專利名稱：：賦予除草劑抗性的grg23和grg51基因的制作方法賦予除草劑抗性的GRG23和GRG51基因發明領域本發明提供了編碼除草劑抗性的新型基因，其可用于植物生物學、農作物育種和植物細胞培養。發明背景N-膦酰曱基甘氨酸，通常稱為草甘膦，是重要的農藝學化合物。草甘膦抑制將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)轉化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。這種酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase);在本文中稱為"EPSPS，，)的抑制通過關閉莽草酸途徑從而抑制芳香族酸的生物合成而殺死植物細胞。因為草甘膦類除草劑抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它們不僅殺死植物細胞，而且對于細菌細胞也有毒性。草甘膦抑制許多細菌的EPSP合酶，因此對這些細菌有毒。然而，某些細菌的EPSP合酶對草甘膦具有高耐受性。對草甘膦毒性有抵抗力的植物細胞可以通過轉化植物細胞以表達草甘膦抗性細菌EPSP合酶來產生。值得注意的是，來自根瘤土壤桿菌(y^ro6a(^er/i/zs^邁e/"ac/e/7S)菌林CP4的細菌基因已用于在植物中在表達后賦予植物細胞以除草劑抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌(&7邊o/7e"aOT^^"r/咖)菌林CT7的突變的EPSP合酶在細菌細胞中賦予草甘膦抗性，并且將草甘膦抗性賦予植物細胞(美國專利號4，535，060;4，769，061;和5,094,945)。然而，需要其他除草劑抗性基因。EPSPS動力學活性可以通過測量磷酸的釋放來進行測定。如本領域已知的(Vazquez等人(2003)J加7/"W"/o^e邊/"ry320:292-298)，通過使用偶聯測定法來檢測磷酸釋放，所述偶聯測定法用于基于^乙酰基-3，7-二羥基吩喁溱(A^acetyl-3，7-dihydroxyphenoxacine)(AmplexRed)的產生來進行磷酸的熒光檢測。公開的測定條件在其中磷酸非常快速釋放的實驗中可以導致測定法的飽和。需要用于測量EPSPS動力學活性的另外方法。發明概述提供了用于將除草劑抗性或耐受性賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子的組合物和方法。所述組合物包括編碼除草劑抗性或耐受性多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的載體，和包含所述栽體的宿主細胞。所述組合物還包括針對除草劑抗性或耐受性多肽的抗體。如所描述的，本發明的核苷酸序列可以在DNA構建體或表達盒中使用以用于轉化生物體并在其中表達，所迷生物體包括微生物和植物。所述組合物還包括轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。另外，提供了用于產生由本發明的合成核苷酸編碼的多肽的方法。提供了編碼除草劑抗性或耐受性多肽的分離的核酸分子及其變體。此外，包括了由賦予除草劑抗性或耐受性的多核苷酸編碼的氨基酸序列及其變體。本發明提供了分離的核酸分子，其包含SEQIDNO:1、3或5中所示的核苷酸序列，編碼SEQIDNO:2、4或6中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，以登記號NRRLB-30888或NRRLB-30949保藏在細菌宿主中的除草劑抗性核苷酸序列，以及其變體和片段。還包括了與本發明的核苷酸序列互補的核苷酸序列，或與本發明的序列雜交的核苷酸序列。還提供了使用熒光底物來測量酶動力學活性的方法。附圖描述圖l顯示了GRG230RF1氨基酸序列(SEQIDNO:2)和GRG51(SEQIDNO:6)與克勞氏芽孢桿菌(5ac///"sc/a"s//)(SEQIDNO:7)、嗜木聚糖紅色桿菌(録/^"";^卿力//:^)(SEQIDNO:8)、大腸桿菌(&c/er/c力/aco//)(SEQIDNO:11)、土壤桿菌屬(々ro^2"er/咖)物種菌林CP4(SEQ訓0:10)和玉蜀黍(Zea邊a")(SEQIDNO:9)的比對。圖2顯示了在0、3、5和10mM的草甘膦濃度時，作為PEP濃度(x軸)的函數的GRG23酶活性(y軸)的散點圖。圖3顯示了作為草甘膦濃度(x軸)的函數的Kffl(app)(y軸)的散點圖。-X截距表示關于草甘膦的發明詳述現在將參考附圖在下文中對本發明進行更充分的描述，其中顯示了本發明的某些但并非所有的實施方案。實際上，本發明可以以許多不同的形式實現，并且不應解釋為限制于本文所闡迷的實施方案；相反，提供這些實施方案以便本公開內容可以滿足可應用的法定要求。相同的數字自始至終指相同的要素。得益于前面的描述和附圖中所呈現的教導，本文闡迷的本發明的許多修飾和其他實施方案對于本發明所屬領域技術人員將是顯而易見的。因此，應當理解，本發明并不限于所公開的具體實施方案，并且希望將修飾和其他實施方案包括在所附權利要求書的范圍內。盡管本文使用了特定的術語，但它們僅以一般和描述性的意義進行使用而不是為了限制目的。本發明涉及用于調節生物體特別是植物或植物細胞中的除草劑抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發明的草甘膦抗性基因的核苷酸序列來轉化生物體。本發明的核苷酸序列可用于制備對除草劑草甘膦顯示出增加的耐受性的植物。因此，提供了轉化的細菌、植物、植物細胞、植物組織和種子。組合物包括涉及微生物和植物中的除草劑耐受性的核酸和蛋白質以及轉化的細菌、植物、植物組織和種子。公開了草甘膦抗性基因(grg"和^^")的核苷酸序列和由其編碼的蛋白質的氨基酸序列。所述序列可用于構建用于隨后轉化到目的植物內的表達載體，用作用于分離其他草甘膦抗性基因的探針，用作選擇標記等。因此，"本發明的草甘膦抗性基因"意指SEQIDN0:l或3中所示的核苷酸序列，及其變體和片段(SEQIDN0:5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32)，它們編碼草甘膦抗性或耐受性多肽。同樣地，"本發明的草甘膦抗性多肽"是具有SEQIDNO:2或4中所示氨基酸序列的多肽，及其變體和片段(SEQIDN0:6、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33)，它們賦予宿主細胞以草甘膦抗性或耐受性。包含本發明的除草劑抗性核苷酸序列的質粒于2005年11月18曰保藏于農業研究機構保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory)(NRRL)的永久收藏中，登記號為冊RLB-30888(gr^J)，并且于2006年6月26日再次進行了保藏，登記號為NRRLB-30949(^r^f7)。這種保藏將根據國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條款進行維持。這種保藏僅僅為了本領域技術人員方便而進行，并非承認保藏是根據35U.S.C.§112所要求的。"草甘膦"意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何鹽)的任何除草劑形式和導致在植物中產生草甘膦陰離子的其他形式。"除草劑抗性蛋白質，，或由于"編碼除草劑抗性的核酸分子"的表達而產生的蛋白質包括將下述能力賦予細胞的蛋白質比不表達該蛋白質的細胞耐受更高濃度的除草劑，或比不表達該蛋白質的細胞更長時間地耐受某一除草劑濃度。"草甘膦抗性蛋白質"包括將下述能力賦予細胞的蛋白質比不表達該蛋白質的細胞耐受更高濃度的草甘膦，或比不表達該蛋白質的細胞更長時間地耐受某一草甘膦濃度。"耐受"或"耐受性"意指存活或者以不容易與未經處理的細胞相區分的方式執行基本的細胞功能例如蛋白質合成和呼吸。