硒衍生的核酸復合物的結構測定方法
【專利摘要】本發明提供使與核酸復合的所關注的分子，如多肽結晶的方法，其包括使該所關注的分子與硒衍生的核酸接觸和使該所關注的分子/硒衍生的核酸復合物結晶。還提供測定所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的X射線晶體結構的方法。通常，X射線晶體結構測定的方法包括該硒衍生的核酸的硒單波長異常定相。在一些實施例中，不從另一晶體提供用于該所關注的分子的該X射線晶體結構的各相。還公開通過向細胞或個體投予功能性核酸和/或通過使核酸酶與功能性核酸接觸影響生物過程的方法，其中該功能性核酸為硒衍生的核酸。
【專利說明】砸衍生的核酸復合物的結構測定方法
[0001] 關于聯邦贊助的研究或開發的聲明
[0002] 本發明在美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的撥款號 R01GM095881和美國國家科學基金會(National Science Foundation)授予的撥款號MCB- 0824837和CHE-0750235的政府支持下進行。政府在本發明中享有一定權利。
技術領域
[0003] 本發明一般為X射線晶體學和藥物發現的領域;且更確切地說，包括具有核酸的蛋 白質和/或小分子(配體)復合物的分子-核酸結構的晶體學，其通過硒衍生的核酸測定。獲 得的結構信息可用于基于核酸的藥物的發現。
【背景技術】
[0004] X射線晶體學為用于提供晶體中的分子的外觀的三維表示的已建立、充分研究的 技術。此技術仍為用于分子結構的原子分辨測定的最強大工具中的一個。結構中的結晶原 子導致X射線束衍射到許多特定方向。通過測量這些衍射束的角度和強度，檢晶器可產生晶 體內的電子密度的三維圖像。由此電子密度，可測定晶體中的原子的平均位置，以及其化學 鍵、其無序性和各種其它信息。
[0005] 由于許多材料可形成晶體-如鹽、金屬、礦物質、半導體以及各種無機、有機和生物 分子-科學家已采用X射線晶體學來測定許多分子的晶體結構。方法展現許多生物分子，包 括維生素、藥物、小分子、配位體、蛋白質多肽和核酸的結構和功能。X射線晶體結構也可解 釋材料的不尋常的電子或彈性特性、闡明化學相互作用和方法或充當設計針對疾病的藥物 的基礎。
[0006] 為了進行X射線晶體學分析，X射線束撞擊單一晶體，產生散射光束。當這些光束落 在一片膜或其它檢測器上時，其產生點的衍射圖案；隨著晶體逐漸旋轉而記錄這些光束的 強度和角度。每一點稱作反射，因為其對應于來自晶體內的一組均勻間隔開的平面的X射線 的反射。晶體中的原子并非靜態的，而是通常以一埃的小于十分之幾在其平均位置周圍振 蕩。X射線晶體學允許測量這些振蕩的尺寸。
[0007] 衍射自分子的晶體的X射線產生衍射"點"的圖案，其中每一點對應于互逆晶格中 的一點，表示具有幅度和相對相的波。對應于互逆晶格的結構因子也對應于晶體學"單位晶 胞"內的電子密度分布。對應于結構因子的電子密度可通過逆傅立葉變換（inverse Fourier transformation)測定。適用電子密度圖的計算需要組合觀測的幅度與適當的相。
[0008] 測定用于結構因子的相仍為分子，如蛋白質和復合物的晶體學分析的最具挑戰性 的障礙。尋求使得能夠測定待用于結構分析中的X射線衍射數據的相的新方法。
[0009] 核酸在生物系統中起多種重要作用，包括轉移和調芐基因信息（巴尼(Ban)等人， 科學，289:905-920(2000))。此外，核酸(尤其RNA)可折疊到界限分明的三維結構中且催化 如蛋白質合成的方法和一些病毒的生命周期中的生化反應。也已經由體外選擇識別具有催 化和結合功能的RNA和DNA。此外，不同生物中的非編碼小RNA的近來發現已大大擴展核酸的 功能譜（史托斯（Storz)，科學，296:1260-1263(2002);李（Lee)等人，科學，294:862-864 (2001))。此大量的生物活性RNA和DNA已促進闡明其三維結構和功能關系的結構分析領域 中的研究新前沿。
[0010] 作為所有生命系統中普遍存在的生物分子，核酸為重要藥物標靶，且其也可用于 診斷學和治療學。
[0011] 由于含有分子/核酸復合物的晶體的產生和衍射質量的問題，核酸和其結合到的 分子的X射線晶體學分析通常困難且可為時間和勞力密集型的。
[0012] 因此，本發明的目標為提供產生晶體和測定與核酸復合的所關注的分子，如蛋白 質的X射線晶體結構的組合物和方法。
[0013] 本發明的另一目標為提供選擇和設計可結合到與或可與核酸復合的所關注的分 子，如蛋白質的分子的組合物和方法。
[0014] 本發明的另一目標為提供所關注的分子，如蛋白質與硒衍生的核酸的復合物。

【發明內容】

[0015] 提供使與核酸復合的所關注的分子(如多肽)結晶的方法，其包括使所關注的分子 與硒衍生的核酸接觸和使所關注的分子/硒衍生的核酸復合物結晶。還提供測定所關注的 分子/硒衍生的核酸復合物的X射線晶體結構的方法。通常，X射線晶體結構測定的方法包括 硒衍生的核酸的硒單波長異常定相。在一些實施例中，不從另一晶體提供用于所關注的分 子的X射線晶體結構的各相。
[0016] 在一些實施例中，復合物可包括一種或多種額外組分。舉例來說，復合物可包含所 關注的分子、硒衍生的核酸和配位體或結合分子。舉例來說，可使用結合到所關注的分子和 硒衍生的核酸中的任一個或這兩個的化合物。小分子配位體和候選藥物為可使用的額外組 分的實例。
[0017] 在一些實施例中，在含有硒衍生的核酸復合物的晶體的情況下獲得的X射線晶體 學數據的衍射的分辨率大于在不含硒衍生的核酸的晶體的情況下獲得的晶體學數據。在其 它實施例中，所關注的分子在不存在硒衍生的核酸的情況下不結晶。通常，硒衍生的核酸為 硒衍生的RNA。在一些實施例中，硒衍生的核酸以與并非硒衍生的核酸至少相同的親和力結 合到目標分子，如多肽。在一個實施例中，硒衍生的核酸與并非硒衍生的核酸結合目標分子 的相同區域。在一些實施例中，所關注的分子為核酸結合蛋白。
[0018] 測定與硒衍生的核酸復合的所關注的分子(如蛋白質）的結構的方法包括從含有 含有所關注的分子/硒衍生的核酸的復合物的一種或多種晶體獲得衍射數據集和通過硒衍 生的核酸的硒單波長異常定相測定所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維X射線晶體 結構。還提供識別所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維X射線晶體結構中的所關注的 分子與硒衍生的核酸之間的聯接元件的方法。方法也可包括通過在數字計算機上提供所關 注的分子/硒-衍生的核酸復合物的三維X射線晶體結構選擇分子，如候選藥物，其干擾所關 注的分子與核酸之間的相互作用，和選擇預測結合所關注的分子/硒衍生的核酸復合結構 中識別的核酸界面的化合物。
[0019] 還提供設計結合到所關注的分子(如核酸結合蛋白）的分子(如候選藥物)的方法。 通常，方法包括在數字計算機上提供所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維晶體結構 和使用數字計算機包含的軟件設計預測結合到所關注的分子的分子，如候選藥物。在一些 實施例中，方法包括合成分子和評估分子改變所關注的分子的活性的能力。
[0020] 還提供選擇含有硒衍生的核酸的晶體的方法，其包括在含有硒衍生的核酸的溶液 中生長晶體和選擇明顯不同于對照晶體的晶體，指示存在硒衍生的核酸。
[0021] 還提供所關注的分子和硒衍生的核酸的復合物。還提供多肽和硒衍生的核酸的復 合物。
[0022] 還公開影響生物過程的方法，該方法包含向細胞或個體投予功能性核酸，其中功 能性核酸為硒衍生的核酸。還公開通過使核酸酶與功能性核酸接觸而影響生物過程的方 法，其中功能性核酸為硒衍生的核酸。
