專利名稱：一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。所述方法包括設計具有多種疾病特異性探針芯片、對帶有接頭的特異性目的DNA片段進行捕獲和富集、高通量測序、分析基因突變位信息等步驟。
背景技術：
各種模式生物基因組測序工作的完成，極大地提高了人們在基因水平對疾病致病機理和機體生理狀態的認識，也極大地促進了第二代高通量測序技術的發展。目前完成基因組組測序的生物有人、小鼠、大鼠、果蠅、水稻、大豆、擬南芥等。然后由于受到測序成本的限制，對個體進行基因組測序和疾病相關基因的鑒定和分析遠不能滿足日益發展的需要。單基因病是由一對等位基因控制的疾病或病理性狀，又稱孟德爾遺傳病或單基因遺傳病。目前已經發現的單基因病有6000多種，其中表形已知而分子基礎未知的疾病有 1700多種，而由于遺傳異質性，表型和致病分子基礎已知(約2900多種)的單基因病中，還有很多的亞型未被發現。基因是位于染色體上的遺傳單位，染色體有常染色體和性染色體之分，基因也有顯性基因與隱性基因之別，因此位于不同染色體上的致病基因具有不同的遺傳方式。通常，單基因病可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、χ伴性顯性遺傳病、χ伴性隱性遺傳病、Y伴性遺傳病等幾類。單基因病的檢測方法目前主要基于第一代測序技術，主要為以下幾種系譜分析、染色體核型分析、酶促反應及活性測定、RALF, SSCP (單鏈構象多態性)、M0LDI-T0F、 FISH(熒光原位雜交)、a-CGH(a-比較基因組雜交)、qPCR、MLPA(多重連接探針擴增)、 Sanger法等。上述方法中存在諸多缺點，比如系譜分析、染色體核型分析、酶促反應活性測定方法和FISH法分析方法都是染色體水平的檢測，準確性較低；RALF、SSCP和M0LDI-T0F 分析方法是間接檢測方法，不能直接反映位點的變化；a-CGH、qPCR、MLPA只能針對特定位點，不能對新發現的突變位點進行解讀，并且以上方法其測序通量很小，且要先經過PCR擴增過程。因此，雖然以Sanger法為基礎的第一代測序技術是目前單基因病檢測的金標準， 但是由于同時測序的樣本數很少，檢測的單基因病種類有限，僅限于一種或幾種，測序成本高昂，不能對多種已知分子基礎的單基因病進行同時檢測，大大限制了個體基因病的鑒定。目前本領域尚缺乏有效的測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。因此迫切需要針對已知的多種疾病的基因信息，開發新的檢測個體化的樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法及其應用。
本發明的另一目的 是提供一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒。在本發明的第一方面，提供了一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法，包括步驟a.提供一待檢測樣本，所述樣品含有經打斷的、源自基因組DNA的雙鏈核酸片段， 并且所述核酸片段具有平末端；b.對于上一步驟的所述雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；并且通過所述接頭連接序列，在所述雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引物結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；c.對步驟(b)獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引物和第二引物進行 PCR擴增，從而獲得第一 PCR擴增產物的混合物，其中所述的第一引物和第二引物具有對應于所述接頭的引物結合區的接頭結合區，以及位于接頭結合區外側的測序探針結合區；d.對所述的第一 PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，并用封閉分子封閉位于所述擴增產物兩端的、對應于第一引物和第二引物的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈擴增產物的混合物；e.用核酸芯片，從所述的經封閉的單鏈擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；f.對上一步驟中經捕獲的核酸分子，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二 PCR擴增產物的混合物，其中第三引物和第四引物分別特異性對應于或結合于所述的第一引物和第二引物；g.對上一步驟獲得的第二 PCR擴增產物的混合物進行測序，從而獲得樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。在另一優選例中，步驟(g)中將所述的第二 PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然后對所述測序簇用 “邊合成_邊測序”法進行測序，從而得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。在另一優選例中，步驟(a)的所述經打斷的、源自基因組DNA的雙鏈核酸片段長度為100-1000bp，平均長度為 800-1000bp。在另一優選例中，所述片段長度為150_500bp，較佳地為200_300bp。在另一優選例中，所述核酸片段具有的平末端是通過末端修復的方法制備。在另一優選例中，步驟(b)中的接頭連接序列為Poly(N)n，其中，各個N分別獨立地選自A、T、G或C，η為選自1-20的任一正整數。在另一優選例中，步驟(b)中所述的接頭連接序列為polyOV)n，其中，η為1-20的正整數，較佳地η = 1-2。