分離的核酸分子，及其變體和片段本發明的一個方面涉及分離的核酸分子，其包含編碼除草劑抗性蛋白質和多肽或其生物學活性部分的核苷酸序列；以及足以用作雜交探針以鑒定編碼除草劑抗性的核酸的核酸分子。如本文所使用的，術語"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DM)和RNA分子(例如，mRNA)以及通過使用核苷酸類似物而產生的DM或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。編碼本發明的蛋白質的核苷酸序列包括以登記號NRRLB-30888和NRRLB-30949保藏在細菌宿主中的除草劑抗性核苷酸序列即SEQIDNO:1、3和5中所示的序列，及其變體、片段和互補物。"互補物"意指這樣的核苷酸序列，與給定的核苷酸序列充分互補，如此使得它可以與給定的核苷酸序列雜交從而形成穩定的雙鏈體。關于由這些核苷酸序列編碼的除草劑抗性蛋白質的相應氨基酸序列顯示于SEQIDNO:2、4或6中。本發明還包括包含編碼部分長度的除草劑抗性蛋白質的核苷酸序列的核酸分子，及其互補物。"分離的"或"純化的"核酸分子或者蛋白質或其生物學活性部分，基本上不含其他細胞材料或培養基(當通過重組技術生產時)，或者基本上不含化學前體或其他化學制品(當以化學方法合成時)。優選地，"分離的"核酸不含在該核酸所源自的生物體的基因組DM中天然地位于該核酸側翼的序列(即，位于該核酸的5'和3'末端處的序列)(優選蛋白質編碼序列)。對本發明而言，當用于指核酸分子時，"分離的"不包括分離的染色體。例如，在各種實施方案中，分離的編碼草甘膦抗性的核酸分子可以包含少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在該核酸所源自的細胞的基因組DNA中天然地位于該核酸分子側翼的核苷酸序列。基本上不含細胞材料的除草劑抗性蛋白質包括具有少于約30%、20%、10%或5%(干重)的非除草劑抗性蛋白質(在本文中也稱為"污染蛋白質")的蛋白質制劑。本發明還包括這樣的核酸分子，其為這些編碼除草劑抗性的核苷酸序列的片段。"片段"意指編碼除草劑抗性蛋白質的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼除草劑抗性蛋白質的生物學活性部分，或者它可以是使用下文公開的方法而可以用作雜交探針或PCR引物的片段。作為除草劑抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950個鄰接核苷酸，或高至在本文公開的全長的編碼除草劑抗性的核苷酸序列中存在的核苷酸的數目(例如，對于SEQIDNO:1為1892個核苷酸，對于SEQIDNO:3為1259個核苷酸，和對于SEQIDNO:5為1242個核苷酸)。"鄰接"核苷酸意指彼此緊鄰的核苷酸殘基。本發明的核苷酸序列的片段一般將編碼保留全長草甘膦抗性蛋白質的生物活性即除草劑抗性活性的蛋白質片段。"保留除草劑抗性活性"意指該片段將具有本文公開為SEQIDNO:2、4或6的全長草甘膦抗性蛋白質的至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的除草劑抗性活性。用于測量除草劑抗性活性的方法是本領域眾所周知的。參見，例如，美國專利號4，535，060和5,188,642，所述專利各自通過提及而整體合并入本文。編碼除草劑抗性的核苷酸序列的片段(其編碼本發明蛋白質的生物學活性部分)將編碼至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400個鄰接核苷酸，或高至在本發明的全長除草劑抗性蛋白質中存在的氨基酸的總數目(例如，對于SEQIDNO:2為436個氨基酸，對于SEQIDNO:4為413個氨基酸，和對于SEQIDNO:6為413個氨基酸)。本發明的除草劑抗性蛋白質由與SEQIDNO:1、3或5的核苷酸序列具有足夠同一性的核苷酸序列編碼。術語"具有足夠同一性"意指這樣的氨基酸或核苷酸序列，即通過使用本文描迷的比對程序之一并采用標準參數，其與參照序列相比較具有至少約60%或65%序列同一性，約70%或75%序列同一性，約80%或85%序列同一性，約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。本領域技術人員將會認識到，這些值可以適當地進行調整以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等來確定由2個核普酸序列所編碼的蛋白質的相應同一性。，為了確定2個氨基酸序列或2個核酸的同一性百分比，就最佳比較目的來對序列進行比對。2個序列之間的同一性百分比是由所迷序列共有的相同位置的數目的函數(即，同一性百分比-相同位置的數目/位置(例如，重疊位置)的總數目x100)。在一個實施方案中，2個序列具有相同的長度。2個序列之間的同一性百分比可以使用與下文描述的那些類似的技術來進行確定，其中允許或不允許缺口。在計算同一性百分比中，通常計數準確的匹配。2個序列之間的同一性百分比的確定可以使用數學算法來完成。用于2個序列比較的數學算法的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Sc/.^i^(87:2264-2268的算法，其在Karlin和Altschul(1993)/Voc,組7.5W.咖90:5873-5877中進行了修改的。將此類算法整合入Altschul等人(1990)/.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分=100、字長-12)來進行，以獲得與本發明的GDC樣核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可以用BLASTX程序(得分=50、字長=3)來進行，以獲得與本發明的除草劑抗性蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對，可以使用如Altschul等人(1997)A^c7e/cJc/"Wes.25:3389-3402中所描述的GappedBLAST。備選地，PSI-Blast可以用于執行檢測分子間的遠距離關系的迭代搜索。參見Altschul等人(1997)(同上)。當利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各個程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數學算法的另一個非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)腸/e/'cJc油紐22:4673-4680)。ClustalW比較序列并比對氨基酸或DM序列的整體，因此可以提供關于整個氨基酸序列的序列保守性的數據。ClustalW算法在幾個商購可得的DNA/氨基酸分析軟件包中使用，例如VectorNTIProgramSuite(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的ALIGNX模塊。在用ClustalW比對氨基酸序列后，可以評估氨基酸同一性百分比。可用于ClustalW比對分析的軟件程序的非限制性例子是GeneDocTM。GeneDocTM(KarlNicholas)允許評估多個蛋白質之間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比較的數學算法的另一個非限制性例子是Myers和Miller(1988)C^S/^y4:11-17的算法。此類算法被整合入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序是GCG序列比對軟件包(可從Accelrys，Inc.，SanDiego，CA獲得)的一部分。