[0023] 在方法的一些形式中，功能性核酸可為適體、反義核酸、siRNA、shRNA或crRNA。在 方法的一些形式中，功能性核酸可結合到或影響所關注的分子。在一些形式中，功能性核酸 可為核酸酶的底物或輔因子。在一些形式中，輔因子可為底物引導序列(或引導物），其引導 核酸酶以裂解底物(RNA或DNA)。在一些形式中，相比于在存在并非硒衍生的對應核酸的情 況下，核酸酶的催化活性在存在硒衍生的核酸的情況下增加。舉例來說，比較催化活性可為 在存在對應天然核酸的情況下的核酸酶的催化活性。核酸酶可為任何類型或形式的核酸 酶。
【附圖說明】
[0024]圖1A、圖1B和圖1C顯示與硒修飾的DNA和RNA雙螺旋體復合的RNA酶Η的晶體結構。 (A)在1 JO Α分辨率下測定的硒-DNA/RNA/RNA酶Η三元復合物的總體結構(D132Ν突變體； H)B ID:3TWH)。蛋白質顯示為帶狀圖；RNA鏈以球棍型式顯示于左側，與蛋白質結構重疊;且 DNA鏈以球棍型式顯示于右側，從結構突出。球體表示如所指示的Mg2+離子和Se原子。裂解位 點通過箭頭指示。（B)天然和修飾DNA和RNA的序列。SeG和SG分別表示6-Se-G和6-5-6。（〇6_ Se-脫氧鳥苷衍生的Se-DNA。
[0025] 圖2A和圖2B顯示與DNA/RNA雙螺旋體（具有相同序列）復合的RNA酶H(D132N突變 體）的結構。（A) Se-DNA/RNA/RNA酶Η結構(PDB ID: 3TWH; 1名〇 A分辨率，從這項工作）。Se結 構(3TWH)中的裂解位點在這兩個Mg2+離子之間，通過箭頭指示。RNA鏈以球棍型式顯示于圖 式中心，與蛋白質結構重疊。DNA鏈以球棍型式顯示于底部。（B)天然DNA/RNA/RNA酶Η結構 (PDB ID: 2G8U; 2,70 Α 分辨率）（諾沃特尼（Nowotny)和楊，2006)。DNA(5 ' -ATGTCG-3 '）和RNA (5'-UCGACA-3'）的序列在所有結構中相同。RNA鏈以球棍型式顯示，與蛋白質重疊且突出到 圖式的右下方。DNA鏈以球棍型式顯示，與RNA結構重疊且突出到圖式的左下方。在兩種結構 中，蛋白質均顯示為帶狀圖。球體表示如所指示的Mg2+離子和Se原子。
[0026] 圖3A、圖3B和圖3C顯示與RNA酶Η復合的Se-DNA/RNA雙螺旋體的細微構形改變(或 局部細微解旋）。(A)經由RNA酶Η的活性位點處的Se-dG3/rC5堿基對(在3TWH中）與dA3/rU10 (在1ZBI中）的比較顯示的雙螺旋體的局部細微解旋。（B)顯示局部主鏈移動的結構比較。結 構以與圖3A中相同的定向顯示。兩種結構（1ZBI和3TWH)中緊鄰易裂開的磷酸鹽的rA/T堿基 對(標記為與T4/T4配對的A4/A9)幾乎一致。（C) C/SeG堿基對(rC5/dG3)的電子密度圖；2F〇- Fc圖在1.5〇層級成形。
[0027]圖4Α和圖4Β顯示Se-DNA/RNA底物的易裂開的磷酸鹽朝向RNA酶Η活性位點的移動。 水和Mg2+離子顯示為球形。（A)D132N突變體· Se-DNA/RNA和D132N突變體· DNA/RNA的疊加 顯示裂解位點相互作用隨著距離而突顯。（B)提出的引導依賴性RNA裂解通過易裂開的磷酸 鹽和局部細微解旋促進。易裂開的磷酸鹽的Rp-氧原子與親核水分子形成氫鍵。如所示，Se 修飾的復合結構的氫鍵值為3.1 A和2.9 A。
[0028] 圖5顯示RNA底物通過RNA酶Η的"假特異性"裂解。短天然和修飾的RNA底物在存在 短天然和修飾的DNA引導物的情況下的RNA酶Η裂解(參見圖1中的序列）。在反應物中，RNA底 物的濃度等于天然、單Se、雙Se、單S或雙S修飾的DNA的濃度。截短RNA酶Η(59-196)也用于這 些實驗，且獲得類似結果。（圖Α)天然RNA在存在天然和修飾的DNA的情況下通過RNA酶Η的裂 解。（圖Β)通過RNA底物(RNA-S1，Sp非對映異構體)的Sp-硫修飾的裂解抑制。（圖C)通過RNA 底物(RNA-S2，Rp非對映異構體)的Rp-硫修飾的裂解抑制。（圖D)通過用Mn2+陽離子置換Mg2+的Sp-RNA裂解的恢復。（圖E)在存在DNA引導物，包括天然DNA-N、DNA-S和DNA-Se的情況下通 過RNA酶Η的RNA水解。使用這些模板的反應速率的相對值為:DNA-N( 1)、DNA-S(1.6)和DNA- Se(6.2)。
【具體實施方式】
[0029] 蛋白質和蛋白質-核酸復合物的X射線晶體結構通常通過硒衍生的（即硒代甲硫氨 酰)蛋白質，經由多波長或單波長異常衍射(MAD或SAD)定相測定。MAD定相為經由解決相問 題促進生物巨分子(如DNA或藥物受體)的三維結構的測定的用于X射線晶體學的技術。已發 現用硒原子取代核酸堿基中的羰基氧的方法。亦已發現硒衍生的核酸保留非衍生核酸的結 合特征。亦已發現與所關注的分子(如多肽)復合的硒衍生的核酸可幫助結晶和此類復合物 的結構的X射線晶體學測定。公開使與核酸復合的所關注的分子(如多肽)結晶的方法，其包 含以下步驟：（a)使所關注的分子與硒衍生的核酸接觸，和(b)使所關注的分子/硒衍生的核 酸復合物結晶。方法可進一步包含測定所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的X射線晶體結 構的步驟。X射線晶體結構測定可包含硒衍生的核酸的硒單波長異常定相。
[0030] 亦公開測定所關注的分子(如多肽)與核酸之間的相互作用的方法，其包含以下步 驟：（a)使所關注的分子與硒衍生的核酸接觸；（b)使所關注的分子/硒衍生的核酸復合物結 晶；（c)測定所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維X射線晶體結構，其中X射線晶體結 構測定的方法包含硒衍生的核酸的硒單波長異常定相;和(d)識別所關注的分子/硒衍生的 核酸復合物的三維X射線晶體結構中的所關注的分子與硒衍生的核酸之間的聯接元件。 [0031 ]方法可進一步包含選擇分子，如候選藥物，其干擾所關注的分子與核酸之間的相 互作用。分子可通過(a)在數字計算機上提供所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維X 射線晶體結構;和(b)選擇預測結合所關注的分子/硒衍生的核酸復合結構中識別的核酸界 面的化合物來選擇。
[0032] 方法可進一步包含設計分子，如候選藥物，其結合到所關注的分子。分子可通過 (a)在數字計算機上提供所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維晶體結構;和(b)使用 數字計算機包含的軟件設計預測結合到所關注的分子的分子來設計。
[0033] 方法可進一步包含(a)合成分子;和（b)評估分子改變所關注的分子的活性的能 力。
[0034] 在方法的一些形式中，在硒衍生的核酸復合物的情況下獲得的X射線晶體學數據 的衍射的分辨率可大于在不存在硒衍生的核酸的情況下獲得的晶體學數據。在方法的一些 形式中，所關注的分子在不存在硒衍生的核酸的情況下不結晶。在方法的一些形式中，不從 另一晶體提供用于所關注的分子的X射線晶體結構的各相。在方法的一些形式中，所關注的 分子不是核酸結合蛋白。
[0035] 還公開選擇含有硒衍生的核酸的晶體的方法，其包含以下步驟：（a)在含有硒衍生 的核酸的溶液中生長晶體;和(b)選擇著色為黃色，指示存在硒衍生的核酸的晶體。在方法 的一些形式中，含有硒衍生的核酸的晶體的顏色相比于不含硒衍生的核酸的對照晶體的顏 色。在方法的一些形式中，硒衍生的核酸可與所關注的分子復合。在方法的一些形式中，硒 衍生的核酸可與多肽復合。
[0036] 在方法的一些形式中，硒衍生的核酸可為硒衍生的RNA。在方法的一些形式中，硒 衍生的核酸可以與并非硒衍生的核酸至少相同的親和力結合到所關注的分子。在方法的一 些形式中，硒衍生的核酸可與并非硒衍生的核酸結合所關注的分子的相同區域。
[0037] 還公開所關注的分子與硒衍生的核酸的復合物。還公開多肽和硒衍生的核酸的復 合物。
[0038] I.定義.
