捕獲核酸的方法和測定的制作方法

文檔序號：580562閱讀(du)：267來源(yuan)：國知局

專利名稱：捕獲核酸的方法和測定的制作方法
技術領域：
本發明提供了包含酶促反應的序列特異性的核酸靶物捕獲方法和系統。更具體地，本發明包含，使用帽緣內切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢測靶核酸序列的基質(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復數種寡核苷酸探針。
背景技術：
核酸微陣列技術的出現，使得在非常小的區域、例如在顯微鏡載玻片上建立數百萬核酸序列的陣列成為可能(例如，US 6，375，903和US 5，143，854)。最初，通過把預先合成的 DNA序列印跡到載玻片上來建立這樣的陣列。但是，在US 6，375，903中所述的無掩膜陣列合成儀(MAS)的構建，現在允許直接在載玻片本身上原位合成寡核苷酸序列。使用MAS儀器，要在微陣列上構建的寡核苷酸序列的選擇是處于軟件控制之下，使得現在可能基于研究人員的特定需要，建立個別地定制的陣列。一般而言，基于MAS的寡核苷酸微陣列合成技術允許在標準顯微鏡載玻片的非常小的區域內平行合成超過400萬獨特寡核苷酸特征。由于可以利用數百生物的完整基因組(它們的參照序列已經普遍地儲存在公開數據庫中)，已經將微陣列用于執行從無數生物分離的核酸的序列分析。核酸微陣列技術已經應用于許多研究和診斷領域，諸如基因表達和發現、突變檢測、等位基因的和進化的序列對比、基因組繪圖、藥物發現和其它。許多應用需要跨整個人基因組搜索遺傳性變體和突變；例如可能成為人疾病的根源的變體和突變。在復雜疾病的情況下，這些搜索通常導致與一種或更多種疾病有關的單核苷酸多態性(SNP)或SNP集合。已經證實，鑒別這樣的SNP是一項費力、費時且費用巨大的任務，其中經常需要重新排序來自受影響的個體和/或組織樣品的基因組DNA大區域、通常大于100千堿基(Kb)，以發現單堿基變化或鑒別所有序列變體。基因組通常因過于復雜而難以整體研究，且必須使用技術來降低基因組的復雜性。為了解決該問題，一種方案是，減少來自DNA樣品的某些類型的豐富序列，參見US 6，013，440。替代方案采用富集基因組序列的方法和組合物，參見例如，Albert，Τ. J.，等人，Nat. Meth.，4 (2007) 903_5(其通過援引整體并入本文)和Okou，D. T.,等人，Nat. Meth. 4(11) (2007) 907-9 (其通過援引整體并入本文)和美國專利申請號11/789，135、 11/970, 949,61/032, 594和61/026，592 (它們都通過援引整體并入本文)，它們公開了節省成本地、快速地、有效地以使用者確定的方式減少基因組樣品的復雜性、允許進一步處理和分析的替代方案。但是，使用的方法具有低信噪比和再現性問題。這樣，需要實現例如信噪比的提高、測定之間再現性的增加、特異性的序列捕獲、與此同時保持定量的方法和系統。在研究人員理解和鑒別疾病的原因和有關的治療性處理的努力中，這些方法會為他們提供極大的數據效用。發明概述
本發明提供了包含酶促反應的序列特異性的核酸靶物捕獲方法和系統。更具體地，本發明包含，使用帽緣內切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢測靶核酸序列的基質(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復數種寡核苷酸探針。下面描述本發明的某些例證性的實施方案。本發明不限于這些實施方案。在本發明的實施方案中，在原位合成寡核苷酸探針，或合成并印跡到基質上，其中所述探針固定在基質(例如，微陣列載玻片、珠子、微球)上，且包含與靶序列互補的單鏈 5’末端、和包含發夾結構和與靶核苷酸互補的末端堿基的3’末端。在本發明的其它實施方案中，合成的探針除了包含單鏈5’末端以外，另外包含結合到探針5’末端的結合部分 (例如生物素)、和包含發夾結構和與靶序列互補的末端堿基的3’末端，且所述探針保持在溶液中。在某些實施方案中，在探針中發現的發夾結構包含由限制性內切核酸酶(RE)識別和切割的序列。在本發明的某些實施方案中，靶核酸包括例如基因組DNA或其衍生物、RNA、 cDNA、微RNA (miRNA)、非編碼RNA (ncRNA)、啟動子-相關的小RNA (PASR)等，加入它們，以與探針相互作用。在某些實施方案中，通過例如剪切，使核酸碎裂，而在其它實施方案中，通過例如 PCR或通過克列諾酶(Klenow)，擴增核酸靶物。在優選的實施方案中，在碎裂或擴增后，用可檢測的部分(例如熒光、生物素、地高辛配基等部分)在3’末端標記靶核酸。本發明不受使用的檢測部分和/或方法的限制，且預見到，熟練的技術人員會理解為了檢測目的可以結合到核酸的3’末端的檢測部分的眾多選項。在某些實施方案中，所述靶核酸序列的長度是至少100堿基對、至少200堿基對、至少300堿基對、至少400堿基對、至少500堿基對、至少600堿基對。但是，本發明不限于靶核酸序列的大小，且預見到未碎裂的以及碎裂的和衍生的核酸樣品(例如，PCR擴增子、克列諾酶隨機引發的擴增子等)與本發明的方法和測定一起使用。在某些實施方案中，所述靶核酸序列包含單核苷酸多態性或拷貝數目變化。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置在探針的發夾結構之后，且在3’末端。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置在例如5’側的發夾結構之前且與其緊鄰，且探針的3’末端設計成與已知的靶序列互補。在某些實施方案中，近端核苷酸是5’側雙鏈發夾結構上游2、 3、4、5、6、7、8、9或10個堿基。在某些實施方案中，通過將查詢核苷酸放置在探針序列的5’ 側或臂上，實現切割酶和連接酶的雙特異性(與單獨的切割酶特異性相比)。在某些實施方案中，當如所述將查詢核苷酸放置在5’側時，切割酶特異性取決于三部分(tripartite)結構、和用于連接發夾的3’末端和切割的靶物的5’末端的堿基特異性的底物。在某些實施方案中，在適合發生雜交的條件下，將標記的靶核酸與在基質上或在溶液中的探針一起溫育。雜交后，與探針的3’末端核苷酸互補的靶序列產生序列特異性的結構，其被帽緣內切核酸酶(FEN)識別和切割。在優選的實施方案中，向反應物中加入連接酶(熱穩定的連接酶)，用于將探針的3’末端連接到切割的靶核酸的5’末端，從而將靶核酸共價連接到探針上。如果靶序列不與探針上的3’末端核苷酸互補，則不會形成切割結構，不會發生帽緣內切核酸酶的切割，也不會進行連接。在某些實施方案中，通過將FEN加入雜交的探針/靶物復合物，隨后單獨加入連接酶，依次發生酶促反應。在其它實施方案中，同時加入FEN和連接酶，使得反應幾乎同時發生。在某些實施方案中，將RecJ外切核酸酶與切割酶組合地加入反應。在某些實施方案中，將ssDNA結合蛋白額外加入反應。本發明不限于特定機理。實際上，對機理的理解不是實踐本發明所必需的。盡管如此，預見到與FEN 組合地加入RecJ和/或ssDNA結合蛋白，會提供增強的切割酶活性，因為與缺少RecJ和 /或ssDNA結合時的反應相比，RecJ在降解雜交的靶物片段的長突出端中的外切核酸酶活性，會提供更適合最佳切割酶活性的底物。在某些其中探針固定在基質(例如微陣列載玻片)上的實施方案中，從共價結合的靶分子洗掉非特異性地結合的核酸分子。在某些其中標記的探針保持在溶液中的實施方案中，含有共價結合的靶分子的標記的探針被用捕獲分子包被的基質(例如珠子、載玻片、平板等)捕獲。例如，如果探針是生物素標記的，則用抗生蛋白鏈菌素包被的珠子會捕獲探針 /靶物復合物，從而使結合的靶分子與未結合的分子分離。在某些實施方案中，洗滌基質，以進一步將捕獲的靶分子，從非特異性地結合的核酸分子純化。在某些實施方案中，使用熒光掃描儀，掃描包含共價結合的靶物的基質，例如，以檢測在靶序列上發現的熒光部分，且將含有序列信息的數據與使用者交流，例如通過計算機或其它可視方式。在某些實施方案中，從基質釋放結合的靶核酸，用于下游應用，例如測序。例如，在某些實施方案中，探針的發夾結構包含一個或更多個限制性內切核酸酶位點或尿嘧啶。本發明不限于任何特定可切割的序列，熟練的技術人員會認識到適合本發明的方法和測定的眾多選項。一旦靶核酸如本文所述被捕獲、共價結合到探針上、并與非特異性地結合的核酸分子分離，通過用RE或尿嘧啶-DNA-糖基化酶消化探針/靶物復合物、隨后進行內切核酸酶VIII消化，從探針釋放靶序列，其中在探針發夾結構中發現了由RE識別的序列，或尿嘧啶被合成進探針發夾中。釋放后，使用本領域技術人員已知的方法，例如通過在水或低溶質溶液中溫育靶序列/探針復合物，從探針洗脫靶序列。將洗脫的靶分子應用于下游用途，例如測序反應。本文所述的本發明的方法和測定可以用于，例如，檢測單核苷酸多態性、基因組拷貝數變化等。