當利用ALIGN程序來比較氨基酸序列時，可以使用PAM120權重殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分。除非另有說明，采用Needleman和Wunsch(1970)/.Vo/.S/o/.48(3):443-453的算法的GAPVersionIO將被用于測定序列同一性或相似性，其中使用下述參數關于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP權重和3的長度權重，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；關于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用8的GAP權重和2的長度權重，以及BLOSUM62評分矩陣。還可以使用等價的程序。"等價的程序"意指任何這樣的序列比較程序，即對于所研究的任何2個序列，當與由GAPVersion10產生的相應比對相比較時，產生具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對。本發明還包括變體核酸分子。編碼除草劑抗性的核苷酸序列的"變體"包括編碼本文公開的除草劑抗性蛋白質但由于遺傳密碼的簡并性而保守性地不同的那些序列，以及如上所述具有足夠同一性的那些序列(例如，SEQIDNO:5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32是SEQIDNO:l的變體)。天然存在的等位基因變體可以使用眾所周知的分子生物學技術來鑒定，例如如下所述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，其例如通過使用定點誘變產生但仍編碼本發明中公開的除草劑抗性蛋白質，如下所述。本發明所包括的變體蛋白質是在生物學上有活性的，即它們保留了所需的天然蛋白質的生物活性，即除草劑抗性活性。"保留除草劑抗性活性"意指該變體將具有至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的天然蛋白質的除草劑抗性活性。用于測量除草劑抗性活性的方法是本領域眾所周知的。參見，例如，美國專利號4，535，060和5，188，642，所述專利各通過提及而整體合并入本文。技術人員將會進一步意識到，可以通過突變將改變引入本發明的核苷酸序列內，從而導致編碼的除草劑抗性蛋白質的氨基酸序列中的改變，而不改變該蛋白質的生物活性。因此，分離的核酸分子變體可以通過下述方式來制備將一個或多個核苷酸置換、添加或刪除引入本文公開的相應的核苷酸序列中，從而使得將一個或多個氨基酸置換、添加或刪除引入所編碼的蛋白質中。可以通過標準才支術來引入突變，例如通過定點誘變和PCR介導的誘變。此類變體核苷酸序列也包括在本發明內。例如，保守氨基酸置換可以在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行。"非必需，，氨基酸殘基是可以從除草劑抗性蛋白質的野生型序列中進行改變而不改變生物活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基是生物活性所需的。"保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基替代的置換。在本領域中已定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲疏氨酸、色氨酸)，具有P-分枝的側鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。氨基酸置換可以在保留功能的非保守區域中進行。一般而言，此類置換不對保守的氨基酸殘基，或者不對位于保守基序內的氨基酸殘基進行，其中此類殘基是蛋白質活性所需的。然而，本領域技術人員應當理解，功能變體可以具有較少的在保守殘基中的保守或非保守改變。Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411是來自大腸桿菌的EPSP合酶的保守殘基(Sch(inbrunn等人(2001)Jcaff.Sc/.〃W98:1376-1380)。對于EPSP合酶活性重要的保守殘基還包括Arg-100、Asp-242和Asp-384(Selvapandiyan等人(1995)"5^yZe〃ei^374:253-256)。Arg—27與S3P結合(Shuttleworth等人(1999)S/oc力e邊i"iy38:296-302)。備選地，可以通過沿著全部或部分編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變，來制備變體核苷酸序列，并且可以就賦予除草劑抗性活性的能力來篩選所得到的突變體，以鑒定保留活性的突變體。在誘變后，編碼的蛋白質可以重組地表達，并且蛋白質的活性可以通過使用標準測定法技術來測定。使用諸如PCR、雜交等的方法可以鑒定出相應的除草劑抗性序列，此類序列與本發明的序列具有實質的同一性。參見，例如，Sanibrook和Russell(2001)J/o/eci//a_r(7/oni力g..JZa6orator/J/s/7z/a/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)和Innis等人(1990)戶ro^o/s..J￥"Ao(/sa/zdJ卯7/c"/023S(AcademicPress,St.Louis,MO)。在雜交方法中，全部或部分除草劑抗性核苷酸序列可以用于篩選cDNA或基因組文庫。用于構建此類cDNA和基因組文庫的方法是本領域通常已知的，并且在Sambrook和Russell(2001)(同上)中公開。所謂的雜交探針可以是基因組DM片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可檢測基團例如32P或任何其他可檢測標記例如其他放射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子進行標記。可以基于本文公開的已知的編碼除草劑抗性的核苷酸序列，通過對合成的寡核苷酸進行標記來制備用于雜交的探針。可以另外使用基于在所述核苷并引物5探針通常^含這樣的核苷酸^列區k，^述核^酸序列區域體的至少約12個，至少約25個，至少約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600或1800個連續核苷酸雜交。用于制備用于雜交的探針的方法是本領域通常已知的，并且公開于Sambrook和Russell(2001)(同上)以及Sambrook等人(1989)#o/ecu/ar(7/加/i^..jZa6oi""o/y他/7zas/(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)中，所述2個參考文獻通過提及而合并入本文。例如，本文公開的完整除草劑抗性序列，或者其一個或多個部分，可以用作能夠與相應的除草劑抗性序列和信使RNAs特異性地雜交的探針。為了達到在各種條件下的特異性雜交，此類探針包括獨特的并且長度為至少約10個核苷酸和長度為至少約20個核苷酸的序列。此性序列。這種技術可以用于從所需生物體中分離另外的編碼序列，或用作診斷測定法以測定生物體中編碼序列的存在。雜交技術包括鋪板的DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook等人(1989)#o/eci/7a_rCJo刀/跟.爿Zshor"oiy她力u"(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。此類序列的雜交可以在嚴格條件下進行。"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"意指這樣的條件，即在所述條件下探針將與其靶序列雜交，達到相比與其他序列來說可檢測地更大的程度(例如，為背景的至少2倍)。