在另一優選例中，步驟(b)中所述的接頭連接互補區序列為poly (N’)m，其中各N’ 分別獨立地選自A、T、G或C，m為1-20的正整數，并且poly (N)n和poly (N，)m為互補序列。在另一優選例中，m為選自1-3的任一正整數。在另一優選例中，所述的接頭連接互補區的長度與接頭連接序列的長度相同，即 poly (N) n和poly (N’)m為完全互補序列。在另一優選例中，所述的接頭連接互補區為poly (T)m，其中，m為1-20的正整數，較佳地m = 1-2。在另一優選 例中，步驟(c)中所述的第一引物和第二引物為長度30_80bp的寡核苷酸。在另一優選例中，第一引物和第二引物長度為55_65bp。在另一優選例中，所述的第一引物和第二引物是不同的，和/或所述的第三引物和第四引物是不同的。在另一優選例中，步驟(d)所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的70% -100%區域。在另一優選例中，步驟(d)中所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的100%區域。在另一優選例中，步驟(e)中所述的核酸芯片固定有5-200，000種對應于所述疾病的特異性探針。在另一優選例中，步驟(e)中所述芯片上特異性探針的種類為50-150，000種，更佳地 500-100, 000 種，最佳地 5000-80, 000 種。在另一優選例中，所述探針的序列對應于疾病致病基因的以下區域外顯子和/ 或外顯子前后兩端200bp。在另一優選例中，所述特異性探針的長度為20-120mer，較佳地，50-100mer，更佳地，60-80mer。在另一優選例中，所述特異性探針為全人工合成或體外克隆合成。在另一優選例中，步驟(f)所述的第三引物和第四引物分別特異性結合于所述的第一引物和第二引物的外側，并且長度小于第一引物和第二引物。在另一優選例中，所述的第三引物和第四引物長度為15_40bp，較佳地為 20-25bp。在另一優選例中，所述樣本來源于人、動物、植物，或微生物。在另一優選例中，所述待測樣本來源于人或非人哺乳動物，較佳地，來源于人。在另一優選例中，所述待測樣本含有人基因組DNA。在另一優選例中，所述疾病為孟德爾單基因病。在另一優選例中，所述疾病選自下組家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血癥、多指畸形、馬凡綜合癥、遺傳性舞蹈病、禿發、苯丙酮尿癥、胱氨酸尿癥、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合癥、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合癥、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。在本發明的第二方面，提供了一種可用于本發明第一方面所述方法的、用于測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒包括(1)第一容器以及位于容器內的核酸芯片；(2)第二容器以及位于容器內的接頭；(3)第三容器以及位于容器內的選自下組的引物(a)第一引物和/或第二引物； 或(b)第三引物和/或第四引物；(4)第四容器以及位于容器內的封閉分子；(5)檢測說明書。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括任選自下組的試劑用于進行PCR擴增所需的試劑、用于進行封閉反應所需的試劑、用于進行雜交反應所需的試劑、或其組合。在另一優選例中，所述疾病為孟德爾單基因病。 在另一優選例中，所述疾病選自下組家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血癥、多指畸形、馬凡綜合癥、遺傳性舞蹈病、禿發、苯丙酮尿癥、胱氨酸尿癥、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合癥、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合癥、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。在另一優選例中，所述的核酸芯片表面固定有選自下組的一種或多種探針探針1 序列如SEQ ID NO 7所示，捕獲位置112073411，檢測家族性腺瘤樣息肉；探針2 序列如SEQ ID NO 8所示，捕獲位置51479999，檢測多囊腎綜合癥；探針3 序列如SEQ ID NO 9所示，捕獲位置135766620，檢測節性腦硬化綜合癥；探針4 序列如SEQ ID NO 10所示，捕獲位置103231969，檢測苯丙酮尿癥；探針5 序列如SEQ ID NO 11所示，捕獲位置48700368，檢測馬凡綜合癥；探針6 序列如SEQ ID NO 12所示，捕獲位置31137199，檢測杜氏肌營養不良。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再--累述。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示了本發明一個實例中，可以同時檢測多種單基因病的流程圖。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立了一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。具體而言，本發明人根據現有疾病基因的信息，設計了固定有多種疾病特異性探針的核酸芯片；對待測樣本中片段化的、源自基因組DNA的雙鏈核酸分子的末端加入接頭，并進行富集；用核酸芯片對含接頭的DNA片段進行捕獲，將捕獲的片段在高通量測序平臺進行測序，基于已知的基因位點信息，對測序結果進行分析，得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。