一種消除卡那霉素耐藥基因活性的重組載體及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病原細菌學領域，具體涉及一種消除耐藥基因活性的gRNA的重組載體 及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥性現象越來越嚴重。卡那霉素屬于氨基糖甙類 抗生素，對金葡菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌均有效。臨床上主要用于敏感菌特別是耐 藥性綠膿桿菌引起的尿路感染、呼吸道及肺部感染等。大腸桿菌等多種細菌含有卡那霉素 耐藥基因。
[0003]耐藥細菌的消除是解決細菌耐藥性的重要方法。環境中的耐藥細菌可通過物理學 或化學方法進行消毒滅菌。但生物機體內的耐藥細菌只能以特異性抗菌化學或生物藥物進 行抑制或殺滅 [H]。然而，噬菌體宿主特異性太強，只能裂解某些特定型別的致病菌，還存在 可能引起人體過敏的問題 [1];細菌素抑菌菌譜太窄，規模化生產工藝尚未成熟，且也可能存 在誘導耐藥性問題[2];新型抗生素仍然是抗生素，必然存在誘導耐藥性問題 [3]。因此，抑制 或破壞耐藥基因成為控制細菌耐藥性的重要方法之一。在現有的研究中，部分中藥可以消 除耐藥質粒基因而消除大腸桿菌耐藥性 [4]，但其消除效率不高，針對1〇4的CFU/ml的大腸桿 菌，耐藥性消除率最高者仍不足12.5 %[4]。
[0004]近年來，一種全新的CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepeats)技術的出現使我們能對任意物種的基因組進行定點編輯。CRISPR原 本是細菌和古細菌中的一種適應性免疫防御系統，可保護宿主菌免受噬菌體或質粒等有害 外源核酸的再次侵襲。CRISPR系統分為3種類型：I型、Π型和m型。目前Π型系統已被成功 改造為人工核酸酶切系統，即CRISPR/Cas9系統，用于基因編輯，且具有制作簡單、成本低、 作用高效等優點[5]。目前該技術已在科學研究中得到廣泛應用，例如，人多能干細胞基因的 高效敲除;斑馬魚的高通量定點基因突變和大范圍分型;基因敲低小鼠的制備;修飾生殖細 胞DNA以預防小鼠肌肉營養不良癥;植物基因組基因編輯以及微生物基因組編輯和轉錄控 制等。這些研究大都是對基因組上的基因進行操作，往往用于疾病的預防或治療，基因改造 有利于生物體的生存。
[0005]在將上述技術應用于抑制或破壞質粒耐藥基因時，至少存在以下兩個技術難點： 1)耐藥基因本身對細菌的生存有利，破壞耐藥基因反而是對細菌的生存不利，因而必須"逆 向"突破生物基因演化的阻力；2)質粒拷貝數往往較高，相應耐藥基因拷貝數也同樣較高， 抑制破壞質粒耐藥基因必須研發更為強力的核酸剪輯工具。事實上，如果控制不好，耐藥 基因確實可以引發CRISPR系統的突變甚至大片段缺失，使之喪失功能而得以保存對細菌有 利的耐藥基因[7]。
[0006]基于上述背景，本研究選擇PET_28a上的kan為靶基因，利用生物信息學技術設計 了 3條引導RNA(gRNA)，研究了CRISPR/Cas系統在抑制質粒耐藥基因活性中的應用價值，獲 得了具有破壞kan基因活性的2條gRNA序列及其重組載體。
[0007] 參考文獻：
[0008] 1.李菁華，孫延波.噬菌體療法在耐藥性細菌感染中應用的研究進展.吉林大學學 報（醫學版），2013,39(3):630-633 ·
[0009] 2 .章昱，周云芳.細菌素的抗細菌耐藥研究及應用現狀.微生物學免疫學進展， 2015,43(6):76-79.
[0010] 3.李文月.細菌耐藥監測與抗菌藥物合理應用.中國現代藥物應用，2015，9(9): 147-150
[0011] 4.張鼎，李宏全，馬海利，等.雞源大腸桿菌耐藥性分析及中藥對大腸桿菌耐藥性 消除作用的研究.畜牧獸醫學報，2015,46(6) :1018-1025.
[0012] 5.PetersJM,SilvisMR,ZhaoD,HawkinsJS,GrossCA,QiLS.Bacterial CRISPR:accomplishmentsandprospects.CurrOpinMicrobiol.2015；27:121-126.
[0013] 6 .CarattoliA.Plasmidsandthespreadofresistance.IntJMed Microbiol.2013；303(6-7):298-304.
[0014] 7.Jiangff,ManivI,ArainF,ffangY,LevinBR,MarraffiniLA.Dealingwith theevolutionarydownsideofCRISPRimmunity:bacteriaandbeneficial plasmids.PLoSGenet.2013,9(9):el003844.