嚴格條件是序列依賴性的并且在不同情況下是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定出與探針100%互補的靶序列(同源探測)。備選地，可以調整嚴格條件以允許序列中的一些錯配，從而使得檢測出較低程度的相似性(異源探測)。一般地，探針長度為小于約1000個核苷酸，或長度為小于約500個核苷酸。通常，嚴格條件是這樣的條件，其中在pH7.0-8.3下鹽濃度小于約1.5MNa離子，通常約0.01-1.0MNa離子濃度(或其他鹽)，以及溫度對于短探針(例如，10-50個核苷酸)為至少約30"C，和對于長探針(例如，超過50個核苷酸)為至少約60X:。嚴格條件還可以用添加去穩定劑如甲酰胺來達到。示例性的低嚴格性條件包括于37。C用30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液進行雜交，和于50-55匸在1X-2XSSC(20XSSC=3.0MNaC1/0.3M檸檬酸三鈉)中進行洗滌。示例性的中等嚴格性條件包括于37C在40-45%甲酰胺、1.OMNaCl、1%SDS中進行雜交，和于55-60t:在0.5X-1XSSC中進行洗滌。示例性的高嚴格性條件包括于37匸在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中進行雜交，和于60-65匸在0.IXSSC中進行洗滌。任選地，洗涂緩沖液可以包含約0.1%-約1%SDS。雜交的持續時間一般少于約24小時，通常為約4-約12小時。特異性通常是雜交后洗滌的函數，關鍵因素是離子強度和最終洗滌溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交物，T;可以從Meinkoth和Wah1(1984)J/a/."/oc/e瓜138:267-284的等式中進行估計乙-81.5匸+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是一價陽離子的摩爾濃度，。/qGC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，和L是以堿基對計的雜交物的長度。l是這樣的溫度，在該溫度下50°/。的互補靶序列與完全匹配的探針雜交(在限定的離子強度和pH下)。對于每1%的錯配，l減少約1°C;因此，可以調整"l、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，那么l可以減少10"C。一般地，嚴格條件被選擇為在限定的離子強度和pH下比關于特定序列和其互補物的熱解鏈點(TJ低約5"C。然而，極端嚴格條件可以利用在比熱解鏈點(l)低1、2、3或41C下的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以利用在比熱解鏈點(Tp)低6、7、8、9或10t下的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以利用在比熱解鏈點(TJ低II、12、13、14、15或20X:下的雜交和/或洗涂。使用該等式、雜交和洗滌組成以及所需Tm，普通技術人員應當理解，內在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴格性中的改變。如果所希望的錯配程度導致低于45X:(水性溶液)或32'C(曱酰胺溶液)的L，那么優選增加SSC濃度，從而使得可以使用更高的溫度。關于核酸雜交的詳細指導可見下述參考文獻Tijssen(1993)Ls6oraforrrecAn/《wes//7A/oc力e邁/str/fl/d第I部分，第2章(Elsevier，NewYork);和Ausubel等人，編輯，(1995)tove/7t戶rofoco/sWecWai^/o/c^7,第2章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)。參見Sambrook等人(1989)#o/ecu/arC7o/7i'73g.'J^a6oratoryi^a/iuai(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。分離的蛋白質及其變體和片段除草劑抗性蛋白質也包括在本發明中。"除草劑抗性蛋白質"或"除草劑耐受性蛋白質"意指具有SEQIDNO:2、4或6中所示的氨基酸序列的蛋白質。還提供了其片段、生物學活性部分和變體，并且它們可以用于實踐本發明的方法。"片段"或"生物學活性部分"包括這樣的多肽片段，所述多肽片段包含SEQIDNO:2、4或6中所示的編碼除草劑抗性蛋白質的氨基酸序列的部分，并保留除草劑抗性活性。除草劑抗性蛋白質的生物學活性部分可以是例如長度為10、25、50、IOO或更多個氨基酸的多肽。此類生物學活性部分可以通過重組技術來制備，并且就除草劑抗性活性來進行評估。用于測量除草劑抗性活性的方法是本領域眾所周知的。參見，例如，美國專利號4，535，060和5，188，642，所述專利各自通過提及而整體合并入本文。如本文所使用的，片段包含SEQIDNO:2、4或6的至少8個鄰接氨基酸。然而，本發明包括其他片段，例如該蛋白質中超過約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400個氨基酸的任何片段。"變體"意指這樣的蛋白質或多肽，其具有與SEQIDNO:2、4或6的氨基酸序列至少約60%、65%,至少約70%、75%,至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列(例如，SEQIDNO:6、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33是SEQIDNO:2的變體)。變體還包括由這樣的核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子在嚴格條件下與SEQIDNO:1、3或5的核酸分子或其互補物雜交。變體包括由于誘變而在氨基酸序列方面不同的多肽。本發明所包括的變體蛋白質是生物學上有活性的，即它們繼續擁有所希望的該天然蛋白質的生物活性，即保留了除草劑抗性活性。用于測量除草劑抗性活性的方法是本領域眾所周知的。參見，例如美國專利號4，535，060和5,188,642，所述專利各自通過提及而整體合并入本文。細菌基因，例如本發明的^rg"或gr^^基因，在開放讀碼框的起始附近十分經常具有多個曱硫氨酸起始密碼子。通常，在這些起始密碼子中的一個或多個處的翻譯起始將導致功能蛋白質的產生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，諸如芽孢桿菌屬物種".)的細菌還將密碼子GTG識別為起始密碼子，并且在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質在第一個氨基酸處包含甲硫氨酸。此外，常常事先不確定這些密碼子中的哪一些天然地在細菌中使用。因此，應當理解，備選的甲硫氨酸密碼子之一的使用可能導致產生賦予除草劑抗性的^rgZ7或gi^57的變體。這些除草劑抗性蛋白質包括在本發明中，并且可以在本發明的方法中使用。還包括了針對本發明的多肽或者其變體或片段的抗體。用于產生抗體的方法是本領域眾所周知的(參見，例如Harlow和Lane(1988)J/7〃6ocf/wJZa6o7""ory船力ws/(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY);美國專利號4，196，265)。改變或改善的變體應認識到，可以通過各種方法來改變^r^J或f^l的DNA序列，并且這些改變可以導致編碼蛋白質的DM序列，所述蛋白質具有與由^rg^或gr^57所編碼的氨基酸序列不同的氨基酸序列。