術語本文所用，術語“含有”包括“具有(comprise) ”、“基本上由...構成”和“由...構成”。單基因病如本文所用，“單基因病” 一詞是指由一對等位基因控制的疾病或病理性狀，又稱孟德爾遺傳病，可以分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、χ伴性遺傳病、Y伴性遺傳病。常染色體顯性遺傳病致病基因定位于常染色體上，常見的亞型完全顯性正常純合子和雜和子患者在表型上無差異；不完全顯性雜和子表現介于顯性純合子患者和正常人之間，常表現為輕病型；不規則顯型由于某種原因可使雜合子的顯性基因不表現出相應的癥狀；共顯性等位基因之間無顯性與隱性之分，在雜合體時都能表現兩種基因作用；延遲顯性雜合子在生命早期顯性基因不表達，待一定年齡后才表達；從性顯性雜合子的表達受性別的影響，在某一性別表達出相應的表現型，在另一性別不表達相應表現型。 常染色體隱性遺傳病的常染色體上的致病基因在雜合狀態時不表現相應的疾病，而只在純合子時才致病。定位于X染色體上的致病基因隨X染色體而遺傳疾病，包括X連鎖顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳。定位于Y染色體上的致病基因隨Y染色體而遺傳疾病。適用于本發明 篩查方法的單基因病包括但不限于家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血癥、多指畸形、馬凡綜合癥、遺傳性舞蹈病、禿發、苯丙酮尿癥、胱氨酸尿癥、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合癥、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合癥、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。外顯子如本文所用，“外顯子” 一詞是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對應于基因中的部分。內含子是在mRNA加工過程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外顯子和內含子都是對于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內含子，內含子沒有遺傳效應。探針如本文所用，“探針”一詞是指能夠檢測互補核酸序列的簡單DNA或RNA分子。探針必須是純凈的，而且不受其他不同序列核酸的影響。典型的探針是克隆的DNA序列或通過PCR擴增獲得的DNA，人工合成的寡核苷酸或從體外轉錄克隆DNA序列后獲得的RNA，也可以作為探針。探針長度可以從20-120mer，較佳地50-100mer，更佳地60-80mer。探針設計和合成方法為本領域技術人員所熟知，根據單基因病的已知的致病基因的外顯子及其前后兩端序列(較佳地前后200bp左右)，設計探針。在一個優選例中，探針長度50-80mer。 可以使用人工化學合成法合成探針或使用市售探針。一種典型的探針序列見表2。芯片如本文所用，“芯片”一詞是指可以采用微加工技術在芯片的基底材料上加工出各種微細結構，施加必要的生物化學物質并進行表面處理，將各種探針分子與表面固定化，制得含有大量探針的材料。本領域技術人員可以使用通用的方法獲得芯片。DNA芯片制備方法通常有4種。 第1種是光引導原位合成法，在微加工技術中用光刻工藝與光化學合成法相結合。第2種方法是化學噴射法，將合成好的寡核苷酸探針定點噴射到芯片上并加以固定化來制作DNA 芯片。第3種方法是接觸式點涂法，通過高速精密機械手的精確移動讓移液頭與玻璃芯片接觸而將DNA探針涂敷在芯片上。第4種方法是使用4支分別裝有A，T，G，C核苷的壓電噴頭在芯片上并行合成出DNA探針。本發明提供了一種表面固定有對應于已知基因特定序列探針的核酸芯片，所述芯片表面的探針種類可達數萬種，能一次對同一個待測樣品檢測多種疾病。DNA文庫及其制備如本文所用，“DNA文庫制備”一詞是指對基因組的目的片段進行打斷，獲得一組具有一定大小的DNA片段混合物。文庫的制備方法為本領域技術人員所熟知，包括(但不局限于)步驟1.提供一個待檢測樣本，所述樣品含有經打斷的、源自基因組DNA的雙鏈核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；2.對于上一步驟的所述雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；并且通過所述接頭連接序列，在所述雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引物結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；兩側3’端和5’端的接頭的引物結合區序列不同。3.對上一步驟獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引物和第二引物進行擴增，從而獲得PCR擴增產物的混合物，其中所述引物具有對應于所述接頭的引物結合區的接頭結合區，并且位于接頭結合區外側的測序探針結合區。在一個優選例中，還可以對打斷產物、末端修復產物、接頭產物和富集產物進行純化。純化條件及參數為本領域技術人員所熟知，對反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力范圍之內。外顯子捕獲如本文所用，術語“外顯子捕獲”，“芯片雜交”可互換使用，指的是對帶有疾病特異性探針的芯片對文庫中含有目標外顯子區域的DNA片段進行特異性選擇和結合的過程。DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕獲之前，DNA分子必須變為單鏈，一般是通過加熱使其變性而達到解鏈目的，解鏈的DNA分子被迅速冷卻，即保持單鏈狀態。文庫變性后在雜交平臺與芯片進行捕獲雜交。含有目標外顯子區域的DNA片段與固定在芯片上的探針之間在嚴格的條件下進行分子雜交。較佳地，芯片上探針分子的濃度要遠遠高于靶分子濃度。待雜交完畢后，通過變性等方法收集捕獲的序列并純化，得到來自捕獲后的序列混合物。本領域技術人員可以通過通用的方法進行外顯子捕獲和目的片段的洗脫和純化， 也可以應用市售(如德國Qiagen公司的MinElute PCR Purification kit)試劑盒進行上述過程。在一個優選例中，對待檢測的DNA文庫的PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，并用封閉分子封閉所述擴增產物中對應于第一引物和第二引物的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈擴增產物的混合物；用核酸芯片從所述的經封閉的單鏈擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；對經捕獲的核酸分子，用第三引物和第四引物進行擴增，從而獲得第二 PCR擴增產物的混合物，其中第三引物和第四引物分別特異性結合于所述的第一引物和第二引物；對上一步驟獲得的第二 PCR擴增產物的混合物進行測序，從而獲得樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。引物如本文所用，術語“引物”指的是能與模板互補配對，在DNA聚合酶的作用合成與模板互補的DNA鏈的寡聚核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引物的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復合物，從而進行擴增。在本發明中，幾類重要引物的序列和名稱見表1。表 權利要求
1.一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法，其特征在于，包括步驟a.提供一待檢測樣本，所述樣品含有經打斷的、源自基因組DNA的雙鏈核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；b.對于上一步驟的所述雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；并且通過所述接頭連接序列，在所述雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引物結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；c.對步驟(b)獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引物和第二引物進行PCR 擴增，從而獲得第一 PCR擴增產物的混合物，其中所述的第一引物和第二引物具有對應于所述接頭的引物結合區的接頭結合區，以及位于接頭結合區外側的測序探針結合區；d.對所述的第一PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，并用封閉分子封閉位于所述擴增產物兩端的、對應于第一引物和第二引物的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈擴增產物的混合物；e.用核酸芯片，從所述的經封閉的單鏈擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；f.對上一步驟中經捕獲的核酸分子，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二 PCR擴增產物的混合物，其中第三引物和第四引物分別特異性對應于或結合于所述的第一引物和第二引物；g.對上一步驟獲得的第二PCR擴增產物的混合物進行測序，從而獲得樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(g)中，將所述的第二PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇； 然后對所述測序簇用“邊合成_邊測序”法進行測序，從而得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的經打斷的、源自基因組 DNA的雙鏈核酸片段長度為100-1000bp，平均長度為800-1000bp ；較佳地，所述片段長度為150-500bp，較佳地為200-300bp。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述核酸片段具有的平末端是通過末端修復的方法制備。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的接頭連接序列為poly(N) n，其中，各個N分別獨立地選自A、T、G或C，η為選自1-20的任一正整數；較佳地，所述的接頭連接序列為Poly(A)n,其中，η為1-20的正整數，較佳地η = 1-2。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的接頭連接互補區序列為poly (N’)m，其中各N’分別獨立地選自A、T、G或C，m為選自1_20的任一正整數，并且 poly (N) n和poly (N，)m為互補序列；較佳地，m為選自1-3的任一正整數；或較佳地，所述的接頭連接互補區的長度與接頭連接序列的長度相同，即Poly(N)n* poly (N’)m*完全互補序列；或較佳地，所述的接頭連接互補區為poly (T)m，其中，m為1-20的正整數，更佳地m = 1-2。