[0039]除非另外規定，否則本文中所用的所有技術和科學術語具有與所公開的本發明所 屬領域的技術人員通常所了解相同的含義。本文中所引用的公開案和其所針對引用的材料 專門以引用的方式并入。
[0040] 術語DNA結合蛋白是指包含DNA結合域且因此對于單鏈或雙鏈DNA具有特異性或一 般親和力的蛋白質。示例性DNA結合蛋白為調節轉錄過程的轉錄因子、各種聚合酶、裂解晶 體內的DNA分子的核酸酶和參與細胞核中的染色體包裝和轉錄的組蛋白。
[0041] 術語聯接元件是指硒衍生的核酸與其結合的蛋白質之間的相互作用可能需要的 元件。
[0042]術語多波長異常衍射(MAD)定相是指促進生物巨分子(例如DNA、藥物受體）的三維 結構的測定的技術。此方法不需要用于獨特相求解的兩種晶體結構（一種天然且一種具有 重原子）。取而代之，在同步加速器設施處記錄相干X射線光的不同波長下的異常衍射。 [0043]術語核酸結合蛋白是指含有核酸、DNA或RNA結合域且因此對于核酸、DNA或RNA具 有特異性或一般親和力的蛋白質。示例性核酸結合蛋白為DNA結合蛋白和RNA結合蛋白。 [0044]術語相是指相對于起點的波的最大值的位置。
[0045] 術語所關注的分子是指任何化合物或分子，包括生物分子，如維生素、藥物、小分 子、配位體、蛋白質、多肽和核酸。
[0046] 術語所關注的分子/硒衍生的RNA復合物是指形成于硒衍生的RNA和所關注的分子 之間的復合物。
[0047] 術語多肽/硒衍生的RNA復合物是指形成于硒衍生的RNA和所關注的多肽之間的復 合物。
[0048] 術語衍射的分辨率是指分子的電子密度中的特征的清晰度，以及關于原子位置的 確定性。分辨率越大，圖像質量越好。
[0049] 術語RNA結合蛋白是指含有RNA結合域且因此對于RNA具有特異性或一般親和力的 蛋白質。示例性RNA結合蛋白為參與替代性拼接、RNA編輯、聚腺苷酸化、核輸出、mRNA定位和 翻譯的控制的蛋白質。
[0050]術語硒衍生化是指使用硒置換甲硫氨酸中的硫或核苷酸中的氧以分別模擬甲硫 氨酸或天然核苷酸。硒可因此用作核酸的結構和功能研究的原子探針。
[0051 ]術語硒衍生的核酸是指含有硒而不是氧的核酸。
[0052]術語硒衍生的DNA是指含有硒而不是氧的DNA。
[0053]術語硒衍生的RNA是指含有硒而不是氧的RNA。
[0054]術語shRNA是指短發夾RNA，形成緊密發夾環的RNA結構，其也可用于經由RNA干擾 使基因表達沉默。shRNA發夾結構通過細胞機制裂解為小干擾RNA(siRNA)，其接著結合到 RNA誘導的沉默復合物(RISC)。此復合物結合到且裂解mRNA，其匹配結合到其的siRNA。
[0055]術語單波長異常衍射(SAD)定相是指促進所關注的分子，如蛋白質或其它生物巨 分子的結構的測定的技術。相比于多波長異常衍射(MAD)，SAD使用單一適當波長下的單一 數據集。該技術的一個優勢為使通過晶體而在射束中花費的時間最小化，因此減少收集數 據時對分子的潛在輻射損害。
[0056] 術語siRNA是指小干擾RNA，通常18到30個核苷酸，優選地20到25個、更優選地21到 23個或大致22個核苷酸雙鏈RNA。優選地，至少一個鏈具有1到5個、優選地1到3個或2個核苷 酸的5 '和/或3 '突出端。s iRNA參與RNA干擾路徑，其中s iRNA干擾特定基因的表達。
[0057] 術語三維X射線晶體結構是指由X射線晶體學產生的結構(與上文的"晶體"同義）。
[0058] 術語X射線晶體學是指用于測定晶體的原子和分子結構的方法，其中結晶原子導 致X射線束衍射到許多特定方向。通過測量這些衍射束的角度和強度，檢晶器可產生晶體內 的電子密度的三維圖像。
[0059] 術語X射線衍射是指涉及在遇到晶體內的分子的原子時衍射且散射的來自X射線 源的X射線流的技術。
[0060] II.組合物 [0061 ] A.硒衍生的核酸
[0062] 公開的組合物和方法利用硒衍生的核酸。選擇性置換核酸的核苷酸殘基中的氧原 子產生硒衍生的核酸。此類硒衍生的核酸的用途和優點描述于本文中。
[0063] 核堿基上的硒原子特異性置換（哈桑（Has san)等人，美國化學學會志 (J.Am.Chem.Soc) ,132:2120-2121(2010);林(Lin)等人，化學會評論(Chem.Soc.Rev.) ,40: 4591-4602(2011);沙龍（Salon)等人，核酸研究（Nucleic Acids Res.) ,36:7009-7018 (2008);沙龍等人，美國化學學會志，129:4862-4863(2007);盛（Sheng)等人，核酸研究，40: 8111-8118(2012);孫（Sun)等人，核酸研究，40:5171-5179(2012);張（Zhang)等人，亞洲化 學雜志（Chem. Asian J.)，7:476-479(2012))可用于產生硒衍生的核酸。
[0064] B.功能性核酸
[0065] 硒衍生化和硒衍生的核酸可體現在功能性核酸中。用硒取代核酸中的一個或多個 氧原子或核酸中的一個或多個核苷酸殘基可提供具有適用特性，如改進的雜交精確性、熱 穩定性、化學、生物化學和生物穩定性、活性效率、促進的結晶、促進的相測定和增強的高分 辨率晶體結構測定的核酸。
[0066] 功能性核酸為具有特定功能，如結合目標分子、充當酶底物或輔因子或催化特定 反應的核酸分子。舉例來說，功能性核酸可結合靶核酸(RNA或DNA)或可充當酶底物引導序 列（或引導物）。功能性核酸分子可分成以下類別，其不打算是限制性的。舉例來說，功能性 核酸包括反義分子、適體、核酶、三鏈形成分子、RNA干擾(RNAi)、CRISPR(成簇的規律間隔的 短回文重復序列）RNA(crRNA)和外部引導序列。功能性核酸分子可充當目標分子具有的比 活性的效應劑、抑制劑、調節劑和刺激劑，或功能性核酸分子可具有獨立于任何其它分子的 重新(de novo)活性。
[0067]功能性核酸分子可與任何巨分子，如DNA、RNA、多肽或碳水化合物鏈相互作用。通 常，功能性核酸經設計以基于目標分子與功能性核酸分子之間的序列互補性與其它核酸相 互作用。在其它情況下，功能性核酸分子與目標分子之間的特異性識別不是基于功能性核 酸分子與目標分子之間的序列互補性，而更確切地是基于形成允許特異性識別發生的三級 結構。
[0068]反義分子經設計以經由典型或非典型堿基配對與目標核酸分子相互作用。反義分 子與目標分子的相互作用經設計以經由例如RNA酶Η介導的RNA-DNA混合降解促進目標分子 的破壞。或者，反義分子經設計以中斷通常將發生于目標分子上的處理功能，如轉錄或復 制。反義分子可基于目標分子的序列設計。存在許多通過發現目標分子的最可及區域而使 反義效率最佳化的方法。示例性方法將為使用DMS和DEPC的體外選擇實驗和DNA修飾研究。 優選的是反義分子以小于或等于10-6、10-8、10-1()或10- 12的解離常數(Kd)結合目標分子。幫助 反義分子的設計和使用的方法和技術的代表樣品可見于美國專利第5，135,917、5,294， 533、5,627，158、5,641，754、5,691，317、5,780,607、5,786，138、5,849,903、5,856，103、5， 919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013， 522、6,017,898、6,018,042、6,025，198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6， 057,437 號中。
[0069]三鏈形成功能性核酸分子為可與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當三鏈分子與 目標區域相互作用時，形成稱作三鏈的結構，其中存在取決于沃森-克里克(Watson-Crick) 和胡斯坦(Hoogsteen)堿基配對而形成復合物的DNA的三條鏈。三鏈分子由于其可以高親和 力和特異性結合目標區域而為優選的。優選的是三鏈形成分子以小于10-6、10-8、ΙΟ#或10 ^12的Kd結合目標分子。如何制造和使用三鏈形成分子以結合多種不同目標分子的代表性實 例可見于美國專利第5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834， 185、5,869,246、5,874,566和5,962,426號中。