這種蛋白質可以以各種方式進行改變，包括氨基酸置換、刪除、截短和插入。用于此類操作的方法是本領域通常已知的。例如，可以通過DNA中的突變來制備GRG23或GRG51蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通過幾種誘變形式之一和/或通過定向進化來完成。在某些方面，氨基酸序列中所編碼的改變將基本上不影響蛋白質的功能。此類變體將具有所希望的除草劑抗性活性。然而，應當理解，GRG23或GRG51賦予除草劑抗性的能力可以通過對本發明的組合物使用此類技術來進行改善。例如，GRG23或GRG51可以在這樣的宿主細胞中進行表達，所述宿主細胞顯示出高比率的在DNA復制期間的堿基錯摻入，例如XL-1Red(Stratagene，LaJolla，CA)。在此類菌林中進行繁殖后，可以分離出^rg^或^rgi7DNA(例如通過制備質粒DNA，或者通過經由PCR進行擴增并將所得到的PCR片段克隆到載體中)并在非誘變菌林中進行培養。在gr^J或gwi7中包含突變的克隆可以通過測量改善的對于除草劑例如草甘膦的抗性來鑒定，例如通過在濃度漸增的草甘膦中培養細胞，并對于賦予針對濃度漸增的草甘膦的耐受性的克隆進行測試。備選地，可以在氨基或羧基末端處對許多蛋白質的蛋白質序列進行改變而基本上不影響活性。這些改變可以包括通過現代分子方法例如PCR而引入的插入、刪除或改變，所迷方法包括借助于在PCR擴增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長蛋白質編碼序列的PCR擴增。備選地，所添加的蛋白質序列可以包括完整的蛋白質編碼序列，例如本領域通常用于產生蛋白質融合物的那些序列。此類融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白質的表達；(2)引入結合結構域、酶活性或表位以有助于蛋白質純化、蛋白質檢測或本領域已知的其他實驗用途；或(3)將蛋白質的分泌或翻譯耙向至亞細胞器，例如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細胞的內質網，后者常常導致蛋白質的糖基化。本發明的變體核苷酸和氨基酸序列還包括衍生自誘變和重組操作程序例如DNA改組的序列。使用此類操作程序，可以將一個或多個不性蛋白質。以這種方式，從包含這樣的序列區域的相關序列多核苷酸群體中產生重組多核苷酸的文庫，所述序列區域具有充分的序列同一性并可以在體外或體內進行同源重組。例如，使用這種方法，可以在目的結構域的序列基序，以獲得編碼具有改善的目的性質例如增加的草甘膦抗性活性的蛋白質的新基因。用于此類DNA改組的策略是本領域已知的。參見，例如，Stemmer(1994)Proc,Nat1.Acad.Sci.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)370:389-391;Crameri等人(1997)NatureBiltech.15:436-438;Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272:336-347;Zhang等人(1997)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Crameri等人(1998)Nature391:288-291;以及美國專利號5，605，793和5,837,458。細菌或植物細胞的轉化本文提供了新型的分離的基因，其賦予針對除草劑的抗性。還提供了GRG23和GRG51蛋白質的氨基酸序列。由這種基因的翻譯產生的蛋白質允許細胞在存在一定濃度的除草劑的情況下運轉，所述除草劑的濃度在其他情況下對于細胞(包括植物細胞和細菌細胞)有毒。在本發明的一個方面，grgZ3或grg51基因可用作標記來評估細菌或植物細胞的轉化。通過改造grg23或grg51以(1)從已知在待測試的生物體中刺激轉錄的細菌啟動子進行表達，(2)正確地翻譯從而產生完整的GRG23或GRG51肽，和(3)將細胞置于在其他情況下有毒的除草劑濃度中，可以借助于其對除草劑的抗性而鑒定出已用DNA轉化的細胞。"啟動子"意指發揮功能以指導下游編碼序列轉錄的核酸序列。啟動子連同其他轉錄和翻譯調節核酸序列(也稱為"控制序列，，)一起是目的DNA序列表達所必需的。細菌細胞的轉化通過本領域已知的幾種技術之一來完成，包括但不限于，電穿孔或化學轉化(參見，例如Ausubel(編輯)(1990Cwrre/7f戶rofoco/s//2M7eci;/ar(JohnWileyandSons,Inc.,Indianapolis,IN))。賦予針對有毒物質的抗性的標記可用于從未轉化的細胞(不包含或不表達測試DNA的那些細胞)中鑒定出轉化的細胞(已攝取并表達測試DM)。在本發明的一個方面中，grgZ或^r^l基因可用作標記以評估細菌或植物細胞的轉化。植物細胞的轉化可以以類似方式來完成。"植物"意指整個植林、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚胎及其后代。植物細胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。"轉基因植物，，或"轉化的植物"或"穩定轉化的，，植物、細胞或組織指已將外源核酸序列或DNA片段引入或整合到植物細胞內的植物。"穩定的轉化"意指，引入植物內的核苷酸構建體整合到植物的基因組中并能夠由其后代遺傳。可以修飾本發明的^rgZ或gr^l基因以獲得或增強在植物細胞中的表達。本發明的除草劑抗性序列可以在用于在目的植物中表達的表達盒中提供。"植物表達盒，，包括能夠導致在植物細胞中從開放讀碼框表達蛋白質的DNA構建體。所述盒以5'-3'的轉錄方向包含與本發明的DNA序列可操作地連接的轉錄起始區(即，啟動子)，以及在植物中具有功能的翻譯和轉錄終止區(即，終止區)。所述盒可以另外還包含至少一種待共轉化到生物體中的另外的基因，例如選擇標記基因。備選地，所述另外的基因可以在多個表達盒上提供。此類表達盒以具有多個限制位點的形式提供，所述限制位點用于插入除草劑抗性序列以處于調節區的轉錄調節之下。啟動子對于植物宿主和/或本發明的DNA序列來說可以是天然的或類似的，或者外源的或異源的。此外，啟動子可以是天然序列或者備選地是合成序列。當啟動子對于植物宿主是"天然的"或"同源的"時，意指所述啟動子在該啟動子所引入的天然植物內存在。當啟動子對于本發明的DNA序列是"外源的"或"異源的"時，意指所述啟動啟動子。"異源的"一般指這樣的核酸序列，所述核酸序列對于它們所存在于其中的細胞來說不是內源的或者不是天然基因組的一部分，并且已通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊等加入細胞中。"可操作地連接"意指啟動子和第二序列之間的功能連接，其中啟動子序列起始并介導相應于第二序列的DNA序列的轉錄。一般地，可操作地連接意指，被連接的核酸序列是鄰接的，并且在必需使2個蛋白質編碼區聯合在一起時是鄰接的并在同一讀碼框中。通常，此類構建體還將包含5'和3'非翻譯區。此類構建體可以包含"信號序列"或"前導序列"，以有助于目的肽的共翻譯或翻譯后運輸至某些細胞內結構，例如葉綠體(或其他質體)、內質網或高爾基體，或者被分泌。例如，基因可以經改造以包含信號肽從而有助于將肽轉移至內質網。"信號序列"意指已知或懷疑導致穿過細胞膜的共翻譯或翻譯后肽運輸的序列。在真核生物中，這種運輸通常涉及分泌到高爾基體內，其中具有某些發生的糖基化。"前導序列"意指當被翻譯時導致足以引發肽鏈共翻譯運輸至亞細胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，這包括通過進入內質網內，進入液泡、質體(包括葉綠體、線粒體)等中來對運輸和/或糖基化實施靶向的前導序列。還可以改造植物表達盒以包含內含子，從而使得內含子的mRNA加工是表達所需的。"