可以研究基因組異常與疾病和病癥的關聯，從而為研究和診斷目的提供關于疾病和病癥的原因的洞察，以及在鑒別這樣的疾病和病癥的治療性處理中，提供用于藥物發現的潛在靶物。在某些實施方案中，本發明提供了捕獲靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸樣品，其中所述樣品包含檢測部分(優選熒光部分諸如Cy-3 )，且可以包含或不包含靶序列、至少一種帽緣內切核酸酶、至少一種連接酶(優選熱穩定的連接酶)和復數種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發夾結構，在發生雜交的條件下將所述核酸樣品應用于所述寡核苷酸探針，在允許發生酶促反應的條件下將所述帽緣酶和連接酶應用于所述雜交的核酸 /探針復合物，從而捕獲所述靶核酸序列。在優選的實施方案中，與帽緣內切核酸酶組合地，在反應中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA結合蛋白。在某些實施方案中，所述核酸樣品是基因組DNA樣品或其衍生物，其中所述樣品來自哺乳動物、優選人。在某些實施方案中，至少一種所述靶序列包括單核苷酸多態性，而在其它實施方案中，所述靶序列是基因組拷貝數變體。在某些實施方案中，所述發夾結構包含SEQ ID NO: 1。在某些實施方案中，進一步檢測捕獲的靶核酸，例如利用熒光掃描儀。在某些實施方案中，所述探針固定在基質(例如微陣列載玻片)上，而在其它實施方案中，所述探針保持在溶液中。在某些實施方案中，所述探針與凝膠墊結合。在某些實施方案中，本發明提供了捕獲靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸樣品，其中所述樣品包含檢測部分(優選熒光部分諸如Cy-3 )，且可以包含或不包含靶序列、至少一種帽緣內切核酸酶、至少一種連接酶(優選熱穩定的連接酶)和復數種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發夾結構，其中所述發夾結構包含可切割的序列，提供使探針和靶核酸之間發生雜交的條件，在允許發生酶促反應的條件下將所述帽緣酶和連接酶應用于所述雜交的核酸/探針復合物，從而捕獲所述靶核酸序列。在優選的實施方案中，與帽緣內切核酸酶組合地，在反應中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA結合蛋白。在某些實施方案中，所述可切割的序列包含可被限制性內切核酸酶識別和切割的限制性內切核酸酶位點。在某些實施方案中，通過限制性內切核酸酶消化，從探針釋放靶核酸，隨后測序，以檢測靶序列。在某些實施方案中，本發明提供了用于在基質上或在溶液中實現序列特異性的核酸捕獲的組合物，其包含帽緣內切核酸酶、連接酶和寡核苷酸探針，其中所述探針包含發夾結構和互補的靶核酸序列。在某些實施方案中，所述寡核苷酸探針固定在基質(例如微陣列載玻片或珠子)上。在某些實施方案中，本發明包括試劑盒，其中所述試劑盒用于捕獲核酸靶序列，其包含至少一種帽緣內切核酸酶、至少一種熱穩定的連接酶、固定在基質上或處于純化狀態的復數種寡核苷酸探針、和至少一種緩沖液。在優選的實施方案中，在試劑盒中另外包括 RecJ外切核酸酶和ssDNA結合蛋白。在某些實施方案中，所述寡核苷酸探針基本上由與靶序列互補的單鏈5’末端和 3’末端(其基本上由發夾結構和與靶核苷酸互補的末端堿基組成)組成。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置在探針的5’側。在某些實施方案中，本發明包括試劑盒，其中所述試劑盒用于捕獲核酸靶序列，且基本上由至少一種帽緣內切核酸酶、至少一種熱穩定的連接酶、固定在基質上或處于純化狀態的復數種寡核苷酸探針、RecJ外切核酸酶、ssDNA結合蛋白和至少一種緩沖液組成。本文使用的術語“樣品”以它最廣的含義使用。在一種含義中，它包括從任意來源得到的核酸試樣。生物核酸樣品可以從動物(包括人)得到，且包括從流體、固體、組織等分離的核酸。生物核酸樣品也可以來自非人動物，包括、但不限于，脊椎動物諸如嚙齒動物、非人靈長動物、綿羊、牛科動物、反芻動物、兔類動物、豬、山羊、馬科動物、犬、貓科動物、鳥類等。生物核酸也可以從原核生物(如細菌)和其它非動物真核生物(諸如植物)得到。預見到，本發明不受核酸樣品來源的限制，來自任何生物界的任何核酸都可以用于本文所述的方法中。本文使用的術語“核酸分子”是指含有來自任意樣品來源的分子的任意核酸，包括但不限于，DNA或RNA。該術語包括含有DNA和RNA的任意已知堿基類似物的序列，所述堿基類似物包括、但不限于4_乙酰基胞嘧啶，8-羥基-N6-甲基腺苷，氮丙啶基胞嘧啶，假異胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假尿嘧啶，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5’ -甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5_甲氧基尿嘧啶，2_甲基硫_N6_異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯，尿嘧啶-5-氧醋酸，oxybutoxosine，假尿嘧啶， queosine, 2_硫胞嘧啶，5_甲基_2_硫尿嘧啶，2_硫尿嘧啶，4_硫尿嘧啶，5_甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯，尿嘧啶-5-氧醋酸，假尿嘧啶，queosine，2_硫胞嘧啶，和2，6- 二氨基嘌呤。本文使用的術語“寡核苷酸”是指包含2個或更多個、優選超過3個、且通常超過 10個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。精確大小取決于許多因素，又取決于寡核苷酸的最終功能和用途。可以以任意方式制備寡核苷酸，包括化學合成、DNA復制、反轉錄、或其組合。術語寡核苷酸也可以與術語“多核苷酸”互換使用。本文使用的術語“互補的”或“互補性”用于指通過堿基配對規則相關聯的多核苷酸。例如，序列“5’-A-G-T-3’ ”與序列“3’-T-C-A-5’ ”是互補的。互補性可以是“部分的”，其中僅一些核酸堿基根據堿基配對規則相匹配。或者，核酸之間可以存在“完全的”或“全部”的互補性。核酸鏈之間互補性的程度，對例如核酸鏈之間雜交的效率和強度、擴增特異性等有顯著影響。本文使用的術語“雜交”用于指互補核酸的配對。雜交和雜交的強度(即，核酸之間締合的強度)，受到諸如核酸之間的互補程度、包含的條件的嚴格性、形成的雜合體的 Tm、和核酸內G:C比等因素的影響。本發明不限于雜交條件的特定集合，優選地采用嚴格的雜交條件。嚴格的雜交條件是序列依賴性的，且隨不同的環境參數(例如，鹽濃度和有機試劑的存在)而異。通常，選擇的“嚴格的”條件比特定核酸序列在確定的離子強度和PH下的熱解鏈點(Tm)低約5°C至20°C。優選地，嚴格的條件比結合互補核酸的特定核酸的熱解鏈點低約5°C至10°C。所述Tm是50%的核酸與完全匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。本文使用的術語“嚴格性”用于指進行核酸雜交的溫度、離子強度和諸如有機溶劑等其它化合物的存在的條件。在“低嚴格性條件”下，目標核酸序列會與它的精確互補物，具有單堿基錯配的序列、密切相關的序列(例如，具有90%或更高同源性的序列)和僅具有部分同源性的序列(例如，具有50-90%同源性的序列)雜交。在“中等嚴格性條件”下，目標核酸序列僅與它的精確互補物，具有單堿基錯配的序列和密切相關的序列(例如，具有90% 或更高同源性)雜交。在“高嚴格性條件”下，目標核酸序列僅與它的精確互補物，和(取決于諸如溫度等條件)具有單堿基錯配的序列雜交。換而言之，在高嚴格性條件下，可以升高溫度，從而排除與具有單堿基錯配的序列雜交。作為實例，“嚴格的條件”或“高嚴格性條件”包含，在42°C在50%甲酰胺、5xSSC (0. 75 M NaCl, 0. 075 M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(ρΗ6· 8)、0· 1%焦磷酸鈉、5χ登哈特溶液、超聲處理過的鮭精DNA(50mg/ml)、0. 1%SDS和10%硫酸葡聚糖中雜交，在42°C在0. 2x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中和在55°C在50%甲酰胺中洗滌，然后在55°C在含有EDTA的0. 1 χ SSC中洗滌。對于中等嚴格的條件，預見到含有35%甲酰胺、5xSSC和0. 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉的緩沖液適用于在45。