的方法，利用本發明第四實施例中3所述的含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組克 隆載體DBNOlR-T，構建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重組表達載體DBN-HT130066N，其載 體結構如圖11所示（載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構可W提供）；Kan:卡那霉素基因； RB:右邊界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因啟動子（SEQ ID N0:12);AtCTP2:擬南芥葉 綠體轉運膚(SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂 堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8);PMI:憐酸甘露糖異構酶基因（SEQ ID N0:13);LB: 左邊界）。對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組表達載體DBN-HTl30066N中插入的天然 MTHFR66核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序 列正確插入。
[0143] 3、玉米重組表達載體轉化農桿菌
[0144] 對己經構建正確的重組表達載體DBN-HT130066和DBN-HT130066N用液氮法轉化到 農桿菌 LBA4404 (Invi 付 gen，Chi cago，USA，CAT: 18313-015)中，其轉化條件為：100 化農桿菌 LBA4404、3化質粒DNA(重組表達載體）；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘;將轉化后的 農桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉速為20化pm條件下培養2小時，涂于含50mg/ L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克 隆培養并提取其質粒，用限制性內切酶酶切DBN-HT130066和DBN-HT130066N后進行酶切驗 證，結果表明重組表達載體DBN-HTl 30066和DBN-HTl 30066N結構完全正確。
[0145] 第八實施例、轉基因玉米植株的獲得及驗證
[0146] 按照常規采用的農桿菌侵染法，將無菌培養的玉米品種綜3UZ31)的幼胚與本發 明第屯實施例中3所述的農桿菌共培養，W將本發明第屯實施例中1和2構建的重組表達載 體DBN-HT130066和DBN-HT130066N中的T-DNA(包括玉米Ubiquitinl基因的啟動子序列、優 化MTHFR66核巧酸序列、天然MTHFR66核巧酸序列、AtCTP2葉綠體轉運膚序列、PMI基因和Nos 終止子序列)轉入到玉米染色體組中，獲得了定位于葉綠體的轉入優化MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株(Zm-mMTHFR66)和轉入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米植株(Zm-MTHFR66);同時 W野生型玉米植株作為對照。
[0147] 對于農桿菌介導的玉米轉化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農桿菌懸浮 液接觸幼胚，其中農桿菌能夠將優化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列傳遞至 幼胚之一的至少一個細胞(步驟1:侵染步驟）。在此步驟中，幼胚優選地浸入農桿菌懸浮液 (ODssq = O . 4-0.6，侵染培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖68.5g/L、葡萄 糖36g/L、乙酷下香酬(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) Img/L，P冊.3))中W啟動接 種。幼胚與農桿菌共培養一段時期（3天）（步驟2:共培養步驟）。優選地，幼胚在侵染步驟后 在固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖20g/L、葡萄糖lOg/L、乙酷下香 酬(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、瓊脂8g/L，p冊.8)上培養。在此共培養階 段后，可W有一個選擇性的"恢復"步驟。在"恢復"步驟中，恢復培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他 命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) Img/L、植物凝膠3g/L，P冊.8)中 至少存在一種己知抑制農桿菌生長的抗生素(頭抱霉素），不添加植物轉化體的選擇劑(步 驟3:恢復步驟）。優選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養基上培養，W消除農桿 菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖）的培養基上培養并選 擇生長著的轉化愈傷組織(步驟4:選擇步驟）。優選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養基 (MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2，4-二氯苯氧乙酸 (2，4-D) Img/L、植物凝膠3g/L，P冊.8)上培養，導致轉化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織 再生成植物(步驟5:再生步驟），優選地，在含選擇劑的培養基上生長的愈傷組織在固體培 養基(MS分化培養基和MS生根培養基)上培養W再生植物。