3'非翻譯區"意指位于編碼序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信號序列和編碼能夠影響向mRM前體的3'末端添加多腺苷酸束的調節信號的其他序列是3'非翻譯區。"5'非翻譯區"意指位于編碼序列上游的核苷酸序列。其他上游或下游非翻譯元件包括增強子。增強子是用于增加啟動子區的表達的核苷酸序列。增強子是本領域眾所周知的，并且包括但不限于，SV40增強子區和35S增強子元件。終止區可以對于轉錄起始區來說是天然的，可以對于本發明的除草劑抗性序列來說是天然的，或可以衍生自另一種來源。方便的終止區可從根瘤土壤桿菌的Ti質粒中獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶的終止區。還可參見Guerineau等人(1991)淑.Ce/2.一".262:141-144;Proudfoot(1991)&//64:671-674;Sanfacon等人(1991)6^/es"er.5:141-149;Mogen等人(1990)^W/2:1261-1272;Munroe等人(1990)Ce/7e91:151-158;Ballas等人(1989)iV"c/e/c17:7891-7903;和Joshi等人(1987)^c/e/cJc/ff及es.15:9627-9639。在適當時，可以就在轉化的宿主細胞中的表達增加來優化所述基因。即，可以使用宿主細胞偏愛的密碼子來合成所述基因以獲得改善的表達，或者可以通過以宿主偏愛的密碼子使用頻率使用密碼子來合成所述基因。一般地，將增加基因的GC含量。關于宿主偏愛的密碼子使用的討論，可參見例如Campbell和Gowri(1990)腳"o/.92:1-11。用于合成宿主偏愛的基因的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利號6，320，100;6，075，185;5，380，831;和5，436，391，美國公開申請號20040005600和20010003849，和Murray等人(1989)^/c/e/cJc/'^17:477-498，其通過提及而合并入本文。在一個實施方案中，目的核酸被靶向葉綠體以進行表達。以這種方式，當目的核酸不直接插入葉綠體內時，表達盒將另外包含編碼轉運肽的核酸以將目的基因產物導向葉綠體。此類轉運肽是本領域已知的。參見，例如VonHeijne等人(1991)戶/az^S/o/.Aep.9:104-126;Clark等人(1989)/.丑/oA264:17544—17550;Della-Cioppa等人(1987)戶/a/^腳"o/.84:965-968;Romer等人(1993)Woc力e瓜k.196:1414-1421;和Shah等人(1986)5^/e力ce233:478-481。可以就在葉綠體中的表達來優化被靶向葉綠體的目的核酸，以解決植物細胞核和這種細胞器之間的在密碼子使用方面的差異。以這種方式，可以使用葉綠體偏愛的密碼子來合成目的核酸。參見，例如，美國專利號5,380,831，通過提及而合并入本文。通常，這種"植物表達盒"將被插入"植物轉化載體"中。"轉化載體"意指對于細胞的有效轉化來說所必需的DNA分子。此類分子可以由一個或多個表達盒組成，或可以組織入超過一個的"載體，，DNA分子中。例如，二元載體是植物轉化載體，其利用2個非鄰接DNA載(Hellens和Mullineaux(2000)rre/7ifs/'/7戶/s/2f5^/e/ce5:446-451)。"載體"指設計用于在不同宿主細胞之間進行轉移的核酸構建體。"表達載體，，指具有將異源DNA序列或片段引入、整合入外源細胞中并在其中表達該異源DNA序列或片段的能力的載體。這種植物轉化載體可以由對于實現植物轉化所需的一個或多個DNA載體構成。例如，利用由超過一種鄰接DNA區段構成的植物轉化栽體是本領域中常見的實踐。這些栽體在本領域中通常稱為"二元載體"。二元載體以及具有輔助質粒的載體最常用于土壤桿菌介導的轉化，其中對于實現有效轉化所需的DM區段的大小和復雜性相當大，并且將功能分散到分開的DNA分子上是有利的。二元栽體通常包括質粒栽體，所述質粒載體包含對于T-DNA轉移所需的順式作用序列(例如左邊界和右邊界)、經改造從而能夠在植物細胞中表達的選擇標記、和"目的基因，，(經改造從而能夠在對于其希望產生轉基因植物的植物細胞中表達的基因)。在這種質粒載體上還存在有細菌復制所需的序列。順式作用序列以允許有效轉移到植物細胞內并在其中表達的方式排列。例如，選擇標記基因和目的基因位于左和右邊界之間。通常，第二質粒載體包含介導T-DNA從土壤桿菌轉移到植物細胞的反式作用因子。這種質粒通常包含毒力功能(Vir基因)，其允許用土壤桿菌感染植物細胞，并通過在邊界序列處進行切割和vir介導的DNA轉移來轉移DNA，如本領域中所了解的(Hellens和Mullineaux(2000)7re油戶/a/7"c/e飾，5:446-451)。幾類土壤桿菌屬菌林(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物轉化。第二質粒載體不是通過其他方法例如微粒轟擊、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等轉化植物所必需的。植物轉化本發明的方法涉及將核苷酸構建體引入植物內。"引入"意指以使得該構建體進入植物細胞內部的方式將核苷酸構建體呈遞給植物。本發明的方法不要求使用用于將核苷酸構建體引入植物的具體方法，只要求使該核苷酸構建體進入植物的至少一個細胞的內部。用于將核苷酸構建體引入植物內的方法是本領域已知的，包括但不限于，穩定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導的方法。一般而言，植物轉化法涉及將異源DNA轉移到靼植物細胞(例如，未成熟或成熟的胚胎、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)中，隨后應用最大閾值水平的合適選擇(取決于選擇標記基因，在這種情況下為"草甘膦")，以從未轉化的細胞群體中回收轉化的植物細胞。通常將外植體轉移到新鮮供應的相同培養基中并進行常規培養。隨后，在置于補充有最大閾值水平的選擇試劑(例如，"草甘膦")的再生培養基上后，使轉化的細胞分化成幼芽。然后將幼芽轉移至選擇性生根培養基中以用于回收生根的幼芽或小植物。然后，轉基因小植物生長為成熟植物并產生能育的種子(例如，Hiei等人(1994)r力e尸/a/2t/owi77"6:271-282;Ishida等人(1996)組wr"/"ec細/o^r14:745-750)。通常將外植體轉移到新鮮供應的相同培養基中并進行常規培養。用于產生轉基因植物的技術和方法的概括性描述可以在Ayres和Park(1994)Cr/7/c"//7/Va/z"c/e/7ce13:219-239以及Bommi織i和Jauhar(1997)42:107-120中找到。因為轉化的材料包含許多細胞；所以轉化的和未轉化的細胞存在于受試靶愈傷組織或組織或細胞群的任何部分中。殺死未轉化的細胞并允許轉化的細胞增殖的能力導致產生轉化的植物培養物。通常，去除未轉化的細胞的能力是快速回收轉化的植物細胞和成功產生轉基因植物的限制條件。分子和生物化學法可以用于證實轉基因植物的基因組中存在整合的異源目的基因。轉基因植物的產生可以通過幾種方法之一來進行，包括但不限于，通過土壤桿菌將異源DM引入植物細胞內(土壤桿菌介導的轉化)，用與粒子附著的異源外源DNA轟擊植物細胞，和用于轉移DNA的各種其他非粒子直接介導的方法(例如，Hiei等人(1994)7Ze戶/a/^/o固a/6:271-282.'Ishida等人(1996)A""i/r"/o^c力/2o/o^r14:745-750;Ayres和Park(1994)CW〃c"/力？/a/7f5We"ce13:219-239;Bommineni和Jauhar(1997)他/d/ca42:107-120)。用于轉化葉綠體的方法是本領域已知的。