[0070]基因表達也可經由RNA干擾(RNAi)以高度特異性方式有效地沉默。此沉默最初在 添加雙鏈RNA(dsRNA)的情況下觀測到（費爾，A. (Fire,A.)等人，自然(Nature) ,391:806-11 (1998);那波利，C(Napoli，C)等人，植物細胞(Plant Cell),2:279-89(1990);漢農，G.J. (Hannon，G.J.)，自然，418:244-51(2002))。一旦dsRNA進入細胞，其通過RNA酶III樣酶 Dicer裂解成為在3'末端上含有2個核苷酸突出物且長度為21-23個核苷酸的雙鏈小干擾 RNA(siRNA)(艾爾巴希爾，S.M. (Elbashir，S.M.)等人，基因與發育(Genes Dev. ),15:188- 200(2001);伯恩斯坦，E. (Bernstein，E.)等人，自然，409: 363-6(2001);哈蒙德，S.M. (Hammond，S. Μ.)等人，自然，404:293-6(2000))。在ATP依賴性步驟中，siRNA變得整合到通 常稱為RNAi誘導沉默復合物(RNAi induced silencing complex;RISC)的多亞單位蛋白質 復合物中，其將811^引導到目標1^序列（尼卡寧人（咐1?_11人）等人，細胞((^11)，107:309-21 (2001))。在一些點，siRNA雙螺旋解旋，且看起來反義鏈通過核酸內切酶和核酸外切 酶的組合保持結合到RISC且引導互補mRNA序列的降解（馬丁尼茲，J. (Martinez，J.)等人， 細胞，110:563-74(2002))。但是，RNAi或siRNA的效應或其用途不限于任何類型的機制。 [0071]小干擾RNA(siRNA)為可誘導序列特異性轉錄后基因沉默，進而減少或甚至抑制基 因表達的雙鏈RNA。在一個實例中，s i RNA在s i RNA與目標RNA兩者之間的序列一致性區域內 觸發同源RNA分子，如mRNA的特異性降解。舉例來說，W0 02/44321公開當與3'突出末端堿基 配對時能夠序列特異性降解目標mRNA的siRNA，制造這些siRNA的方法以引用的方式并入本 文中。序列特異性基因沉默可使用模擬通過酶dicer產生的siRNA的合成短雙鏈RNA在哺乳 動物細胞中實現(艾爾巴希爾，S.M.等人，自然，411:494 498(2001) ;Ui-Tei，K.等人，歐洲 生物化學學會聯合會快報(FEBS Lett)，479:79-82(2000))。siRNA可為化學或體外合成的 或可為細胞內部中的短雙鏈發夾樣RNA(shRNA)被處理成為siRNA的結果。合成siRNA-般使 用算法和常規DNA/RNA合成器設計。供應商包括安必遜（Ambion)(德克薩斯州奧斯汀 (Austin，Texas))、化學基因（ChemGenes)(馬薩諸塞州亞什蘭(AshlandMassachusetts))、 達爾馬肯（Dharmacon)(科羅拉多州拉斐特（Lafayette，Colorado))、格倫研究（Glen Research)(弗吉尼亞州斯特林(Sterling,Virginia))、MWB生物技術(MWB Biotech)(德國 埃伯斯貝格(Esbersberg，Germany))、普羅麗格(Proligo)(科羅拉多州博爾德(Boulder， Colorado))和凱杰（Qiagen)(荷蘭文托（Vento，The Netherlands)) diRNA也可使用試劑 盒，如安必遜SILENC'ER^siRNA構筑試劑盒于體外合成。
[0072]與RNAi類似，CRISPR(成簇的規律間隔的短回文重復序列）干擾為經由選擇性DNA 裂解用于減少內源性表達的蛋白質的基因表達的有效方法。
[0073] CRISPR為含有由獨特間隔子分離的直接重復序列的基因元件，該等間隔子中的許 多個與噬菌體和其它外來基因元件中發現的序列相同。近來的工作已展示CRISPR在適應性 免疫中的作用且顯示衍生自CRISPR的小RNA(crRNA)實施為用于外來DNA的靶向干擾的歸巢 寡核苷酸(季聶克(Jinek)等人，科學（Science)，337:816-821(2012) hcrRNA用于在基因級 選擇性地裂解DNA。
[0074]當功能性核酸充當酶輔因子時，輔因子可例如為底物引導序列（或引導物），其引 導核酸酶以裂解底物(RNA或DNA)。
[0075] III.使用方法
[0076] A.X射線晶體學的方法
[0077]已發現硒（Se)衍生的核酸可用于經由Se-核酸多重異常衍射(MAD)定相測定核酸 和其與所關注的分子(如蛋白質和配位體）的復合物的X射線晶體結構。描述使用硒衍生的 核酸和其與所關注的分子的復合物的X射線晶體結構的增強結晶和結構測定的方法。
[0078] 硒衍生的核酸可用于提供測定其結合到的所關注的分子(如蛋白質）的晶體結構 的相位信息。提供使用硒衍生的核酸以提供RNA/DNA-分子復合物的定相信息的方法。
[0079] 此外，通過獲自硒衍生的核酸的相測定的X射線晶體結構可用于基于結構的藥物 設計和候選藥物選擇。
[0080] 1.結晶
[0081] X射線晶體學的技術具有三個基本步驟。第一和通常最困難的為獲得研究中的材 料的足夠晶體。晶體應足夠大(通常在所有尺寸中大于0.1mm)、組成為純的且結構為常規 的、不具有顯著內部缺陷。
[0082]在第二步中，晶體置于通常單波長的強X射線束中，產生規則反射圖案。隨著晶體 逐漸旋轉，前述反射消失且出現新反射;在晶體的每一定向記錄每一點的強度。可能必須收 集多個數據集，其中每一集合覆蓋略微大于晶體的完全旋轉的一半且通常含有數萬反射。 [0083]在第三步中，這些數據與互補化學信息在計算上組合以產生和細化晶體內的原子 的布置的模型。原子布置的最終、經細化的模型-現稱作晶體結構-通常存儲在公共數據庫 中。
[0084] 本文所公開的方法和組合物可用于實現、增強或優化結晶過程。蛋白質結晶為用 于獲得蛋白質的原子三維結構的廣泛使用的技術。但是，不可能預測最優結晶條件，且必須 對于每一蛋白質獨立地測定以產生經受高分辨率X射線衍射的晶體。因此，結晶通常代表對 巨分子，如蛋白質和蛋白質復合物的結構測定的阻礙。
[0085] 因此，在一些實施例中，公開的硒衍生的核酸用于促進其所連接的所關注的分子， 如蛋白質或配位體的結晶。核酸可與蛋白質、多肽和其它配位體相互作用以形成具有改變 的結構特征和特性的復合物。核酸可引起與其相互作用的肽、蛋白質或其它配位體的構形 變化。因此，如果硒衍生的核酸誘導或另外賦予對于與其相互作用的肽、蛋白質或其它配位 體的結晶有利的結構特性，那么出于結晶的目的，期望與硒衍生的核酸形成復合物。幫助結 晶過程的結構特性可包括寡聚狀態;分子、肽、蛋白質或其它配位體的區域的增加或減少的 靈活性;分子、肽、蛋白質或其它配位體的區域的增加或減少的剛度;改變的溶解性;改變的 疏水性或結合到其它分子、肽、蛋白質或配位體的能力。
[0086] 與分子、蛋白質、多肽或其它配位體復合的硒衍生的核酸的結晶可相比于對照物。 典型對照物包括具有并非硒衍生的等效核酸的相同分子、蛋白質、多肽或其它配位體的復 合物。
[0087] 在一些實施例中，與硒衍生的核酸的復合物形成對照物不形成的晶體。在一些實 施例中，與硒衍生的核酸的復合物提供相比于對照物增強的晶體成核。在其它實施例中，含 有硒衍生的核酸的晶體提供相比于對照物較大的X射線衍射的分辨率。
[0088] 蛋白質的結晶中的另一挑戰為識別含有所需靶蛋白質或蛋白質復合物的晶體。含 有復合物的蛋白質鹽、污染物、降解產物或單一底物的晶體可延遲或阻止靶蛋白質的晶體 學測定。上述情況可適用于其它目標分子。因此，視覺識別含有硒衍生的核酸的晶體的能力 可幫助選擇和篩選含有衍生RNA或DNA的復合物。硒衍生的核酸可例如通過具有不同顏色而 視覺上不同于并非硒衍生的核酸。在一些實施例中，具有硒衍生的核酸的復合物的晶體視 覺上不同于對照物的晶體。在一些實施例中，含有硒衍生的核酸的晶體的顏色差異使得能 夠快速選擇含有硒衍生的核酸的晶體。
[0089] 含有硒衍生的核酸的晶體可通過包括(但不限于）以下的方法產生:核酸與所關注 的分子(如蛋白質）的共結晶、純化核酸/分子復合物的結晶或通過將所關注的分子的晶體 浸泡到含有硒衍生的核酸的溶液中。