C雜交16-72小時。此外，預見到，根據探針長度和希望的嚴格性水平，在0-45%的范圍內適當調節甲酰胺濃度。在本發明的某些實施方案中，通過升高雜交溫度或甲酰胺濃度來補償探針長度的變化，實現更長探針(例如，大于50聚體)的探針優化。在許多參考手冊中，例如在本文援引的和并入的“Molecular Cloning: A Laboratory Manual ”中，提供了雜交條件的其它實例。類似地，通常為靶序列與對應的探針陣列的雜交以經驗為主地確定“嚴格的”洗滌條件。例如，首先雜交陣列，然后用含有連續更低濃度的鹽或更高濃度的去污劑的洗滌緩沖液或在遞增的溫度洗滌，直到特異性與非特異性雜交的信噪比高得足以便利特異性雜交的檢測。作為實例，嚴格的溫度條件通常包括，超過約30°C、更通常超過約37°C、且偶爾超過約45°C的溫度。嚴格的鹽條件通常小于約1000 mM、通常小于約500 mM、更通常小于約150 mM。嚴格的洗滌和雜交條件是本領域技術人員已知的，且可以參見，例如，Wetmur，J. G., 和 Davidson, Μ. , J Mol Biol 31 (1968) 349-70 和 Wetmur, J. G. , Crit Rev Bio Mol Biol 26(3/4) (1991) 227-59;它們通過援引整體并入本文。本領域眾所周知，可以采用多種等效條件來調節和調整嚴格性條件；考慮諸如下述因素探針的長度和性質(0嫩、1 嫩、堿基組成)，和靶物的性質(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或被固定化等)，和鹽和其它組分的濃度(例如，是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)。這樣，雜交和洗滌溶液的組分和濃度會改變，以產生嚴格性條件。在本發明的優選實施方案中，利用通過Roche- NimbleGen (例如，NimbleChip CGH陣列，NimbleGen 雜交試劑盒，等)可商業得到的雜交和洗滌溶液。本文使用的術語“引物”是指，當置于誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成的條件(即，在有核苷酸和諸如DNA聚合酶等誘導劑存在下，且在合適的溫度和pH)下時，能起合成起始點的作用的寡核苷酸，無論是它在純化的限制酶切消化中天然存在的，還是合成生產的。引物優選地是單鏈的(為了擴增中的最高效率)，但是可以備選地是雙鏈的。如果是雙鏈的，首先處理引物，以分離它的鏈，然后用于制備延伸產物。優選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長，以在有誘導劑存在下引發延伸產物的合成。引物的精確長度取決于多種因素，包括溫度、引物的來源和方法的用途。本文使用的術語“探針”是指，能與另一個目標寡核苷酸的至少一部分雜交的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，無論是它在純化的限制酶切消化中天然存在的，還是合成地、重組地或通過PCR擴增生產的。探針可以是單鏈的或雙鏈的，但是在本發明中，預期探針是單鏈的。探針可用于檢測、鑒別和分離特定基因序列。在本發明的實施方案中，探針包含5’單鏈末端和含有發夾結構的3’末端。在發夾結構中可以存在或不存在限制性內切核酸酶位點ο當提及核苷酸序列時，本文使用的術語“其衍生物”、“部分”或“片段”(如在“給定核苷酸序列的衍生物”中)是指該序列的片段。所述片段的大小可以是從4個核苷酸至整個核苷酸序列減去1個核苷酸(10、20、30、40、50、100、200個核苷酸等)。通過例如超聲處理、PCR擴增、克列諾擴增、或本領域已知的將核苷酸序列減小成其更小的序列的任意其它方式，可以得到片段。在本發明中，核酸序列的片段、衍生物優選地是至少200堿基對、至少300堿基對、至少400堿基對、至少500堿基對、至少600堿基對。但是，本發明不受限于靶核酸序列的大小。本文使用的術語“純化的”或“純化”是指，從樣品去除組分(例如，污染物)和/ 或污染物。術語“純化的”是指，隔離的或分離的分子，從它們的天然環境取出的核酸或氨基酸序列。“分離的核酸序列或樣品”因此是純化的核酸序列或樣品。“基本上純化的”分子不含有至少60%、優選至少75%、更優選至少90%的它們天然伴隨的其它組分。在本發明的某些實施方案中，“純化的”涉及未結合的樣品核酸分子和反應組分(例如，酶等)與探針 /靶物復合物的分離，通常通過用一個或更多個嚴格性的洗滌緩沖液洗滌，從而從其它反應組分中“純化”探針/靶核酸復合物。本文使用的術語“查詢核苷酸”是指探針中的核苷酸，其與靶序列相互作用(例如，匹配的堿基對形成或錯配)以測定特定突變諸如單核苷酸多態性，或使用復數種寡核苷酸探針從樣品序列特異性地捕獲靶核苷酸。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置為探針 3’末端處的末端堿基。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置在探針的5’側或臂上(即，探針的單鏈區域)，在發夾莖結構的近端。在某些實施方案中，查詢核苷酸放置在發夾莖結構的上游，且與其緊鄰。在某些實施方案中，近端核苷酸是5’側雙鏈發夾結構上游2、3、4、5、 6、7、8、9或10個堿基。查詢核苷酸也可以稱作“等位基因特異性的核苷酸”。在某些實施方案中，如果在靶物中存在對應的互補核苷酸，查詢核苷酸會與切割酶識別的靶分子建立重疊的三部分結構。

圖1顯示了使用帽緣內切核酸酶和連接酶切割和連接靶分子到固定在微陣列固體支持物上的探針上的一個示例性實施方案；A)與潛在靶DNA序列締合的靶DNA分子的一條鏈的4種探針的集合，B)帽緣內切核酸酶切割與互補探針締合的正確靶核酸序列，不切割不正確的靶序列，和C)正確靶序列的5’末端與探針的3’末端連接，不正確的靶序列不連接探針。圖2顯示了使用帽緣內切核酸酶和連接酶切割和連接靶分子到溶液中的標記的探針上的一個示例性實施方案；A)當形成侵入性復合物時，進行序列特異性的切割，隨后把靶分子(SEQ ID NO: 33)連接到生物素化的探針(SEQ ID NO: 32)上，和B) 將含有共價結合的靶分子的標記的探針捕獲到用抗生蛋白鏈菌素包被的珠子上。圖3顯示了本文所述寡核苷酸探針(SEQ ID NO: 1)的一個示例性發夾序列。圖4顯示了使用本發明的方法捕獲CPK6靶序列的實驗數據；靶序列被含有發夾的探針捕獲，被FEN切割，并連接到探針上，而對照序列則不然。圖5顯示的實驗數據證實了本發明的方法在捕獲靶序列中的效率(正確的對比不正確的堿基調用)，和捕獲正確的對比不正確的靶序列的差異倍數。圖6顯示了用于產生的碎裂的實驗DNA的3種不同的大腸桿菌擴增和限制酶切消化圖譜。圖7例證了本發明在鑒別基因組突變中的應用。圖8證實了 5’帽緣長度對不同切割酶分子活性在正確執行堿基調用的能力方面的影響，通過低辨別評分來指示(<0.5 D評分)。圖9例證了 RecJ的增強切割酶活性的作用；A)顯示了沒有RecJ時的切割酶反應，B)顯示了在有RecJ存在下增強的切割酶活性。圖10解釋了在切割酶和連接酶反應中單對比雙酶特異性的發夾構型的對比。A， C)發夾構型具有例如從5’至3’合成的寡聚體探針(SEQ ID NO: 11-14，34-37)，其含有莖-長度(6堿基對-12堿基對)的發夾，且含有在3’末端的1堿基對突出端。B，D)發夾構型具有例如從5’至3’合成的寡聚體探針(SEQ ID NO: 16-19，38-41)，其含有莖-長度(6堿基對-12堿基對)的發夾。它們產生堿基特異性的底物，用于連接發夾的3’末端和切割的靶物的5，末端(SEQ ID N0: 15，42)。OL是指在查詢位點處的重疊。因此，OLl 是指1個核苷酸的重疊，0L0是指在查詢位點處的0個或沒有重疊。圖11顯示了使用不同發夾構型，跨83堿基對PCR片段，對堿基調用的特異性的評價。跨83堿基對片段，為每個堿基計算辨別評分，并相對于2類發夾構型繪圖；1)雙(OLO) 和2)單(OLl)酶特異性。在每類中，對比了幾個莖和環序列。沒有發夾(N0_HP)的對照探針集合具有最低的辨別，而雙酶發夾構型具有最高的辨別。圖12顯示了使用不同發夾構型，跨83堿基對PCR片段，對堿基調用的特異性的評價。跨83堿基對片段，為每個堿基計算辨別評分，并相對于2類發夾構型繪圖；1)雙(OLO) (SEQ ID NO: 20-25)和 2)單(OLl) (SEQ ID NO: 26-31)酶特異性。在每類中，對比了幾個莖和環序列。發明詳述
本發明提供了使用帽緣內切核酸酶和連接酶的方法和測定，它們用于在固體基質上和在溶液中靶向捕獲核酸的方法和測定中。下面描述了本發明的某些例證性的實施方案。本發明不限于這些實施方案。