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的接頭連接序列為A，所述的接頭連接互補區序列為T。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的第一引物和第二引物為長度30-80bp的寡核苷酸；更佳地，第一引物和第二引物長度為55-65bp。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的第一引物和第二引物是不同的，和/或所述的第三引物和第四引物是不同的。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)中所述的封閉分子封閉第一PCR 擴增產物中對應于第一引物和第二引物的70% -100%區域；較佳地，步驟(d)中所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的100%區域。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中所述的核酸芯片固定有 5-200，000種對應于所述疾病的特異性探針；較佳地，步驟(e)中所述芯片上特異性探針的種類為50-150,000種，更佳地 500-100，000 種，最佳地 5000-80，000 種。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中所述探針的序列對應于疾病致病基因的以下區域外顯子和/或外顯子前后兩端200bp ；優選地，所述特異性探針的長度為20-120mer，較佳地，50-1 OOmer，更佳地，60_80mer。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有選自下組的一個或多個特征所述特異性探針為全人工合成或體外克隆合成；步驟(f)所述的第三引物和第四引物分別特異性結合于所述的第一引物和第二引物的外側，并且長度小于第一引物和第二引物；所述的第三引物和第四引物長度為15-40bp，較佳地為20-25bp ；所述樣本來源于人、動物、植物，或微生物；所述待測樣本來源于人或非人哺乳動物，較佳地，來源于人；所述待測樣本含有人基因組DNA ；所述疾病為孟德爾單基因病。
14.一種可用于權利要求1所述方法的、用于測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括(1)第一容器以及位于容器內的核酸芯片；(2)第二容器以及位于容器內的接頭；(3)第三容器以及位于容器內的選自下組的引物(a)第一引物和/或第二引物；或 (b)第三引物和/或第四引物；(4)第四容器以及位于容器內的封閉分子；(5)檢測說明書。
15.如權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述疾病為孟德爾單基因病；較佳地， 所述疾病選自下組家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血癥、多指畸形、 馬凡綜合癥、遺傳性舞蹈病、禿發、苯丙酮尿癥、胱氨酸尿癥、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、 遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合癥、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合癥、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。
16.如權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括選自下組的試劑用于進行PCR擴增所需的試劑、用于進行封閉反應所需的試劑、用于進行雜交反應所需的試齊U、或其組合；和/或所述的核酸芯片表面固定有選自下組的一種或多種探針 探針1 序列如SEQ ID NO :7所示，捕獲位置112073411，檢測家族性腺瘤樣息肉； 探針2 序列如SEQ ID NO 8所示，捕獲位置51479999，檢測多囊腎綜合癥； 探針3 序列如SEQ ID NO 9所示，捕獲位置135766620，檢測節性腦硬化綜合癥； 探針4 序列如SEQ ID NO 10所示，捕獲位置103231969，檢測苯丙酮尿癥； 探針5 序列如SEQ ID NO 11所示，捕獲位置48700368，檢測馬凡綜合癥； 探針6:序列如SEQ ID NO :12所示，捕獲位置31137199，檢測杜氏肌營養不良。
全文摘要
本發明涉及一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。所述方法包括對待測樣本中片段化的、源自基因組DNA的雙鏈核酸分子末端加入接頭，并進行富集；用核酸芯片對含接頭的DNA片段進行捕獲，將捕獲的片段在高通量測序平臺進行測序。基于已知的基因位點信息，對測序結果進行分析，可快速、高通量地得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列，從而用于例如單基因病的檢測。本發明還提供了可用于所述方法的、固定有數種至數萬種疾病特異性探針的核酸芯片，以及包含所述芯片的試劑盒。
文檔編號C12M1/34GK102329876SQ20111031133
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者朱倩, 楊光輝, 楊煥明, 汪建, 王俊, 謝姝琦, 陳洋, 魏曉明 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司