[0090] 2.結構測定
[0091] 本文所公開的方法和組合物可用于實現、增強或優化結構測定。測定硒基-甲硫氨 酸衍生的蛋白質的X射線晶體結構的方法為所屬領域中眾所周知的。在從單一晶體收集SAD 或MAD數據集之后，硒原子可通過直接方法定位且相可類似于得到確認的蛋白質策略進行 測定（埃爾卡亞姆（Elkayam)等人，細胞，150:100-110(2012);費雷-德阿瑪雷（Ferre-D' Amare)等人，自然，395:567-574(1998);亨德里克森，科學（Science) ,254:51-58(1991);亨 德里克森，生物化學科學趨勢（Trends Biochem.Sci .) ,25:637-643(2000);西爾勒 (Schirle)和麥克雷(MacRae)，科學，336:1037-1040(2012);楊（Yang)等人，科學，249: 1398-1405(1990))。
[0092] 與蛋白質中的硫原子的硒取代類似，核酸中的氧原子可經硒原子置換，因為硒和 氧也在相同元素家族中。此Se原子特異性衍生化也被稱為Se原子特異性突變誘發（Se atom-specific mutagenesis; SAM)。SAM可用于提供對蛋白質和蛋白質復合物的結構和功 能兩者的新洞察。
[0093] 測定相的方法為所屬領域中已知的且包括使用類似分子的先前結構信息和同形 置換的分子置換來以已知方式，例如通過包括具有大原子數的重原子改變結構因子。在分 子內包括重原子將顯著增加 X射線的散射。散射強度的差異將很大程度上反映重原子的散 射貢獻，且這些差異可用于測定重原子在電子密度圖內所位于的位置。重要的是包括重原 子不另外改變分子結構，以使得能夠同形置換。
[0094] 提供測定與硒衍生的核酸的復合的目標分子結構的三維結構的方法，其中目標分 子的三維結構并非已知的。在一些實施例中，方法適用于僅基于衍生核酸內的硒原子的識 別測定結合核酸的分子的X射線晶體結構。
[0095] 因此，提供使用硒衍生的核酸以提供用于結合到硒衍生的核酸的分子復合物的晶 體學測定的定相信息的方法。方法可涉及記錄來自含有硒衍生的核酸的晶體的相干X射線 光的不同波長下的X射線的異常衍射和定位硒原子以測定結合到核酸的分子的相位信息。 在一些實施例中，分子為酶。此類酶可包括(但不限于)RNA和DNA結合酶。示例性RNA結合酶 為RNA酶H。在某些實施例中，目標分子的結構并非已知。在一些實施例中，目標分子為革巴蛋 白質。在一些實施例中，靶蛋白質的氨基酸序列不含氨基酸甲硫氨酸。在其它實施例中，靶 蛋白質的氨基酸序列含有小于5%、小于3%或小于1%甲硫氨酸。在一些實施例中，靶蛋白 質的氨基酸序列與晶體結構存在的最類似蛋白質的氨基酸序列的一致性為小于60%、小于 50%、小于40%、小于30%、小于20%或小于10%。
[0096] 在一些實施例中，含有硒衍生的核酸的復合物的X射線晶體結構用于例如基于結 構的藥物設計的方法中。在一些實施例中，X射線晶體結構用于測定復合物的生物功能。通 過這些方法識別的分子的結構信息可用于例如用于治療組合物中的藥物的設計、識別或選 擇。在一些實施例中，方法使得能夠較快處理和增加三維結構的發現的通量（出于藥物設計 的目的）。
[0097] 產生和測定含有硒衍生的核酸的晶體的三維座標的所述方法具有使用衍生核酸 內的硒方便地測定相的優勢。在一些實施例中，方法使得能夠測定與DNA或RNA相互作用的 所關注的分子(如蛋白質）的晶體結構。在某些實施例中，在同步加速器設施處進行晶體學 數據收集。數據收集可在冷凍溫度以上進行。數據收集也可在〇°C溫度，如在液氮(在大致- 190°C下），或在液氦(在大致_270°C下）的溫度下進行。
[0098] B.使用經改變核酸的方法
[0099]硒原子除其在結構研究中的效用以外，也可為經由選擇性氧置換特異性并入核酸 中以用于功能研究的原子。
[0100]核酸為對于所有已知生命形式必需的的聚合巨分子。包括脫氧核糖核酸(DNA)和 核糖核酸(RNA)的核酸由稱為核苷酸的單體制得。每一核苷酸具有三種組分:5個碳的糖、磷 酸基和含氮堿基。如果糖為脫氧核苷，那么聚合物為DNA。如果糖為核糖，那么聚合物為RNA。 [0101] RNA也可包括非編碼RNA(ncRNA)，尤其為如小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核 糖體RNA (rRNA)、轉移RNA (tRNA)、小核仁RNA (sη〇 RNA)、短發夾 RNA (shRNA)和小核 RNA (snRNA)〇
[0102] 已測定硒衍生的核酸可改變核酸相互作用的蛋白質的活性。通常，蛋白質為催化 核酸的結構變化的酶。在一些實施例中，在硒衍生的核酸內硒的存在不改變與核酸的三級 結構相關的生物功能。
[0103] 與核酸的三級結構相關的生物功能可包括(但不限于）與核酸或蛋白質（如酶）的 相互作用。在一些實施例中，硒的存在賦予增加核酸的半衰期或結構剛度的核酸的三級結 構的變化。通常，衍生聚核苷酸內的硒的存在不抑制、阻止或減少衍生核酸與蛋白質，如RNA 或DNA結合酶的相互作用。在某些實施例中，硒衍生的核酸增加如RNA或DNA結合酶的蛋白質 的催化速率。在一個實施例中，硒衍生的核酸的酶催化通過DNA/RNA雙螺旋的局部細微解旋 促進。細微結構變化可例如將RNA易裂開的磷酸鹽移動到較接近酶活性位點。
[0104]因此，提供在改變核酸結合蛋白的活性中使用硒衍生的核酸的方法。舉例來說，可 通過向細胞或個體投予功能性核酸影響生物過程，其中功能性核酸為硒衍生的核酸。作為 另一實例，可通過使核酸酶與功能性核酸接觸影響生物過程，其中功能性核酸為硒衍生的 核酸。
[0105] 在方法的一些形式中，功能性核酸可為適體、反義核酸、siRNA、shRNA或crRNA。在 方法的一些形式中，功能性核酸可結合到或影響所關注的分子。在一些形式中，功能性核酸 可為核酸酶的底物或輔因子。在一些形式中，輔因子可為底物引導序列(或引導物），其引導 核酸酶以裂解底物(RNA或DNA)。在一些形式中，相比于在存在并非硒衍生的對應核酸的情 況下，核酸酶的催化活性在存在硒衍生的核酸的情況下增加。舉例來說，比較催化活性可為 在存在對應天然核酸的情況下的核酸酶的催化活性。核酸酶可為任何類型或形式的核酸 酶。因此，公開的硒衍生的核酸可用于影響或改變核酸酶的活性，如通過增加核酸酶的催化 活性。在功能性核酸，如siRNA、shRNA、miRNA、crRNA、tracrRNA和引導序列的情況下，硒衍生 形式可影響或改變功能性核酸的核酸調節、編輯等。
[0106] 核酸酶可為任何類型或形式的核酸酶。舉例來說，核酸酶可為核酸內切酶、核酸外 切酶、核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、轉錄活化子樣效應核酸酶 (transcription activation-like effector nuclease;TALEN)、鋅指核酸酶、RNA誘導的 沉默復合物（1?13(])、船銷酶（4坪〇仙1^6)、0;[。61'酶、0?13?1?相關（0?13?1?-&880(^&七6(1;0已8) 核酸酶、限制酶、大范圍核酸酶、RNA酶A、RNA酶Η、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶 Τ1、RNA 酶 Τ2、RNA酶 U2、RNA酶V、RNA酶VI、RNA 酶PhyM、RNA酶 II、RNA 酶R、RNA 酶PH、RNA 酶D、RNA 酶T、多核苷酸磷酸化酶(RNPase)、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II、微 球菌核酸酶、S1核酸酶、P1核酸酶、肽基轉移酶23S rRNA、第I族內含子、第II族內含子、GIR1 分支酶、先導酶、發夾核糖核酸酶、纏繞核糖核酸酶、錘頭狀核糖核酸酶、HDV核糖核酸酶、哺 乳動物CPEB3核糖核酸酶、VS核糖核酸酶、glmS核糖核酸酶或CoTC核糖核酸酶。核酸酶的組 合可經靶向。核酸酶的組合可用硒衍生的核酸引導。
[0107] 實例
[0108] 材料和方法·
[0109] A.寡核苷酸和蛋白質制備和結晶.