【發明內容】

[0015]本發明的目的在于構建一種消除卡那霉素耐藥基因活性的gRNA重組載體，以消除 生物體內耐藥細菌，解決細菌具有卡那霉素耐藥性的問題。
[0016]本發明還要解決的技術問題是提供該重組載體的構建方法。
[0017]為此，本發明的基本思路是:設計一種針對卡那霉素抗性基因kan的間區核酸序列 (即編碼gRNA的DNA序列），利用基因編輯新工具CRISPR/Cas9系統攜帶該間區核酸，去除重 組載體上的氯霉素抗性基因后轉化入減毒沙門菌等疫苗載體菌，重組菌與卡那霉素耐藥菌 共培養，重組菌細胞內的重組載體通過接合方式進入卡那霉素耐藥菌，有效抑制卡那霉素 抗性基因kan的活性，使原來耐藥的細菌在卡那霉素培養基上不能生長。
[0018]為了解決上述問題，本發明的技術方案如下：
[0019]本發明提供了一種消除卡那霉素耐藥基因活性的重組載體，其特征在于，包括消 除了氯霉素抗性的pCas9載體和針對卡那霉素抗性基因kan的gRNA核酸序列，所述gRNA核酸 序列命名為KR58或KR208,其具體核酸序列分別如下：
[0020] KR58:GCCGCGATTAAATTCCAACA;或者
[0021] KR208:CAATGATGTTACAGATGAGA。
[0022] 本發明還提供了一種構建上述消除卡那霉素耐藥基因活性的gRNA重組載體的方 法，其特征在于，包括如下步驟：
[0023] 1)設計具有如上所述的核酸序列的kan基因特異性gRNA序列；
[0024] 2)構建含有步驟1)所設計的gRNA序列的重組載體，構建步驟主要包括:a)根據步 驟1)所設計的任意一個核酸序列(本發明中，KR58或者KR208)，人工合成一對單鏈DNA片段；b)對步驟a)中所得的序列組合磷酸化后退火形成雙鏈DNA片段;c)酶切pCas9質粒后，進行 瓊脂糖凝膠回收;d)將步驟c)得到的pCas9質粒與步驟2)獲得的雙鏈DNA片段連接，得到重 組載體；
[0025] 3)去除重組載體中的氯霉素抗性基因，以避免應用于機體時引入新的耐藥基因， 即氯霉素耐抗性基因。
[0026]進一步地，上述步驟3)中的用于去除重組載體中的氯霉素抗性基因的引物的核酸 序列(劃線部分為BglII識別位點)為：
[0029]該方法雖然在本發明中僅針對卡那霉素，但其原理和方法很容易引申應用于消除 其他抗生素抗性基因。
[0030]本發明的技術方案達到了如下的有益效果：
[0031] 1)針對"破壞耐藥基因會對細菌的生存不利，必須"逆向"突破生物基因演化的阻 力"的技術難點，本發明設計并篩選了特異性強的kan特異性gRNA，預測了脫靶效應以及與 靶基因的結合能力，構建了重組載體，并經實驗結果的實踐驗證，獲得了2條有效的gRNA，達 到了有效抑制卡那霉素抗性基因kan的活性。
[0032] 2)本發明采用可對DNA雙鏈進行剪輯的核酸酶Cas9的表達載體，插入gRNA獲得重 組載體。一方面利用了CRISPR/Cas9系統在基因編輯中的高效性，另一方面以質粒形式來 產生可切割靶基因的Cas9-gRNA復合體，因質粒可自我復制，拷貝數較高，因此也可抑制高 數量的靶基因。
[0033] 3)本發明可用于開發具有消除耐藥細菌的功能益生菌或疫苗載體菌產品，具有重 要的市場價值，可望產生良好的社會和經濟價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本發明方法構建的重組載體pCas9ACam_KR58。
[0035] 圖2是本發明方法構建的重組載體pCas9ACam_KR208。
【具體實施方式】
[0036]為了闡明本發明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明 做進一步的介紹。
[0037]實施例1:
[0038] 本實施例1為重組載體pCas9ACam_KR58和pCas9ACam_KR208的構建方法。
[0039] 1 ·kan基因特異性gRNA的設計：
[0040] pET28a為常用商品化分子克隆載體。直接選取pET28a中kan基因序列進行gRNA靶 點掃描，獲得75個潛在gRNA序列靶位點。遵循盡量減少脫靶幾率以及盡量增強與靶基因結 合的親和力的原則，經過對這些潛在位點進行宿主菌基因組脫靶分析，選取若干脫靶幾率 低而高親和力結合靶基因的gRNA序列，并經過隨后的實驗研究驗證，確定了兩個具有理想 的降解kan基因活性的gRNA序列，分別命名為KR58和KR208，其具體核苷酸序列分別如下：
[0043] 2 ·pCas9_KR58 和pCas9_KR208 的構建：
[0044] 使用pCas9載體(Addgene)用于克隆和轉錄針對特定祀基因的gRNA，并編碼Cas9蛋 白。特異性gRNA可引導Cas9蛋白切割和降解靶基因。構建方法包括如下具體步驟：
[0045] 1)為將KR58和KR208分別克隆進pCas9，人工合成以下兩對單鏈DNA片段：
[0050]2化1?財磷酸化：對1(1?58?與1(1?581?組合用了4?疆磷酸化后退火形成雙鏈0麻片段KR58 ;KR208F與KR208R組合用T4PNK磷酸化后退火形成雙鏈DNA片段KR208;
[0051 ]gRNA磷酸化體系包括：10xT4Buffe