[0148] 篩選得到的抗性愈傷組織轉移到所述MS分化培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪 素300mg/L、薦糖30g/L、6-芐基腺嚷嶺2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝膠3g/L，p冊.8)上，25°C下 培養分化。分化出來的小苗轉移到所述MS生根培養基（MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素 300mg/L、薦糖30g/L、日引噪-3-乙酸Img/L、植物凝膠3g/L，p冊.8)上，25°C下培養至約IOcm 高，移至溫室培養至結實。在溫室中，每天于28°C下培養16小時，再于20°C下培養8小時。
[0149] 2、用化qMan驗證轉基因玉米植株
[0150] 分別取轉入優化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和轉入天然MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組 DNA，通過化qman探針巧光定量PCR方法檢測PMI基因的拷貝數來確定轉基因玉米植株的拷 貝數。同時W野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平 均值。
[0151 ]檢測PMI基因拷貝數的具體方法如下：
[0152] 步驟11、分別取轉入優化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉入天然MTHFR66核巧 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研鉢中用液氮研成勻漿，每個 樣品取3個重復；
[0153] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體 方法參考其產品說明書；
[0154] 步驟13、用NanoDrop 2000(The;rmo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度； [01W] 步驟14、調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80- 100雌/化；
[0156] 步驟15、采用化qman探針巧光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數，W經過鑒定已知拷 貝數的樣品作為標準品，W野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平均 值;巧光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0157] W下引物和探針用來檢測PMI基因：
[015引 引物3:01^^^'6441'〔46〔6口'巧日序列表中沈9 10備：14所示；
[0159] 引物4:6〇1^'66〇：1'1764〔46巧日序列表中沈9 10^:15所示；
[0160] 探針1:16〇1；〇：44〔6441'〔4〇1；6如序列表中沈9 10備:16所示；
[0161] PCR反應體系為：
[0162]
[0163] 所述50X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45化，IOOiiM濃度的探針50y L和86化L 1 X TE緩沖液，并且在4°C，膽藏在班巧試管中。
[0164] PCR反應條件為：
[01 化]
[0166]
[0167]利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數據。
[016引實驗結果表明，優化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列均己整合到所 檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉入優化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和轉入天然 MTHFR66核巧酸序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝MTHFR66基因的轉基因玉米植株。
[0169] 第九實施例、轉基因玉米植株的除草劑抗性效果檢測
[0170] 將轉入優化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米 植株和野生型玉米植株(V5-V6時期)分別對麥草畏進行除草劑抗性效果檢測。
[0171] 分別取轉入優化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、轉入天然MTHFR66核巧酸序列的 玉米植株和野生型玉米植株的Tl代雜合植株(V5-V6時期），并用麥草畏除草劑(4480g ae/ ha，8倍大田濃度)和空白溶劑(水)噴灑。噴施21天后統計支撐根發育情況。Zm-mMTHFR66共3 個株系（S1、S2和S3)，Zm-MTHFR66共2個株系（S4和S5)，野生型的（CK)共1個株系；從每個株 系選10-15株進行測試。結果如表2所示。
[0172] 表2、轉基因玉米Tl植株除草劑抗性實驗結果
[0173]
[0174] 表2的結果表明：優化MTHFR66基因賦予轉基因玉米植物麥草畏除草劑的高水平耐 受性（由于單子葉植物本身對麥草畏除草劑具有一定抗性，因而表現出高水平抗性）；相比 于Zm-MTHFR66，Zm-mMTHFR66能夠產生更高的麥草畏除草劑耐受性，表明所述MTHFR66基因 經植物密碼子優化可W增強玉米植物對麥草畏除草劑的耐受性;而野生型玉米植株則不具 有麥草畏除草劑耐受性。