帽緣內切核酸酶(FEN)(也稱作切割酶)是能以序列特異性的方式切割核酸的結構特異性的酶。所述酶已經用作來自Third Wave Technologies的Invader 基因分型和核酸檢測技術的開發中的組分，參見例如美國專利和公開的專利申請5，843，669,5, 888，780、 6，090，606,6，562，611,7，122，364,2007/0003942,2007/0292856,2006/0292580, 2006/0183207,2006/0177835,2006/0154269 和 2006/0040294，它們都通過援引整體并入本文。帽緣內切核酸酶組成和方法的其它實例參見美國專利和公開的專利申請6，255，081、 6，251，649,6，979，725,5，874，283,2007/0292934,2007/0292864,2007/0231815 禾口 2007/0105138，它們都通過援引整體并入本文。FEN的內切核酸酶活性包括，識別具有在一條鏈上的5’突出端(帽緣)的DNA雙鏈體，其稱作侵入性復合物(如圖1和2所示)。 FEN會催化在單鏈和雙鏈DNA的接頭處的磷酸二酯鍵的水解切割(Harrington，J. J.，和 Lieber, Μ. R. , EMBOJ 13(5) (1994) 1235-46; Harrington, J. J.，和 Lieber, Μ. R. , J Biol Chem 270(9) (1995) 4503-8;通過援引整體并入本文)。FEN的識別和切割特定二級結構的能力，允許在沒有核酸的具體序列的現有知識的情況下，將這些酶用于檢測核酸內部序列差異。在本發明的某些實施方案中，當探針的3’末端核苷酸存在于靶核酸樣品中時，產生由FEN識別的特定結構，并發生FEN切割。但是，當探針中的序列與靶序列不互補時，不會形成結構，也不會發生FEN切割。這樣，實現靶核酸的序列特異性識別。另外預見到連接酶(尤其是熱穩定的連接酶)用于本發明的方法和測定中。如果 FEN識別的結構存在，在FEN切割靶分子之后，進行探針3’末端與靶分子5’末端的連接。如熟練的技術人員已知的，連接酶會催化雙鏈體DNA或RNA中并置的3’羥基和5’磷酸酯末端之間共價磷酸二酯鍵的形成(如圖1和2所示)。在本發明的優選實施方案中，預見到熱穩定的連接酶。熱不穩定的連接酶，諸如T4 DNA連接酶，在室溫表現出最佳酶活性。熱穩定的連接酶，例如在細菌嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)和激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)中發現的那些，在高得多的溫度、例如大于45°C表現出最佳酶活性，當應用于本文所述的本發明的方法和測定中時，允許溫度條件的更大柔性。熱穩定的連接酶的實例參見，例如，美國專利和公開的專利申請6，949，370,6, 576，453,6, 280，998,6, 444，429、 5，700, 672,2007/0037190,2005/0266487 和歐洲專利公開 WO 07/035439,它們都通過援引整體并入本文。一旦FEN已經切割靶核酸，通過連接酶的連接會將靶序列共價連接至探針上，其中所述探針是固定在固體支持物(例如微陣列載玻片)上，或保持在溶液中。這樣，實現靶核酸的序列特異性的捕獲。另外預見到，一旦所述雜交反應中的侵入性復合物被切割酶識別，在有或沒有 ssDNA結合蛋白(SSBP)的情況下，包含RecJ，會增強切割酶的功效。Rec J外切核酸酶 (RecJ)會以5’ -3’方向降解單鏈DNA，并另外參與錯配修復和同源重組(Lovett，S. Τ.，禾口Kolodner, R. D. , Proc Natl Acad Sci 86 (1989) 2627—2631; Yamagata, Α.,等人， Nucl Acids Res 29(22) (2001) 4617-4624; Han, E. S.,等人，Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091;通過援引整體并入本文)。Rec J會以同等的親和力降解磷酸化的和未磷酸化的DNA末端，但是要求單鏈末端的長度是至少7個核苷酸。Rec J是一種漸進的外切核酸酶，在它結合單鏈末端后，會降解大約1000個核苷酸，通常在它到達雙鏈DNA 接頭時停止。但是，RecJ核酸酶活性不是精確的，它可能在接頭之前幾個核苷酸或在接頭之后幾個堿基對停止降解活性。已經提出，通過將單鏈DNA結合蛋白加入降解反應物中，可以增強 Rec J 向單鏈 DNA 的募集(Han, Ε. S.,等人，Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091)。這樣，預見到包含RecJ外切核酸酶和SSBP中的一種或更多種，以增強切割酶活性，在本文所述的靶核酸的序列特異性捕獲中實現更高的效率。在某些實施方案中，將寡核苷酸探針在它們的5’末端或5’側或5’臂處連接到固體支持物(諸如微陣列載玻片)上，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列互補的中樞部分，和包含發夾結構(其包含被互補核酸的雙鏈區域結合的單核苷酸環)的3’末端區域，且在末端是對目標靶序列特異性的3’末端堿基(例如，用于測定基因組突變諸如單核苷酸多態性的查詢核苷酸)。在某些實施方案中，所述對靶序列特異性的堿基(例如，用于測定突變或多態性)的位置緊挨著探針5’ -側的發夾環結構。在優選的實施方案中，雙鏈發夾區域是至少3個堿基對、至少5個堿基對、至少6個堿基對、至少8個堿基對、至少10個堿基對、至少16個堿基對。在有利于互補DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、 cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的復合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的或碎裂的)一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’末端堿基互補的核酸序列與探針特異性地雜交。在某些實施方案中，用例如可檢測的部分(例如，熒光團、生色團、放射性同位素等)在3’末端標記靶核酸。在某些實施方案中，本發明提供了在它們的5’末端連接到固體支持物(諸如微陣列載玻片)上的寡核苷酸探針，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列部分互補的中樞部分，和包含發夾結構(其包含被互補核酸的雙鏈區域結合的單核苷酸環)的3’末端區域，且在末端是與靶序列互補的3’末端堿基，其中在包含發夾結構的互補核酸的雙鏈區域的5’ 末端近端的核苷酸包括與目標靶序列互補的序列(例如，用于測定基因組突變諸如單核苷酸多態性的查詢核苷酸)。在優選的實施方案中，近端核苷酸緊鄰雙鏈發夾結構。在某些實施方案中，近端核苷酸是在5’側雙鏈發夾結構上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個堿基。在優選的實施方案中，雙鏈發夾區域是至少3個堿基對、至少10個堿基對、至少16個堿基對。在有利于互補DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的或碎裂的)一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’末端堿基互補的核酸序列與探針特異性地雜交。在某些實施方案中，用例如可檢測的部分(例如，熒光團、生色團、放射性同位素等)在3’末端標記靶核酸。