[0110]天然和實驗室中合成的修飾DNA或RNA寡核苷酸（沙龍等人，核酸研究，36 :7009- 7018(2008))在具有和不具有DMTr保護基團的情況下通過HPLC純化兩次以保證高純度。蛋 白質表達(諾沃特尼(Nowotny)等人，細胞，121:1005-1016(2005);諾沃特尼和楊，歐洲分子 生物學雜志（Embo J·)，25:1924-1933(2006))是在BL21 (DE3;pLys E · coli ;購自茵維特羅 根（Invi trogen))中進行。通過熱休克方法實現轉型。DNA/RNA雙螺旋體(5 ' -ATGTCGp-3 7 V5'-UCGACA-3' ：兩個末端處的單堿基突出物）的DNA部分經衍生。在與RNA酶Η共結晶之前， 經純化Se-DNA(5 ' -AT-SeG-TC-SeGp-3，）和RNA(5，UCGACA_3 '）通過加熱混合物到90°C 后維持 lmin，接著使其緩慢冷卻到25 °C而以1:1摩爾比結合。所得Se-DNA/RNA雙螺旋體與蛋白質 (最終濃度:8mg/mL)在存在5mM MgCl2的情況下以1:1摩爾比混合。Se-DNA/RNA雙螺旋體與 RNA酶Η的共結晶通過用凱杰經典套件試劑盒(QIAGEN Classics Suite Kit)(www. ·com)篩 選實現。通過在25°C下使用沉滴式蒸氣擴散方法，晶體易于獲自結晶篩選的混合物[緩沖 液:0.1M MES，pH 6.5;沉淀劑：12%(w/v)，PEG 20000]。
[0111] B. MAD數據收集、定相和結構測定.
[0112] Se-DNA/RNA/RNA酶Η復合物的晶體衍射數據采集于布魯克海文國家實驗室 (Brookhaven National Laboratory)的國家同步加速器光源(NSLS)中的光束線Χ25和Χ29。 多種晶體經掃描以發現在硒的K邊緣吸收處具有強異常散射的晶體。25%甘油用作低溫保 護劑，而X射線數據在99°K下在液氮流下收集。每一晶體在一度旋轉下每圖像暴露15秒，且 每一數據集獲取總共180個圖像。兩個晶體用于收集MAD/SAD數據集。所有數據使用HKL2000 和DENZO/SCALEPACK處理（奧汀諾夫斯基（Otwinowski)和邁納（Minor)，酶學方法 (Meth·Enzymol)，276:307-326( 1997))。結構通過使用程序Solve/Resolve的MAD方法解析 (特維萊格(Terwilliger)，酶學方法，374: 22-37(2003);王(Wang)等人，結晶學報，D輯-生 物晶體學(Acta Crystallogr.D.Biol ·Crystallogr.) ,60:1244-1253(2004))。所得模型使 用CCP4i內的Refmac5細化。DNA/RNA雙螺旋體使用Coot模型化為結構。使用Coot自動或手動 添加金屬離子和水分子。
[0113] C.通過RNA酶Η的催化水解·
[0114] DNA與其互補RNA允許通過加熱和后續冷卻形成雙螺旋體。每一 RNA酶Η水解反應物 (體積5yL)含有DNA模板（150ηΜ最終濃度;DNA-N、DNA-S或DNA-Se)和32Ρ標記的RNA底物(冷和 熱RNA的混合物；150ηΜ最終濃度）。向每一水解反應物添加 WT或TR RNA酶Η酶（1 ΟηΜ，最終)和 反應緩沖液（最終條件：75mM KCl，50mM Tris-HCl，pH 7.8,3mM MgCl2和ImM二硼烷）。除非 另外提及，否則反應物在37°C下培育30min。
[0115] 實例1: Se-DNA/RNA/RNA酶Η復合物的結晶、Se異常定相和結構測定。
[0116] 我們已合成Se修飾的DNA以研究DNA/RNA/RNA酶Η復合物。天然和Se修飾的寡核苷 酸的雙螺旋體(沙龍等人，核酸研究，36:7009-7018(2008))與RNA酶Η(具有單一D132N突變 的非活性突變體)復合。RNA酶H/RNA/Se-DNA的復合物(5 '-UCGACA-3 '/5 '-AT-SeG~TC-SeGp- 3'）在含有0.說1^(?!16.5)和沉淀劑（12%?八別6 20000)的緩沖液中結晶。晶體也使用 沉滴式蒸氣擴散方法生長。晶體在一周內出現且在一個月內達到其最大尺寸。兩個晶體用 于收集MAD/SAD數據集。個別SAD定相數據的優值相對低，其可能不產生用于模型的良好電 子密度圖。一個SAD數據組用作其它衍射數據集的MAD定相的參考。初始相的總優值(FOM)為 0.630,其產生可解譯的電子密度圖。來自含有Se-寡核苷酸的蛋白質復合晶體的異常衍射 數據可在硒K邊緣處收集。在從單一晶體收集SAD或MAD數據集之后，硒原子可通過直接方法 定位且相可類似于得到確認的蛋白質策略進行測定(埃爾卡亞姆等人，細胞，150:100-110 (2012);費雷-德阿瑪雷(Ferre-D 'Amare)等人，自然，395:567-574(1998);亨德里克森，科 學，254: 51-58(1991);亨德里克森，生物化學科學趨勢，25:637-643(2000);西爾勒和麥克 雷，科學，336:1037-1040(2012);楊等人，科學，249:1398-1405( 1990))。
[0117] Se-復合物結構最后經由硒異常信號和MAD定相測定（3TWH;L:8〇 A分辨率；圖1)。 由于使用非活性突變酶，RNA底物不在結晶期間裂解，其通過晶體的MS分析確認。此外，Se- 復合物結構已通過MAD定相和分子置換兩者測定。通過MAD定相技術測定的Se-復合物結構 與通過分子置換測定的相同復合物結構相同。相比于具有相同序列的對應天然結構（具有 2.70 A分辨率的2G8U)，含Se結構具有較高結構分辨率。
[0118] 實例2:通過核堿基上的硒原子的RNA/DNA底物雙螺旋體的細微構形改變。
[0119] 通過利用核堿基上的硒原子特異性置換（哈桑（Hassan)等人，美國化學學會志 (J.Am.Chem.Soc) ,132:2120-2121(2010);林(Lin)等人，化學會評論(Chem.Soc.Rev.) ,40: 4591-4602(2011);沙龍（Salon)等人，核酸研究（Nucleic Acids Res.) ,36:7009-7018 (2008);沙龍等人，美國化學學會志，129:4862-4863(2007);盛（Sheng)等人，核酸研究，40: 8111-8118(2012);孫（Sun)等人，核酸研究，40:5171-5179(2012);張（Zhang)等人，亞洲化 學雜志(Chem.Asian J.) ,7:476-479(2012))，研究RNA/DNA雙螺旋體和構形改變對催化水 解的影響。與在位置6的鳥苷處經硒修飾的R N A / D N A復合的耐鹽桿菌（B a c i 11 u s ha 1 odurans) RNA酶Η的晶體結構（圖1)測定于1,80 分辨率下。RNA酶Η為序列非特異性酶， 且其在不同位置處結合RNA為可能的。除了通過就天然雙螺旋而言的兩個核苷酸移動結合 到Se修飾的雙螺旋的RNA酶H，Se衍生的復合結構幾乎與具有相同RNA/DNA序列的對應天然 復合結構相同（圖2)(諾沃特尼等人，歐洲分子生物學雜志，27:1172-1181(2008);諾沃特尼 等人，細胞，121:1005-1016(2005)) ANA酶Η的活性位點位于Se修飾的雙螺旋體中的RNA分 子的A4與C5之間的磷酸鹽鍵處，其中C5與DNA序列的SeG3配對（圖1A和圖1B)<X5 5'-磷酸鹽 明顯為易裂開的磷酸鹽。相反，與對應天然RNA/DNA雙螺旋體(PDB ID:2G8V和2G8U)復合的 RNA酶Η的活性位點（諾沃特尼等人，細胞，121:1005-1016(2005);諾沃特尼和楊，歐洲分子 生物學雜志，25:1924-1933(2006))位于經由多個RNA/DNA雙螺旋體的堆疊形成的假纖維中 的兩種不同RNA分子中的A6與U1之間的界面處。