參見，例如，Svab等人(1990)尸rociVa〃./^aASc/.ySJ87:8526-8530;Svab和Maliga(1993)尸rocYfl〃.^caA5W'.Z/5^90:913-917;Svab和Maliga(1993)/.12:601-606。該方法依賴于包含選擇標記的DM的基因槍遞送并通過同源重組將該DNA靶向質體基因組。此外，質體轉化可以通過核編碼且質體指導的RNA聚合酶的組織偏愛的表達，經由沉默的質體攜帶的轉基因的反式激活來完成。此類系統已在McBride等人(1994)戶roc.^caA91:7301-7305中得到報道。已轉化的細胞可以依照常規方法生長為植物。參見，例如，McCormick等人(1986)戶/aWCW/腳or"5:81-84。然后，可以讓這些植物進行生長，并用相同的轉化林或不同林進行授粉，并且鑒定出具有所需表型特征的組成型表達的所得到的雜種。可以生長兩代或更多代以確保所需表型特征的表達被穩定地維持和遺傳，并隨后收獲種子以確保已獲得了所需表型特征的表達。以這種方式，本發明提供了經轉化的種子(也稱為"轉基因種子")，其具有本發明的核苷酸構建體，例如穩定地整合入其基因組內的本發明的表達盒。EPSPS活性的測量在本發明的一個實施方案中，草甘膦抗性EPSPS酶具有約1-約150uM的的關于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km，包括約2uM，約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或約140uM，以及約500-約1000、約550、約600、650、700、750、800、850、900、950或高達約1000的K,(草甘膦)/Kn(PEP)。如本文所使用的，在大約pH7，在酶服從米-曼動力學的條件下測量1L和Ki。一種非限制性測量技術在pH7和室溫下在氯化鉀和HEPES緩沖液中使用純化形式的酶，并使用0-10mM的草甘膦濃度。EPSPS動力學活性可以例如通過測量磷酸的釋放來進行測定，所述磷酸的釋放在EPSPS的底物(例如，PEP和S3P)被催化成其后續反應產物(例如，5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸)期間產生，其中使用由Vazquez等人(2003)^a/.A/oc力e瓜320(2):292-298描述的熒光測定法。這種測定法基于非熒光化合物A^乙酰基-3，7-二羥基吩噍喚(AmplexRed,Invitrogen，Carlsbad,CA)被過氧化氬氧化成熒光4匕合物試卣靈(Zhou和Panchuk—Voloshina(1997)J力a/."/oc力e瓜253:169-174)。該反應依賴于嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黃噪呤氧化酶(XOD)和辣根過氧化物酶(HRP)對于磷酸的利用。磷酸釋放與由于AmplexRed轉化成試卣靈而產生的熒光水平相關。可以例如使用濾波熒光計、平板閱讀器、分光熒光計、分光光度計等，通過使用本領域眾所周知的方法來測量熒光。由該反應產生的熒光可以使用設定為約530-約560nm范圍中的激發和約590nm的發射的熒光計來檢測。可以在約565nm處檢測吸光度(例如，使用分光光度計或平板閱讀器)。在一個實施方案中，本發明包括對先前報道的測定條件的改變，以擴大該測定法的動態范圍以適應更廣泛范圍的底物濃度。所述改變包括至少1U/ml，約1-約1.25U/ml，約1.25-約1.5U/ml，約1.5-約2U/ml，或大于2U/ml的XOD濃度；大于0.1U/ml，約0.1-約0.5U/ml，約0.5-約1U/ml，約1-約1.5U/ml，約1.5-約2U/ml，或大于2U/ml的PNP濃度；和大于100juM，約100-約200ILiM，約200-約300jLiM，約300-約400nM，約400-約500juM，約500-約600juM，約700-約800uM，約800-約900juM，約900-約1000juM，或大于約1000juM的Amplex⑧Red濃度。這種修飾可以應用于測量任何酶的動力學活性的測定法，其中在由該酶催化的反應期間釋放出砩酸。植物本發明可以用于轉化任何植物種類，包括但不限于，單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油籽油菜、蕓苜屬物種(^ra^/ca早)、苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘類樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅果、杏樹、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包括但不限于，番茄、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆，以及甜瓜屬(&c"邁")的成員，例如黃瓜、羅馬甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限于，杜鵑花、綉球、木槿、玫瑰花、郁金香、水仙花、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優選地，本發明的植物是農作物植物(例如，玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜等)。本發明特別適合于單子葉植物家族的任何成員，包括但不限于，玉蜀黍、稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、薯蕷、洋蔥、香蕉、椰子和棗椰子。植物轉化的評估在將異源外源DNA引入植物細胞內后，通過各種方法來證實異源基因已轉化或整合入植物基因組中，所述方法例如為分析與整合的基因相關的核酸、蛋白質和代謝產物。PCR分析是在移植到土壤中之前的較早階段時就整合的基因的存在來篩選轉化的細胞、組織或幼芽的快速方法(Sambrook和Russell(2001)#o/ecw/<2r67o/7//7《..JZs6or"or/艙/i/W(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。PCR使用對目的基因或土壤桿菌栽體背景等特異的寡核苷酸引物來進行。可以通過基因組DNA的Southern印跡分析來證實植物轉化(Sambrook和Russell(2001),同上)。一般而言，從轉化體中提取總DNA，用合適的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中進行分級，并轉移至硝酸纖維素或尼龍膜上。隨后，可以用例如放射標記的"P靶DNA片段來探測膜或"印跡"，以才艮據標準技術(Sambrook和Russell,2001,同上)來證實引入的基因整合到植物基因組中。在Northern分析中，從轉化體的特定組織中分離RNA，在曱醛瓊脂糖凝膠中進行分級，并根據本領域常規使用的標準操作程序印跡到尼龍濾紙上(Sambrook和Russell(2001)，同上)。隨后，通過采用本領域已知的方法將濾紙與衍生自GDC的放射性探針雜交來測試由grg^或^r^57編碼的RNA的表達(Sambrook和Russell(2001)，同上)。可以對轉基因植物進行Wastern印跡法和生物化學測定法等，以通過標準操作程序來確定由除草劑抗性基因編碼的蛋白質的存在(Sambrook和Russell(2001)，同上)，其中使用與除草劑抗性蛋白質上存在的一種或多種表位結合的抗體。提供了下述實施例，這是為了舉例說明而不是為了限制。實施例實施例1:ATX21308的分離通過將土壤樣品鋪板在包含磷酸鹽和50mM草甘膦的富集基本培養基3(EnrichedMinimalMedia3，EMM3)上來分離ATX21308。因為EMM3不包含芳香族氨基酸，所以菌林必須對草甘膦有抗性以便在這種培養基上生長。