[0175] 綜上所述，本發明MTHFR66蛋白可W降解麥草畏除草劑，優化MTHFR66基因采用玉 米和大豆的偏好密碼子，使其特別適合在植物中表達;優化MTHFR66基因可W賦予轉基因植 物更好的麥草畏除草劑耐受性；同時本發明除草劑耐受性蛋白質MTHFR66還具有甲基四氨 葉酸還原酶活性，其不同于已知的麥草畏耐受型基因，因此可W擴大麥草畏耐受型在植物 上應用范圍。
[0176] 最后所應說明的是，W上實施例僅用W說明本發明的技術方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發明 的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種基因，其特征在于，包括： (a) 編碼SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或 (b) 在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列互補的核苷酸序列;或 (c) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. -種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調控序列調控下的權利要求1所述基 因。3. 根據權利要求2所述表達盒，其特征在于，所述調控序列為葉綠體轉運肽，所述葉綠 體轉運肽與權利要求1所述基因有效連接。4. 根據權利要求3所述表達盒，其特征在于，所述葉綠體轉運肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。5. -種包含權利要求1所述基因或權利要求2-4任一項所述表達盒的重組載體。6. -種增加耐受除草劑范圍的方法，其特征在于，包括:將SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列組成的蛋白質或權利要求2-4任一項所述表達盒編碼的蛋白質在植物中與至少一種不 同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質或權利要求2-4任一項所述表達盒編碼 的蛋白質的第二種蛋白質一起表達。7. 根據權利要求6所述增加除草劑耐受性的方法，其特征在于，所述第二種蛋白質為草 甘膦耐受性蛋白質、草銨膦耐受性蛋白質、α酮戊二酸雙加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、 乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質或原卟啉原氧化酶。8. -種選擇轉化的植物細胞的方法，其特征在于，包括：用權利要求1所述基因或權利 要求2-4任一項所述表達盒轉化多個植物細胞，并在允許表達所述基因或所述表達盒的轉 化細胞生長，而殺死未轉化細胞或抑制未轉化細胞生長的除草劑濃度下培養所述細胞，所 述除草劑為麥草畏。9. 一種控制雜草的方法，其特征在于，包括:對種植植物的大田施用有效劑量的麥草畏 除草劑，所述植物包含權利要求1所述基因、權利要求2-4任一項所述表達盒或權利要求5所 述重組載體。10. -種保護植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權利要求1所 述基因、權利要求2-4任一項所述表達盒或權利要求5所述重組載體導入植物，使導入后的 植物產生足夠保護其免受麥草畏損害量的除草劑耐受性蛋白質。11. 一種賦予植物麥草畏除草劑耐受性的方法，其特征在于，包括:將權利要求1所述基 因、權利要求2-4任一項所述表達盒或權利要求5所述重組載體導入植物。12. -種控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦耐受性雜草的方法，其特征在于，包 括:對種植草甘膦耐受性植物的大田施用有效劑量的麥草畏，所述草甘膦耐受性植物包含 權利要求1所述基因、權利要求2-4任一項所述表達盒或權利要求5所述重組載體。13. -種產生麥草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因組中引入 權利要求1所述基因或權利要求2-4任一項所述表達盒，以產生麥草畏耐受性植物。14. 根據權利要求13所述產生麥草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括:通過將親 本植物自交或與第二種植物雜交而產生麥草畏耐受性植物，所述親本植物和/或第二種植 物包含權利要求1所述基因或權利要求2-4任一項所述表達盒，所述麥草畏耐受性植物遺傳 了來自所述親本植物和/或第二種植物的所述基因或所述表達盒。15. -種培養對麥草畏除草劑具有耐受性的植物的方法，其特征在于，包括： 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括權利要求1所述基因或權利要 求2-4任一項所述表達盒； 使所述植物種子長成植株； 用有效劑量麥草畏除草劑噴灑所述植株，收獲與其他不具有所述基因或所述表達盒的 植株相比具有減弱的植物損傷的植株。16. 根據權利要求6-15任一項所述方法，其特征在于，所述植物為大豆、棉花、玉米、水 稻、小麥、甜菜或甘蔗。17. -種甲基四氫葉酸還原酶耐受麥草畏除草劑的用途，其特征在于，所述甲基四氫葉 酸還原酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。18. -種產生甲基四氫葉酸還原酶的植物耐受麥草畏除草劑的用途，其特征在于，所述 甲基四氫葉酸還原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N5/10GK105925590SQ201610440763
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月18日
【發明人】何健, 姚利, 賈興軍, 謝香庭, 吳業春, 陶青, 丁德榮
【申請人】北京大北農生物技術有限公司, 南京農業大學