在某些實施方案中，本發明提供了在它們的5’末端連接到固體支持物(諸如微陣列載玻片)上的寡核苷酸探針，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列互補的中樞部分，和包含發夾結構(其包含被互補核酸的雙鏈區域結合的單核苷酸環)的3’末端區域，且在末端是與靶序列互補的3’末端堿基。在優選的實施方案中，雙鏈發夾區域是至少3個堿基對、至少10個堿基對、至少16個堿基對。在有利于互補DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的或碎裂的)一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’ 末端堿基互補的核酸序列與探針特異性地雜交。在某些實施方案中，用例如可檢測的部分 (例如，熒光團、生色團、放射性同位素等)在3’末端標記靶核酸。在某些實施方案中，寡核苷酸探針可以用于雜交測定中，用于測定基因異常諸如缺失、易位等，所述寡核苷酸探針包含單鏈的、且與靶序列互補的中樞部分，和包含發夾結構(其包含被互補核酸的雙鏈區域結合的單核苷酸環)的3’末端區域，且在末端是與靶序列互補的3’末端堿基。在某些實施方案中，如在 DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual, 2003, Bowtell 禾口 Sambrook 編,Cold Spring Harbor Laboratory Press (通過援引整體并入本文)中所述，合成寡核苷酸探針，并固定在基質(例如微陣列載玻片或芯片)上。在優選的實施方案中，使用例如在美國專利和專利公開7，157, 229,7,083,975, 6，444，175,6,375，903,6,315，958,6,295，153,5,143，854、2007/0037274、2007/0140906、 2004/0126757,2004/0110212,2004/0110211,2003/0143550,2003/0003032 禾口 2002/0041420 (它們都通過援引整體并入本文)中所述的無掩膜陣列合成儀(MAS)，直接在基質(諸如微陣列載玻片)上合成捕獲寡核苷酸探針。當使用MAS儀器來印跡微陣列時，在軟件控制下，直接在微陣列載玻片上原位構建寡核苷酸探針序列的選擇，從而建立基于研究人員的特定需要的個別地定制的陣列。這樣的陣列包含數百、數千和數百萬的探針。通常從3’至5’合成寡核苷酸探針，無論是在基質(例如，微陣列載玻片)上原位合成(例如，MAS合成)，還是先合成再印跡到基質上。但是，由于大多數核酸酶(例如，限制性內切核酸酶、聚合酶、末端轉移酶、連接酶、激酶、磷酸酶等)具有從5’至3’的活性，酶促反應要求使用反向化學方法(例如，從5’至3’ )合成探針。這樣，本發明的方法和測定實施方案包含使用在例如Albert, Τ. J.，等人，Nucl Acids Res 31 (7) (2003) e35 (其通過援引整體并入本文)中所述的MAS儀器原位合成優先從5’至3’合成的寡核苷酸探針。本發明提供了用于檢測核酸序列中的差異(例如單核苷酸多態性、基因組拷貝數變體、甲基化狀態等)的方法和測定。在本發明的方法和測定中，使靶核酸與探針雜交，其中所述探針固定在基質上(例如，通過原位合成或其它方法)或在溶液中。在某些實施方案中，探針的長度是至少15個核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至少35 nts、至少40 nts、至少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60個核苷酸。在某些實施方案中，在基質(例如微陣列載玻片、微陣列芯片、珠子、平板等)上原位合成本發明的探針。在優選的實施方案中，使用MAS儀器原位合成探針，其中探針的5’末端固定在基質上。在某些實施方案中，在溶液中合成探針，并保持在溶液中。本發明的探針包含與靶序列互補的單鏈5’末端，包含發夾結構(其包含一系列產生雙鏈區域的互補堿基和在雙鏈區域中產生單鏈區域(例如，發夾結構)的不互補的序列) 的3’末端，和與特定靶序列互補的3’末端堿基。在某些實施方案中，所述發夾結構的長度是至少5個堿基、10個堿基、至少12個堿基、至少14個堿基、至少16個堿基、至少18個堿基。在某些實施方案中，所述發夾結構優選是16個堿基。在某些實施方案中，所述發夾結構包含如圖3所示的SEQ ID NO: 1。但是，本發明不受發夾結構序列的限制，發夾結構的其它實例和它們的設計參見，Varani, G.，Ann Rev Biophys Biomol Struct 24 (1995) 379-404 和 Antao，V. P.,等人，Nucl Acids Res 19(21) (1991) 5901-5，它們二者通過援引整體并入本文。如圖1和2所示，探針上與探針發夾的3’末端堿基互補的核苷酸堿基決定了測定特異性，且有時稱作“等位基因特異性的堿基”。如圖10所示，在發夾結構近端的探針5’-側或臂上的核苷酸堿基也決定了測定特異性。當等位基因特異性的堿基與靶鏈的對應堿基互補時，發夾和靶分子形成特定結構，稱作“侵入性復合物”，其被FEN酶識別。當堿基特異性的核苷酸存在于靶鏈中時，FEN會在該堿基的3’側切割靶鏈，從而釋放未雜交的或帽緣的靶鏈5’末端。如果堿基不與等位基因特異性的堿基互補，則侵入性復合物不會形成，FEN也不會切割靶分子。在某些實施方案中，在探針與靶核酸雜交后，將探針/靶物復合物與混合液一起溫育，所述混合液包含下述的一種或更多種帽緣內切核酸酶(FEN)、連接酶、RecJ, ssDNA 結合蛋白和發生酶促反應所需的適當緩沖液和輔因子(ATP或NAD+)。FEN會切割形成侵入性復合物的靶分子，在核酸探針發夾和靶核酸分子之間產生間隙。預見到，在有或沒有 ssDNA結合蛋白的情況下，包含RecJ，會提高切割酶反應的效率，從而提高在侵入性復合物的切割中的敏感性。連接酶會修復間隙，將靶分子共價連接到探針上。如果侵入性復合物沒有形成，則FEN不會切割，靶分子也不會連接到探針上。隨后通過洗滌，將未結合的分子與結合的靶物分離。由于靶分子共價結合到在基質上的探針上，可以用比應用于非共價結合的雜交方法的那些高得多的嚴格性進行洗滌，從而增強非特異性地結合的非靶分子的去除，并極大提高捕獲特異性和信噪比。在某些實施方案中，使用本文所述的和熟練的技術人員已知的數據分析儀器和軟件，通過可檢測的方式(例如比色法、放射測量術、熒光分析法、凝膠電泳等)，鑒別結合探針的靶分子。由于靶分子共價結合到探針上，陣列能夠用高嚴格性洗滌，以去除未結合的非靶分子，從而更大地減少背景信號，并提高測定的信噪比。本發明的用途包括、但不限于比較基因組雜交(CGH)、單核苷酸多態性基因分型、基因轉錄描繪、基因組甲基化分析、染色質免疫沉淀繪圖等。在某些實施方案中，本發明提供了用于DNA的靶物捕獲的測定和方法，例如，用于高流通量測序應用和其它下游應用。在某些實施方案中，核酸探針是在溶液中，且在它們的5’末端結合到可捕獲的部分(例如生物素部分)上(圖2)。核酸探針另外包含如前所述的單鏈的、且與靶序列互補的 5’區域，和包含發夾結構(其包含被互補核酸的雙鏈區域結合的單核苷酸環)的3’末端區域。在某些實施方案中，所述發夾結構的長度是至少5個堿基、10個堿基、至少12個堿基、至少14個堿基、至少16個堿基、至少18個堿基。在某些實施方案中，所述探針的長度是至少15個核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至少35 nts、至少40 nts、至少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60個核苷酸。預見到，所述探針優選小于100個堿基。在某些實施方案中，所述發夾序列包含可切割的序列，用于在連接后從探針釋放結合的靶序列。例如，所述發夾序列包含限制性內切核酸酶(RE)位點或一個或更多個尿嘧啶。在有利于互補DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復合靶群體、例如碎裂的人基因組DNA (gDNA) 一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分互補的基因組片段與探針特異性地雜交。在某些實施方案中，用例如可檢測的部分(例如，熒光團、生色團、放射性同位素等)在3’末端標記靶核酸。當等位基因特異性的堿基與靶鏈的對應堿基互補時，如圖2所示，發夾和靶分子雜交，并形成被FEN酶識別的特定結構。當堿基特異性的核苷酸存在于靶鏈中時(圖2)， FEN會在該堿基的3’側切割靶鏈，從而釋放未雜交的或帽緣，靶鏈5’末端。如果堿基不與等位基因特異性的堿基互補，則侵入性復合物不會形成，FEN也不會切割靶分子。預見到，在有或沒有ssDNA結合蛋白的情況下，與FEN組合地包含RecJ，會提高切割酶的效率。在某些實施方案中，在雜交后，將探針復合物與混合液一起溫育，所述混合液包含下述的一種或更多種FEN酶、連接酶、RecJ、ssDNA結合蛋白、發生需要的酶促反應所需的適當緩沖液和輔因子(ATP或NAD+)。FEN會切割形成侵入性復合物的靶分子，在核酸探針發夾和靶核酸分子之間產生間隙。如前所述，通過將靶分子共價連接到探針上，連接酶會修復間隙。如果侵入性復合物沒有形成，則FEN不會切割，靶分子也不會連接到探針上。在某些實施方案中，如圖2B所示，共價結合到在溶液中的標記的探針(在該情況下，生物素標記的探針)上的靶分子，被抗生蛋白鏈菌素(SA)包被的珠子捕獲(例如，結合)，其中抗生蛋白鏈菌素結合標記的探針的生物素，正如本領域技術人員已知的。在抗生蛋白鏈菌素結合后，從溶液中取出珠子，并洗滌，從而從捕獲珠子上的結合的靶分子去除未結合的、未靶向的分子，并從不希望的反應組分將靶分子/探針復合物純化出來。由于靶分子共價結合到SA結合的生物素標記的探針上，可以用比應用于非共價結合的雜交方法的那些高得多的嚴格性進行洗滌，從而增強非特異性地結合的非靶分子的去除，并極大提高捕獲特異性和信噪比。在某些實施方案中，通過將包含靶分子的珠子暴露于限制性內切核酸酶，從SA 結合的探針釋放靶分子，例如當RE的識別位點在合成過程中摻入探針的發夾序列中時。