[0120] 晶體結構指示Se修飾的短RNA/DNA雙螺旋體（3 ' -ACAGCU-575 ' -AT-SeG-TC-SeGp- 3 '）導致形成底物-RNA酶Η復合物（圖1A和圖2A)，而非最初經設計且由對應天然RNA/DNA底 物雙螺旋體(2G8V和2G8U)形成的產物-RNA酶Η復合物。底物-RNA酶Η復合物(PDB ID: 1ZBI; 1 85 A分辨率）的結構用較長RNA/DNA雙螺旋底物（諾沃特尼等人，細胞，121:1005-1016 (2005);諾沃特尼和楊，歐洲分子生物學雜志，25 :1924-1933(2006))測定，如12-bp RNA/ DNA雙螺旋體(5'-GAATCAGGTGTC-3'/3'-CUUAGUCCACAG-5'），其中兩個RNA酶Η分子經結合。 不管RNA酶Η結合位點的移動，Se-DNA/RNA雙螺旋體保持與對應天然雙螺旋體極類似的總體 結構。但是，當比較Se修飾的底物-酶復合物(PDB ID:3TWH)與天然底物-RNA酶Η復合物（圖 3A，H)B ID: 1ΖΒΙ)時，已觀測到Se-dG3/rC5堿基對的細微構形改變(改變0.5-0.7Α)。這兩種 結構中緊鄰易裂開的磷酸鹽的rA/T堿基對幾乎一致(圖3B)。
[0121 ]實例3:底物將其易裂開的磷酸鹽移動到RNA酶Η活性位點。
[0122] 通過核堿基上的硒原子的小構形改變造成DNA/RNA雙螺旋體的局部細微解旋。一 致地，晶體結構研究（圖4)指示細微解旋導致較接近RNA酶Η活性位點的易裂開的磷酸鹽的 小移動。Se修飾的復合物中的rC5的5 ' -磷酸鹽（易裂開的磷酸鹽）由于DNA/RNA雙螺旋體的 局部細微解旋而朝向RNA酶Η的活性中心移動大致0.3 A。在高分辨率（1.80 A)下測定Se- DNA/RNA/RNA酶Η復合物（PDB ID:3TWH)，且估計的總體座標誤差為大致〇,] A。此復合物 (3TWH)視為底物-酶復合物(Se-復合物），其與在高分辨率下測定的另一底物-酶復合物(天 然復合物，含有D132N突變）（PDB ID:1ZBI;1.85人分辨率)相關(諾沃特尼等人，細胞，121: 1005-1016(2005);諾沃特尼和楊，歐洲分子生物學雜志，25:1924-1933(2006))。因此，比較 這兩種結構允許觀測Se-復合物相對于天然復合物的主鏈移動。底物結構的細小改變(如 1 A的幾分之一)對于催化足夠且可促進反應的加速，其已在異檸檬酸脫氫酶催化的情況下 觀測到(梅塞卡爾(Mesecar)等人，科學，277:202-206(1997))。
[0123] 實例4:易裂開的磷酸鹽與親核水形成氫鍵。
[0124] Mg2+_A與易裂開的磷酸鹽的pro-Sp氧的距離在天然和Se修飾的結構兩者中保持相 同（2.3 A)(圖4A)。相比之下，Mg2+-B與易裂開的磷酸鹽的pro-Sp和3'氧原子的距離(分別 為2.6和A)相比于天然復合物中的距離在Se修飾的結構中縮短〇,2 A (圖4A) <^2+-Β與 這兩種氧原子之間縮短的距離指示其較強相互作用，這與催化的RNA裂解一致。距離的變化 也與Mg2+-B的B-因數一致，其高于天然和Se修飾的結構兩者中的Mg2+-A的B-因數。這指示Mg 2+-B在結構和催化中均比Mg2+-A更動態。
[0125] 類似地，親核水與緊鄰易裂開的磷酸鹽的3'-磷酸鹽的pro-Rp氧之間的氫鍵(長度 為2.9 A)相比于天然系統中的氫鍵較強且較短(0.2 A)。相反，此親核水分子與Mg2+-A之間 的距離(2,4 A)長0.3 A。減弱與Mg2+-A結合的親核試劑且增強與緊鄰易裂開的磷酸鹽的3'- 磷酸鹽的去質子化pro-Rp氧的Η鍵與易裂開的磷中心上的親核水的"線上"攻擊一致（圖4)。 親核水分子極為接近(3.4 Α)易裂開的磷中心。有趣的是，此親核水分子也接近易裂開的磷 酸鹽的pro-Rp氧（3.丨0 A ),且其形成真氫鍵。此Η鍵可幫助定位結構中的親核水分子。
[0126] 實例5:用于RNA酶Η催化裂解的RNA/DNA最小底物。
[0127] 不同于使用12bp RNA/DNA雙螺旋體的天然底物-酶復合物(PDB ID:1ZBI)，其中 RNA酶Η可結合大于一個位點，短Se-DNA/RNA底物(具有5個堿基對；圖1)由于其最小尺寸而 僅允許一個RNA酶Η分子結合。有趣的是，具有小尺寸的此雙螺旋底物迫使RNA酶Η以"假特異 性"方式與RNA/DNA雙螺旋體相互作用。基于晶體結構，預測RNA酶Η在C5的5 磷酸鹽處裂解 RNA底物且僅提供兩個片段，即5 ' -產物(5 ' -UCGA-3 '）和3 ' -產物(5 ' -pCA-3 '）。這通過RNA底 物消化確認。RNA酶Η產生一個5'-產物（圖5A)，且裂解產物的放射強度等于起始物質的強 度。
[0128] 基于晶體結構（圖4)，也預測C5 5'-磷酸鹽處的硫修飾（如非橋聯氧原子的硫置 換)可顯著抑制RNA裂解。正如所料，C5 5'-磷酸鹽的S-修飾(置換pro-Sp或pro-Rp氧原子） 的確阻止RNA底物裂解(圖5B和圖5C)。易裂開的磷酸鹽的pro-Sp氧的硫取代破壞與兩種Mg2+離子的相互作用（圖5B)，而易裂開的磷酸鹽的pro-Rp氧的硫置換破壞易裂開的磷酸鹽與親 核水分子之間的相互作用。因此，兩種硫修飾均抑制RNA裂解(圖5B和圖5C)。
[0129]值得注意的是，通過從Mg2+轉變為Mn2+陽離子的補償實驗由于重新建立陽離子(Μη 2+)與Sp-硫原子之間的相互作用（圖4和圖5D)而可有效地恢復Sp修飾的RNA的裂解（圖5D)。 這些結果證實晶體結構結論:C5 5'-磷酸鹽的確為裂解位點。此最小底物為解決雙螺旋構 形對引導物依賴性RNA裂解的影響的原子特異性取代和動態研究提供了機會。RNA硫修飾的 實驗結果已展示易裂開的磷酸鹽的pro-Sp和pro-Rp氧原子均在RNA裂解中起重要作用，其 與計算研究和預測一致（德維沃（De Vivo)等人，美國化學學會志，130 :10955-10962 (2008);埃爾薩塞（Elsasser)和費爾斯（Fels)，物理化學化學物理 (Phys.Chem.Chem.Phys. )12:11081-11088(2010);羅斯塔(Rosta)等人，美國化學學會志， 133:8934-8941(2011))。
[0130] RNA酶Η為選擇性地消化RNA/DNA雙螺旋體的RNA部分的序列非特異性核酸內切酶 (施泰因（Stein)和哈森(Hausen),科學，166:393-395( 1969)) ANA酶Η參與許多重要生物過 程(阿諾德(Arnold)等人，自然，357:85-89(1992);格林(Green)等人，冷泉港定量生物學座 談會（Cold Spring Harb · Symp · Quant .Biol )，39:975-985( 1975);哈普邁爾（Hippenmeyer) 和格蘭金特(Grandgenett)，生物化學雜志（J·Biol.Chem·)，260:8250-8256(1985);翁特貝 格爾(Wintersberger)，藥理學與治療學(Pharmacol ·Ther ·) ,48:259-280( 1990))，包括從 復制中的岡崎片段(Okazaki fragment)去除RNA引物。其也可直接經由反義機制沉默基因 表達(維爾(Veal)等人，核酸研究，26:5670-5675 (1998);維科斯(Vi ckers)等人，生物化學 雜志，278:7108-7118(2003);瓦爾德(Walder)和瓦爾德，美國國家科學院院刊，85 :5011- 5015( 1988);吳(Wu)等人，生物化學雜志，279:17181-17189(2004))。已廣泛地進行對RNA酶 Η的催化研究，尤其為接近易裂開的磷酸鹽的金屬陽離子的作用的研究。最近，與RNA/DNA雙 螺旋底物復合的耐鹽桿菌RNA酶Η和人類RNA酶Η1的晶體結構分別在1.5和2,2 Α分辨率下測 定。這些結構提供對陽離子輔助的RNA水解的洞察(諾沃特尼等人，分子細胞(Mol.Cell)， 28:264-276(2007);楊等人，分子細胞，22:5-13(2006))。