在某些實施方案中，如果一個或更多個尿嘧啶在合成過程中摻入發夾中，通過與尿嘧啶-DNA-轉葡糖基酶(UDG) —起溫育，隨后用內切核酸酶VIII消化受損的位點，從SA結合的探針釋放靶分子。本發明不限于從結合的探針釋放靶分子的方法，預見到本領域已知的切割DNA的其它方法用于本發明的方法和測定中。釋放后，將靶向的分子應用于下游用途，諸如使用例如高流通量測序儀測序。本發明的方法和測定另外為研究人員提供了精確確定每個捕獲的靶核酸分子的終點和方向性的能力，且作為結果，每次測序都讀出。預見到，使用本文所述的酶方法釋放靶序列，適合從探針釋放靶序列，其中所述探針如本文所述在固體支持物(諸如微陣列載玻片)上合成。在某些實施方案中，本發明的方法和測定提供了單核苷酸多態性(SNP)的分析。在某些實施方案中，本發明提供了用于分析DNA樣品(例如基因組DNA樣品)中的拷貝數變化(CNV)的方法和測定。SNP和CNV分析可用于關聯研究中，例如在不同物種之間和在與疾病和病癥有關的SNP和CNV之間。這樣，本發明的方法和測定提供了基因組變化和它們與特定受試者(例如人受試者)中的疾病的關聯的分析。但是，預見到，本發明不限于來自任何特定屬和/或種的基因組序列的分析，例如認為任意原核生物或真核生物序列適合使用本發明，用于研究、診斷或治療用途。
在某些實施方案中，本發明不限于雜交條件的特定集合。但是，優選采用本領域技術人員已知的嚴格雜交條件。本發明使用的雜交溶液包括、但不限于在MmbleGen雜交試劑盒(Roche NimbleGen, Madison WI)中發現的那些。在某些實施方案中，本發明提供了在酶切割和連接反應后洗滌探針/靶物復合物，從而去除未結合的和非特異性地結合的核酸分子。在某些實施方案中，本發明提供了差別嚴格性的洗滌，例如包含0. 2x SSC、0. 2%(ν/ v)SDS和0. 1 mM DTT的洗滌緩沖液I，包含0. 2x SSC和0.1 mM DTT的洗滌緩沖液II，和包含0. 5x SSC和0. 1 mM DTT的洗滌緩沖液III。在某些實施方案中，用于洗滌、雜交和酶促反應的溶液和緩沖液包含鋰。本發明不受雜交和/或洗滌緩沖液的組成的限制。在某些實施方案中，在例如RE消化后，使用例如水或本領域技術人員已知的類似的低溶質溶液，從探針洗脫靶序列。在某些實施方案中，本發明提供了靶核酸序列的捕獲，其隨后用于靶向的基于陣列的、基于鳥槍法的、基于毛細管的或本領域已知的其它測序方法中。如熟練的技術人員已知的，通過合成的測序被理解為一種測序方法，其監視特定脫氧核苷-三磷酸在測序反應中摻入后副產物的產生(Ronaghi，Μ.，等人，Science 281 (1998) 363-65，其通過援引整體并入本文)。例如，一個或更突出的通過合成反應測序的實施方案是焦磷酸測序方法。在焦磷酸測序中，通過導致化學發光信號產生的酶級聯，監視在核苷酸摻入過程中焦磷酸的產生。454基因組測序儀系統(Roche Applied Science目錄號04760085001)是基于焦磷酸測序技術。為了在454 GS20或454 FLX儀器上測序，平均基因組DNA片段大小優選地分別是200或600堿基對。通過合成反應的測序，也可以包含終止子染料類型測序反應。在該情況下，摻入的dNTP構件塊包含可檢測的標記諸如熒光標記，其阻止新生DNA鏈的進一步延伸。在dNTP構件塊摻入模板/引物延伸雜合體后，通過例如使用具有3’-5’外切核酸酶或校正活性的DNA聚合酶，去除并檢測標記。但是，本發明不受可與本發明組合使用的下游用途的類型的限制。在某些實施方案中，通過酶消化(例如，限制性內切核酸酶、UDG和Endo VIII 等)，從寡核苷酸探針釋放靶序列，從探針洗脫，并測序。在某些實施方案中，使用454 Life Sciences Corporation測序儀進行測序。在某些實施方案中，本發明提供了根據生產商的方案，通過乳狀液PCR (emPCR)洗脫后，進行靶序列擴增。根據生產商的方案，將包含來自 emPCR的克隆地擴增的靶核酸的珠子轉移進picotiter平板，并進行焦磷酸測序反應，用于序列測定。在某些實施方案中，本發明提供了方法和測定，其中預見到復數種不同靶序列用于在一個陣列上或在一種溶液中的檢測，例如用于同時捕獲和檢測多種靶序列。在這樣的實施方案中，預見到雙色標記(例如，雙通道熒光、熒光/非熒光等)。例如，一種靶序列用一種可檢測的部分標記，另一種靶序列用第二種可檢測的部分標記。例如，一種靶序列用熒光素部分(例如，熒光素、Cy-3、Cy_5等)標記，第二種靶序列用非熒光部分(例如，生物素、地高辛配基)或波長檢測不同于第一種熒光部分的熒光部分標記。末端轉移酶可以用于3’ 末端標記靶序列，其中使用例如，熒光團(例如，熒光素-12-ddCTP)和第二種部分(例如，生物素-11-ddCTP)的ddCTP綴合物。這樣，雙通道檢測或差別部分檢測允許區分2種不同的捕獲靶序列。在某些實施方案中，進一步放大實踐本文所述的本發明的方法和測定結束后檢測到的信號。信號放大方法的實例包括、但不限于在通過例如NEN Life Sciences Products, Inc. (Boston MA)可商業得到的Tyramide信號放大試劑盒中發現的那些。在某些實施方案中，在結合的靶序列上進行數據分析。進行數據分析，例如，以鑒別在捕獲的靶序列中發現的SNP或CNV。使用任意陣列掃描儀，例如Axon GenePix 4000B 熒光掃描儀，進行數據分析。通過掃描儀捕獲到數據后，使用生物信息學程序分析捕獲的數據。可用于來自熒光微陣列形式的數據分析的生物信息學程序包括、但不限于，SignalMap (NimbleGen)和NimbleScan (NimbleGen)。但是，能捕獲和分析通過本發明方法產生的數據的任意掃描儀和生物信息學程序同樣適用。數據輸出顯示在例如任意計算機屏幕或能顯示實踐本發明時產生的數據的其它裝置上。在某些實施方案中，本發明提供了用于實踐本文所述的方法和測定的試劑盒。在某些實施方案中，所述試劑盒包含試劑和/或其它組分(例如，緩沖液、說明書、固體表面、容器、軟件等)，它們足以執行本文所述的靶核酸分子的靶核酸捕獲，或是執行本文所述的靶核酸分子的靶核酸捕獲所必需的。試劑盒在一個或更多個容器(另外包含一個或更多個試管、包裝等)中提供給使用者，所述容器可能需要差別儲存，例如由于每種試劑盒組分/ 試劑對光、溫度等的具體要求，將試劑盒組分/試劑差別儲存。在某些實施方案中，試劑盒包含一種或更多種固體支持物，其中所述固體支持物是微陣列載玻片或復數個珠子，它們上面固定有復數種寡核苷酸捕獲探針。在某些實施方案中，試劑盒包含在溶液中的寡核苷酸探針(其中所述探針包含捕獲部分)和珠子，其中所述珠子設計成結合固定在寡核苷酸探針上的捕獲部分。例如，這樣的部分是生物素標記，其可以用于固定到抗生蛋白鏈菌素包被的固體支持物上。或者，這樣的修飾是半抗原如地高辛配基，其可以用于固定到用半抗原識別抗體包被的固體支持物上。在某些實施方案中，本發明的試劑盒包含至少一種或更多種用于執行酶促反應的化合物和試劑，例如下述的一種或更多種帽緣內切核酸酶、DNA連接酶、RecJ外切核酸酶、 ssDNA結合蛋白、T4多核苷酸激酶、限制性內切核酸酶、DNA聚合酶、末端轉移酶、克列諾酶等。在某些實施方案中，試劑盒包含雜交溶液、洗滌溶液和/或洗脫試劑中的一種或更多種。在試劑盒中發現的洗滌溶液的實例包括、但不限于洗滌緩沖液I (0.2x SSC, 0.2% (v/v) SDS, 0. 1 mM DTT)和 / 或洗滌緩沖液 II (0. 2x SSC, 0. 1 mM DTT)和 / 或洗滌緩沖液III (0. 5x SSC, 0.1 mM DTT)。在某些實施方案中，在試劑盒中發現的一種或更多種緩沖液或溶液包含鋰。在某些實施方案中，試劑盒包含一種或更多種洗脫溶液，其中所述洗脫溶液包含純水和/或含有TRIS緩沖液和/或EDTA的溶液或其它低溶質溶液。提供下面的實施例來證實和進一步解釋本發明的某些實施方案和方面，不應理解為限制其范圍。實施例1
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和限制酶切碎的PCR擴增子的靶物捕獲設計實驗來測試在本發明的方法和測定中的連接效率。利用3’標記的CPK6寡核苷酸 (Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville ΙΑ)和從大腸桿菌基因組DNA (ATCC 號700926D-5)擴增的PCR片段設計實驗，得到從約1100至約1500堿基對的擴增子(SEQ ID Ν0: 2，3和4)。設計了 50和60聚體的寡核苷酸探針，其包含16堿基對發夾。使用的發夾序列是5，-CCGGAGGATACTCCG G_3，(SEQ ID N0: 1)，如圖3所示。合成了對照探針，其不含有發夾結構。設計了探針的四集體，其代表每條鏈的所有4種堿基，這樣為查詢序列內的靶核苷酸設計了共8個探針(例如，4個/DNA靶物的每條鏈)。除了在50/60聚體探針的3’末端上的末端堿基以外，每條鏈的每個四集體含有相同的探針序列。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在陣列上原位合成探針，密度是210萬探針/陣列(HD2)。使用PCR引物，從大腸桿菌基因組DNA擴增了 3個PCR片段；
1277-f s^atgagcaacaatgaaitcca-s' (seq id no； 5)
1277-R 5*ATGGTCAGCGGATACAGGAA-3T (SEQ ID NO: 6}
2205-F 5'ATGAATGACACCAGCTTCG{SEQ ID NO: 7) 2205-R 5 GCCAGTAGCGTAATCGGATG-3' (SEQ ID NO; 8) 2825-F 5*-ATCiTCTGAACAACACGCACA-3' (SEQ ID NO; 9)
2825-R 5'ACAOAATAACGTCGCGGATG-3'. (SEQ ID NO: 10)
PCR擴增條件包括，在94°C初期變性2 min,然后是30個94°C /30秒、55°C /60秒、 72°C/60秒的循環，最后在72°C延伸7分鐘。用2種限制酶(HhaI和NlaIII)消化片段，得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩爾濃度合并限制酶切碎的擴增子，并用南極磷酸酶(antarctic phosphatase) (NEB)進一步處理，將5’末端脫磷酸。這會防止自身-自身連接，并指導與在陣列上合成的探針的非特異性連接。使用末端轉移酶(TdT，Roche), 用Cy3-ddCTP在它們的3’末端標記碎裂的和脫磷酸的擴增子，并使用本領域技術人員已知的方法，例如參見 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過援引整體并入本文)，從未標記的片段中沉淀出來。將標記的片段與在3’末端用Cy3 (IDT)標記的磷酸化的CPK6寡核苷酸相組合。用NimbleChip HX3 混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微陣列載玻片。將變性的和標記的靶擴增子應用于微陣列。在微陣列上發現的探針包括含有和沒有發夾的探針。在MAUI雜交系統(BioMicro)中，在嚴格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在適當緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進行連接，并在45°C溫育4小時。將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進行掃描。為每次掃描捕獲數據，并使用SignalMap (NimbleGen)和 NimbleScan (NimbleGen)軟件應用程序進行數據分析。結果表明，對于沒有發夾的探針(CPK6對照)，沒有靶物捕獲(圖4)。但是，當探針包含發夾且靶片段序列包含互補的靶堿基時，連接酶會將靶序列連接到探針上。靶序列捕獲對于每個限制片段5’末端的末端堿基的身份是特異性的，使得對于代表序列的部分片段的查詢堿基的每個探針四集體，4個探針中僅有一個具有連接的標記的片段。這導致與每條鏈的四集體中的其它3個堿基的背景強度相比正確連接探針的高信號強度。與含有正確堿基的探針有關的信號強度，完美地鑒別出了 HhaI和NlaIII的限制位點位置的基于序列的預測。
實施例2
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和PCR 擴增子的靶物捕獲
設計實驗來測試帽緣內切核酸酶和在本發明的方法和測定中的連接效率。如實施例1 所述，利用3’標記的CPK6寡核苷酸(IDT)和從大腸桿菌基因組DNA擴增的PCR片段設計實驗。設計了 50和60聚體的寡核苷酸探針，其包含在末端3’末端的16堿基對發夾和互補堿基。使用的發夾序列是fTCCGGAGGATACTCCCJGSISEQ ID NO:〗>。合成了對照探針，其不含有發夾結構。設計了探針的四集體，如圖IA所示，其代表每條鏈的所有4種堿基，這樣為查詢序列內的靶核苷酸設計了共8個探針(例如，4個/DNA靶物的每條鏈)。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在陣列上原位合成探針，密度是210萬探針/陣列(HD2)。使用如前所述的PCR引物和條件，從大腸桿菌基因組DNA擴增了 3個PCR片段。用 2種限制酶(HhaI和NlaIII)消化片段，得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩爾濃度合并限制酶切碎的擴增子，并用南極磷酸酶(NEB)進一步處理，將5’末端脫磷酸。這會防止自身-自身連接，并指導與在陣列上合成的探針的非特異性連接。使用末端轉移酶 (TdT, Roche)，用Cy3-ddCTP在它們的3’末端標記碎裂的和脫磷酸的擴增子，并使用本領域技術人員已知的方法，例如參見 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過援引整體并入本文)，從未標記的片段中沉淀出來。將標記的片段與在3’末端用Cy3 (IDT)標記的脫磷酸化的CPK6寡核苷酸相組合。用NimbleChip HX3 混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微陣列載玻片，并將變性的、標記的靶擴增子應用于微陣列。在微陣列上發現的探針包括含有和沒有發夾的探針。在MAUI雜交系統(BioMicro)中，在嚴格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將在適當緩沖液(10 mM MOPs: pH 7.5， 100 mM LiCl, 4 mM MgCl2 )中的切割酶加到含有結合的靶序列的微陣列載玻片上，將反應物在45°C溫育1小時，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在適當緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進行連接，并在45°C溫育4小時。將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進行掃描。為每次掃描捕獲數據，并使用SignalMap (NimbleGen)和 NimbleScan (NimbleGen)軟件應用程序進行數據分析。結果表明，對于沒有發夾的探針(CPK6對照)，沒有靶物捕獲。但是，當探針包含發夾(其含有與靶序列互補的堿基)且靶序列包含靶堿基時，FEN和連接酶會切割靶序列，并將靶物連接到探針上(分別地)。靶序列捕獲對于互補堿基的身份是特異性的，使得對于代表序列的部分片段的查詢堿基的探針四集體，在切割酶反應后，4個探針中僅有一個具有連接的標記的片段。這導致與每條鏈的四集體中的其它3個堿基的背景強度相比正確堿基調用的高信號強度(圖5)。將四集體內正確的和不正確的堿基之間的差異倍數計算為正確堿基調用的信號強度除以3個不正確的堿基的平均值的比率。如圖5所示，在探針之間檢測到高達35倍的變化倍數，所述探針在陣列上合成，用于查詢PCR擴增子的所有片段。實施例3
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和隨機碎裂的基因組DNA的靶物捕獲利用人和大腸桿菌基因組DNA (gDNA)設計實驗。如實施例1所述，設計寡核苷酸探針，從而在Roche NimbleGen (Madison, WI)上原位合成探針，密度是210萬探針/陣列(HD2)。通過超聲處理碎裂基因組DNA (gDNA)，或使用不同長度的隨機引物(9聚體、10聚體、12聚體和15聚體)，使用克列諾片段，隨機擴增基因組DNA (gDNA)，得到不同長度的擴增的靶序列。用南極磷酸酶處理片段，使用末端轉移酶(TdT)，用Cy3-ddCTP在它們的3’末端進行標記，并使用本領域技術人員已知的方法，從未標記的片段中沉淀出來。用HX3混合器(NimbleGen Roche)密封微陣列載玻片，并將變性的、標記的靶序列應用于微陣列(5_30 Pg樣品/子陣列)。在微陣列上發現的探針包括含有和沒有在它們的3’末端發夾之后且緊鄰的互補堿基的探針，以及沒有發夾的探針。使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將在適當緩沖液中的切割酶加到含有結合的靶序列的微陣列載玻片上，將反應物在42°C溫育1-2小時，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在適當緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進行連接，并在45°C溫育4小時。將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻片，并使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀掃描。通過掃描儀捕獲數據，使用SignalMap (Roche NimbleGen Inc.)和NimbleScan (Roche NimbleGen Inc.)軟件應用程序進行數據分析。結果表明，對于沒有發夾的探針(對照)，沒有靶物捕獲。但是，當探針包含發夾 (其含有互補堿基)且靶序列包含靶堿基時，FEN和連接酶會在鑒定靶物捕獲的序列中提供測定特異性，正如通過熒光檢測方法所測得的。實施例4