[0131] 描述經由Se-核酸MAD定相測定的RNA酶H/RNA/Se-DNA的復合結構。RNA酶H/RNA/ DNA復合物用作使用Se衍生的核酸而非蛋白質展示晶體結構測定的原理論證的模型系統。 通過RNA酶Η的RNA裂解通過DNA/RNA雙螺旋體的局部細微解旋促進，進而將RNA易裂開的磷 酸鹽移動到較接近酶活性位點。此外，以實驗方式觀測到在存在RNA酶Η的情況下，易裂開的 磷酸鹽與水親核試劑形成氫鍵，因此幫助定位結構中的水分子。
[0132] 實例6: Se修飾的DNA加速通過RNA酶Η催化的RNA底物水解
[0133] 基于結構研究，假設由于促進的構形細微改變(或DNA/RNA雙螺旋體的局部細微解 旋），Se-DNA引導物可比對應天然DNA引導物較好地在催化RNA水解中幫助RNA酶Η。因此，通 過在存在天然和S-和Se-核堿基修飾的DNA的情況下的RNA酶Η進行RNA水解（圖1Β和圖5Ε)。 測量在存在天然(DNA-N)和修飾的DNA的情況下的相對反應速率。與此假設一致，RNA裂解中 的Se-DNA引導物(DNA-Se)比對應天然DNA有效得多（快6.2倍），同時S-DNA(DNA-S)比天然形 式有效1.6倍。實驗結果指示經由單原子核堿基修飾的細微構形改變可將易裂開的磷酸鹽 推向酶活性位點，進而顯著加快RNA裂解。
[0134] 除非另外規定，否則本文中所用的所有技術和科學術語具有與所公開的本發明所 屬領域的技術人員通常所了解相同的含義。本文中所引用的公開案和其所針對引用的材料 專門以引用的方式并入。
[0135]所屬領域的技術人員頂多使用常規實驗即可識別或能夠確定本文中所述的本發 明的特定實施例的許多等效物。此類等效物意圖由以下權利要求書涵蓋。
【主權項】
1. 一種使與核酸復合的所關注的分子結晶的方法，其包含以下步驟： (a) 使所述所關注的分子與硒衍生的核酸接觸;和 (b) 使所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物結晶。2. 根據權利要求1所述的方法，其進一步包含測定所述所關注的分子/硒衍生的核酸復 合物的X射線晶體結構的步驟。3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述X射線晶體結構測定包含所述硒衍生的核酸的 硒單波長異常定相。4. 根據權利要求2或3所述的方法，其中在所述硒衍生的核酸復合物的情況下獲得的所 述X射線晶體學數據的衍射的分辨率大于在不存在硒衍生的核酸的情況下獲得的晶體學數 據。5. 根據權利要求1到4中任一權利要求所述的方法，其中所述所關注的分子在不存在硒 衍生的核酸的情況下不結晶。6. 根據權利要求2到5中任一權利要求所述的方法，其中用于所述所關注的分子的所述 X射線晶體結構的相不提供自另一晶體。7. 根據權利要求1到6中任一權利要求所述的方法，其中所述所關注的分子為多肽。8. 根據權利要求1到7中任一權利要求所述的方法，其中所述所關注的分子不是核酸結 合蛋白。9. 一種測定所關注的分子與核酸之間的相互作用的方法，其包含以下步驟： (a) 使所述所關注的分子與硒衍生的核酸接觸； (b) 使所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物結晶； (c) 測定所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的三維X射線晶體結構，其中所述X射 線晶體結構測定方法包含所述硒衍生的核酸的硒單波長異常定相;和 (d) 識別所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的所述三維X射線晶體結構中的所述 所關注的分子與硒衍生的核酸之間的聯接元件。10. 根據權利要求9所述的方法，其進一步包含選擇干擾所述所關注的分子與所述核酸 之間的相互作用的候選分子，其中所述候選分子通過以下來選擇： (a) 在數字計算機上提供所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的所述三維X射線晶 體結構;和 (b) 選擇預測結合所述多肽/硒衍生的核酸復合結構中識別的核酸界面的候選分子。11. 根據權利要求9所述的方法，其進一步包含設計結合到所述所關注的分子的候選分 子，其中所述候選分子通過以下來設計： (a) 在數字計算機上提供所述所關注的分子/硒衍生的核酸復合物的所述三維晶體結 構;和 (b) 使用所述數字計算機包含的軟件來設計預測結合到所述多肽的候選分子。12. 根據權利要求11所述的方法，其進一步包含 (a) 合成所述候選分子;和 (b) 評估所述候選分子改變所述所關注的分子的活性的能力。13. -種選擇含有硒衍生的核酸的晶體的方法，其包含以下步驟： (a)在含有硒衍生的核酸的溶液中生長晶體； (b)選擇著色為黃色，指示存在硒衍生的核酸的晶體。14. 根據權利要求13所述的方法，其中含有硒衍生的核酸的晶體的顏色相比于不含硒 衍生的核酸的對照晶體的顏色。15. 根據權利要求13或14所述的方法，其中所述硒衍生的核酸與所關注的分子復合。16. 根據權利要求12到15中任一權利要求所述的方法，其中所述所關注的分子為多肽。17. 根據權利要求1到16中任一權利要求所述的方法，其中所述硒衍生的核酸為硒衍生 的 RNA 〇18. 根據權利要求1到17中任一權利要求所述的方法，其中所述硒衍生的核酸以與并非 硒衍生的核酸至少相同的親和力結合到所述所關注的分子。19. 根據權利要求1到18中任一權利要求所述的方法，其中所述硒衍生的核酸與并非硒 衍生的核酸結合所述所關注的分子的相同區域。20. -種所關注的分子與硒衍生的核酸的復合物。21. 根據權利要求20所述的復合物，其中所述所關注的分子為多肽。22. -種影響生物過程的方法，所述方法包含向細胞或個體投予功能性核酸，其中所述 功能性核酸為硒衍生的核酸。 2 3.根據權利要求2 2所述的方法，其中所述功能性核酸為適體、反義核酸、s i R N A或 ShRNA024. 根據權利要求22或23所述的方法，其中所述功能性核酸結合到或影響所關注的分 子。25. -種影響生物過程的方法，所述方法包含使核酸酶與功能性核酸接觸，其中所述功 能性核酸為硒衍生的核酸。26. 根據權利要求22、23或25中任一權利要求所述的方法，其中所述功能性核酸為用于 核酸酶的底物或輔因子。27. 根據權利要求26所述的方法，其中所述核酸酶可為核酸內切酶、核酸外切酶、核糖 核酸酶、去氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶、RNA 誘導的沉默復合物(RISC)、船蛸酶(Argonaute)、Dicer酶、CRISPR相關(Cas)核酸酶、限制 酶、大范圍核酸酶、RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶TI、RNA酶T2、 RNA酶U2、RNA酶V、RNA酶VI、RNA酶PhyM、RNA酶 II、RNA酶 R、RNA酶PH、RNA酶D、RNA酶T、多核苷 酸磷酸化酶(RNPase)、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II、微球菌核酸 酶、Sl核酸酶、Pl核酸酶、肽基轉移酶23S rRNA、第I族內含子、第II族內含子、GIRl分支酶、 先導酶、發夾核糖核酸酶、纏繞核糖核酸酶、錘頭狀核糖核酸酶、HDV核糖核酸酶、哺乳動物 CPEB3核糖核酸酶、VS核糖核酸酶、glmS核糖核酸酶或CoTC核糖核酸酶。28. 根據權利要求26或27所述的方法，其中相比于在存在并非硒衍生的對應核酸的情 況下的所述核酸酶的催化活性，所述核酸酶的催化活性在存在所述硒衍生的核酸的情況下 增加。29. 根據權利要求26到28中任一權利要求所述的方法，其中所述輔因子為引導核酸酶 以裂解底物的底物引導序列。
【文檔編號】G01N33/53GK105960410SQ201480073370
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】黃震
【申請人】硒瑞恩生物科技有限公司