具有遞增ssDNA帽緣長度的切割酶的評價
評價了 20種切割酶在切割酶反應中的功效；任意地命名為C1-C5、P1-P3和F1-F12。切割酶由 Third Wave Technologies (Madison, WI 53719)提供。Ampligase (Epicentre, Madison WI)。每個實驗使用2個微陣列載玻片(各自含有12個相同的子陣列)，以覆蓋測定的所有20種切割酶，使用反向化學方法(在探針5’末端是在基質近端時，5’ -3’合成)，通過MAS合成它們的探針，12個子陣列中的每一個含有大約120，0000個探針。將探針設計成代表3種不同的PCR片段，3種片段中每一種的有義和反義鏈。將每個探針設計成具有與靴擴增子序列和16堿基對發夾(序列5，-CCGGAG GATACTCCGG-3，(SEQ ID NO: 1，如圖3 所示)相關的序列特異性，3’突出端代表查詢序列內靶核苷酸的有義和反義鏈(因此，8個探針/ PCR片段)的A、C、T或G。合成了不包含發夾結構的對照探針。擴增了大腸桿菌的3種不同的片段，得到1277、2205和2825堿基對擴增子。通過限制酶切消化，進一步碎裂每個擴增子；用NlaIII消化1277堿基對和2825堿基對擴增子，并用MboI消化2205堿基對擴增子，得到不同長度的消化的片段(圖6)。用南極磷酸酶(NEB)處理片段，以將5’末端脫磷酸。這會防止自身-自身連接，并指導與在陣列上合成的探針的非特異性連接。使用末端轉移酶(TdT，Roche)，用Cy3-ddCTP在它們的3，末端標記碎裂的和脫磷酸的擴增子，并使用本領域技術人員已知的方法，例如參見Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過援引整體并入本文)，從未標記的片段中沉淀出來。將標記的靶核酸變性，并應用到微陣列載玻片上的子陣列上。在MAUI雜交系統 (BioMicro)中，在嚴格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將在切割酶緩沖液(10 mM MOPs的終濃度pH 7.4，100 mMLiCl, 4 mM MgC12, IX NAD)中的20種實驗切割酶和Ampligase 之一加入含有結合的靶序列的微陣列載玻片上的每個子陣列，在45°C溫育反應物2小時，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將另一輪Ampligase (這次在它的適當緩沖液中)加入每個子陣列，在45°C溫育另外4小時。將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，再次洗滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進行掃描。為每次掃描捕獲數據，并使用 SignalMap (Roche NimbleGen Inc.)和 NimbleScan (Roche NimbleGen Inc.)軟件應用程序進行數據分析。圖7證實了切割酶/連接酶組合在測定遺傳序列(在該情況下，PCR片段，其中靶序列在查詢位置具有“C”)中的功效。過夜雜交后，探針序列的結合的靶物之間沒有差別，而切割酶和連接酶的摻入急劇增加了差別，導致在該位置的正確堿基調用。此外，圖8證實，隨著結合的靶片段的5’末端長度的增加(例如，帽緣長度增加)，不正確堿基調用增加。堿基調用或在單核苷酸處的辨別，可以通過計算來確定
權利要求
1.捕獲靶核酸序列的方法，其包含a)提供i)核酸樣品，其中所述核酸樣品可以包含或不包含靶序列，ii)至少一種帽緣內切核酸酶和至少一種連接酶，和iii)復數種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發夾結構，b)在允許靶序列和探針之間發生雜交的條件下，將所述核酸樣品應用于所述寡核苷酸探針，和c)在允許發生酶促反應的條件下，將至少一種帽緣內切核酸酶和至少一種連接酶應用于雜交的核酸/探針復合物，從而捕獲核酸靶序列。
2.權利要求1的方法，其中所述核酸樣品另外包含檢測部分。
3.權利要求2的方法，其中所述檢測部分包含熒光部分。
4.權利要求3的方法，其中所述熒光檢測部分是Cy3。
5.權利要求2的方法，其中使用熒光掃描儀檢測檢測部分。
6.權利要求5的方法，另外包含檢測的靶核酸的數據分析。
7.權利要求1的方法，其中所述核酸樣品包含基因組DNA或其衍生物。
8.權利要求1的方法，其中所述核酸樣品是來自哺乳動物。
9.權利要求1的方法，其中所述核酸樣品是來自人。
10.權利要求1的方法，其中至少一種所述靶序列包含單核苷酸多態性。
11.權利要求1的方法，其中至少一種所述靶序列包含基因組拷貝數變體。
12.權利要求1的方法，其中所述發夾結構包含SEQID NO: 1。
13.權利要求1的方法，其中所述連接酶是熱穩定的連接酶。
14.權利要求1的方法，其中所述探針固定在基質上。
15.權利要求14的方法，其中所述基質是微陣列載玻片。
16.權利要求1的方法，其中所述復數種寡核苷酸探針包含查詢核苷酸。
17.權利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針的末端3’末端處。
18.權利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針5’-側上的發夾結構的近端。
19.權利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針5’-側上的發夾結構的上游約2、3、4、5、6、7、8、9或10個堿基處。
20.權利要求1的方法，另外包含，提供選自RecJ和單鏈結合蛋白的組分。
21.權利要求1的方法，其中所述探針提供雙特異性。
22.捕獲靶核酸的方法，其包含a)提供i)核酸樣品，其中所述核酸樣品包含檢測部分，且可以包含或不包含靶序列，和 )至少一種帽緣內切核酸酶、至少一種連接酶，和iii)復數種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發夾結構，其中所述發夾結構包含至少一種可切割的序列，b)在允許靶序列和探針之間發生雜交的條件下，將所述核酸樣品應用于所述寡核苷酸探針，和c)在允許發生酶促反應的條件下，將至少一種帽緣內切核酸酶和至少一種連接酶應用于雜交的核酸/探針復合物，從而捕獲核酸靶序列。
23.權利要求22的方法，其中所述至少一種可切割的序列包含限制性內切核酸酶位點ο
24.權利要求22的方法，另外包含，通過限制性內切核酸酶消化，從探針釋放核酸靶序列。
25.權利要求24的方法，另外包含，通過測序，檢測所述釋放的靶核酸序列。
26.用于序列特異性的核酸捕獲的組合物，其包含帽緣內切核酸酶、連接酶和寡核苷酸探針，其中所述探針包含發夾結構和互補的靶核酸序列。
27.用于捕獲和檢測核酸序列的試劑盒，其包含a)至少一種帽緣內切核酸酶，b)至少一種熱穩定的連接酶，c)固定在基質上的復數種寡核苷酸探針，和d)至少一種緩沖液。
28.權利要求27的試劑盒，另外包含，選自RecJ和單鏈結合蛋白的組分。
全文摘要
本發明的公開內容提供了用于序列特異性的核酸靶物捕獲的方法和系統，其包含酶促反應。本發明的公開內容涉及使用帽緣內切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢測靶核酸序列的基質(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復數種寡核苷酸探針。
文檔編號C12Q1/68GK102046811SQ200980119976
公開日2011年5月4日申請日期2009年3月31日優先權日2008年4月1日
發明者J·帕特爾, T·艾伯特, V·拉米徹夫申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司

完整全部詳細技術資(zi)料(liao)下載(zai)