將約l克土壤懸浮于約10ffll水中，并在渦旋混合器中混合5秒。將100ji1這種懸浮液加入含磷酸鹽但不含草甘膦的1mlEMM3中。EMM3包含(每升，pH7.0):10g蔗糖、lgNH4Cl、0.2gMgS04.7H20、0.01gFeS04.7H20、0,007gMnS04'H20以及10ml含(每升，pH7.0)n0gNa2HPO4和90gNaH2PO4的磷酸鹽溶液。在組織培養輥筒(rollerdrum)上于21TC振蕩過夜，并隨后在包含50mM草甘膦的E固3瓊脂上進行鋪板。3天后，將分離物在LuriaBertani(LB)瓊脂上進行鋪板，以證實單一形態學。6天后，將單個菌落在包含50mM草甘膦的EMM3瓊脂上進行劃線培養。分離物在50mM草甘膦平板上生長過夜。由于其在高草甘膦濃度存在下生長的能力而選擇出一個特定菌林，并命名為ATX21308。就其在液體培養中在草甘膦存在下生長的能力對該菌林進行測試，并且該菌抹能夠在受試條件下生長直至高達約300mM草甘膦。實施例2:粘粒文庫的制備和篩選使用本領域通常已知的方法從ATX21308的培養物中提取總DNA。用限制酶^wJ"部分消化該DNA,并且4艮據制造商的說明書將其與SuperCos(Stratagene)載體片段進行連接。使用GigaPackIIIXL包裝提取物(Stratagene)將連接產物包裝到噬菌體顆粒中，轉染到大腸桿菌細胞內，并且在包含50jug/ml卡那霉素的LB瓊脂上進行鋪板以選擇包含粘粒的菌落。將獨個菌落挑取到包含LB液體培養基和50jLig/ml卡那霉素的384孔平板內，并且生長至飽和。將來自這些培養物的細胞以1:IO進行稀釋，隨后點樣到包含50jug/ml卡那霉素和0mM、10mM、20mM或50mM的草甘膦的M63瓊脂平板上。[M63瓊脂培養基，100mMKH2P04、15mM(NH4)2S04、50juMCaCl2、1jiMFeS04、50juMMgCl2、55mM葡萄糖、25mg/LL-脯氨酸、10mg/L硫胺素HC1、足夠的NaOH(以將pH調整至7.0)和15g/L瓊脂]。分離出在更高的草甘膦濃度下更快速地生長的轉化體，并用限制酶&0)I進行消化，以鑒定具有共享的限制模式的粘粒。鑒定出在草甘膦存在下生長并且共享相似的I限制模式的幾個克隆。這些粘粒克隆之一，pAX1924,被選擇用于進一步的實驗。實施例3:鑒定粘粒pAX1924中的^rg^為了鑒定負責由粘粒PAX1924所顯示的草甘膦抗性的基因，用轉座元件誘變處理來自該克隆的DNA。在這種方法中，鑒定出已經歷轉座子插入并已喪失賦予草甘膦抗性的能力的克隆。轉座子插入的定位鑒定出了負責草甘膦抗性表型的開放讀碼框。才艮據制造商的方案，使用EZ::TNInsertionKit(Epicentre,Madison,WI)對粘粒pAX1924實施體外轉座子誘變。這種方法將轉座子片段隨機插入粘粒DM中并因此隨機破壞粘粒中的基因的功能。這種特定的轉座子包含編碼針對三甲氧芐二氨嘧啶的抗性的基因，因此通過在那種抗生素存在下生長的能力可以選擇出轉座子插入克隆。可以通過限制性片段作圖或者通過用在轉座子中退火的引物進行測序來測定轉座子插入的位置。將pAX1924的轉座子插入克隆在包含草甘膦的M63培養基上進行鋪板。鑒定多個含轉座子的克隆，其已喪失在草甘膦存在下生長的能力，這表明轉座子已破壞了負責抗性的基因。對于包含轉座子插入的pAX1924的區域，使用本領域眾所周知的測序方法來測定DNA序列。使用這種序列信息，合成DNA引物并用于測定在包含轉座子插入的區域中的pAX1924的DNA序列。對所得到的DNA序列進行的分析顯示，這個區域包含單基因。該基因在本文中命名為gr^又grg"的分析顯示，由于有效的備選翻譯起始位點的存在，它能夠在細菌細胞中產生2種可能的蛋白質。第一個0RF(0RF1)從SEQIDN0:1的第109-111位上的GTG起始密碼子開始，并且在SEQIDNO:1的核苷酸1417-1419上的TAG終止密碼子處結束。第二個0RF(0RF2)在SEQIDNO:1的核苷酸178-180上的ATG起始密碼子處開始，并且在SEQIDNO:1的核苷酸1417-1419上的TAG終止密碼子處結束。0RF1的翻譯產生SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。0RF2的翻譯產生SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列。對^"^J周圍的DM區域的分析暗示，0RF2之前為核糖體結合位點，而在0RF1翻譯起始點前沒有明顯的核糖體結合位點。此外，這兩個開放讀碼框與代表性的EPSPS酶的比對顯示，少數EPSPS酶包含有在0RF1內編碼的這種N-末端延長部分。因此，在細菌中由gr^^編碼的功能0RF是0RF2。因此，如本文所使用的，GRG23指由0RF2(SEQIDNO:1的核苷酸178-1419)編碼的那種。然而，本領域眾所周知的是，EPSPS酶對于在其N-末端處的額外氨基酸是非常耐受的。因此，0RF1(SEQIDNO:1的核苷酸109-1419)的表達也應當產生賦予草甘膦抗性的EPSPS。為了測試0RF2充當EPSPS并將草甘膦抗性賦予細胞的能力，可以將這個開放讀碼框亞克隆到大腸桿菌內并在其中表達。實施例4:將^r《^亞克隆到載體中以用于在大腸桿菌中進行表達>使用與上文概述相同的克隆策略將編碼GRG230RF2(從ATG(SEQIDNO:1的第178-180位)開始，表達413個氨基酸的蛋白質)的基因亞克隆到pUC18和pRSFlb中。合成PCR引物[5'CAGGGATCCGGCATGGAAACTGATCGACTAGTG3']，其在緊挨起始位點的5'處添加位點及隨后的GGC(5'-GGATCCGGC-3')。合成第二種引物[5'ATTGGCGCGCCCTAGCCGGGGAGCGTAAG3']，其在緊挨終止序列的3'處添加hcl位點(5'-GGCGCGCC-3')。使用PFUULTRADNA聚合酶(Stratagene)通過PCR擴增^rg^編碼區。在^f吏用這些引物PCR擴增grg"并用^邊肌/J"I限制性消化后，將PCR產物連接到pUC19(用和hcl消化)和pRSFlb(用Sa/zM和hcl消化)中，并且獲得包含插入片段的菌落。通過限制性消化和通過DNA測序來證實pUC18-gr^^克隆(在本文中命名為pAX1927)。類似地，用化/Z7肌和Acl消化表達載體pAX1909,并且將包含該片段的載體通過本領域眾所周知的方法進行凝膠純化。pAX1909是PRSF-lb(Novagen，SanDiego，CA)的衍生物，其經修飾以包含在編碼富含組氨酸的"His-Tag"的區域的3'處緊接的^邊肌位點。因此，克隆到pAX1909中的蛋白質是包含額外的氨基酸MAHHHHHHGSG的框內融合蛋白質。通常開發載體例如pAX1909用于蛋白質的表達和純化，并且這些方法是本領域眾所周知的。將上文產生的經消化的PCR產物連接到經消化的pAX1909載體中，并且獲得包含插入片段的菌落。通過限制性消化和通過DNA測序來證實pAX1909-gr^J克隆(在本文中命名為pAX1926)。pAX1926的構建方式是這樣的，即使得預測的GRG23翻譯產物包含由MAHHHHHH組成的氨基末端延長部分。該N-末端延長部分包含可用于促進GRG23蛋白純化的"組氨酸標簽"或"6-His標簽"，如本領域眾所周知。包含gr^J0RF2的質粒pAX1926已于2005年11月18日保藏于農業研究機構保藏中心(NRRL)，并且分配有登記號NRRLB-30888。實施例5:^^Z賦予針對高水平的草甘膦的抗性將pUC18-Grg23構建體(pAX1927)轉化到大腸桿菌菌林DH5cx內，并在補充有羧芐青霉素(0.1mg/mL)的LB瓊脂平板上進行鋪板。選擇2個菌落，重懸浮于無菌水中，并且在包含0mM、25mM、50mM或100mM的草甘膦的M63平板上進行劃線培養。還向平板中添加異丙基-B-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG;0.lmM)。作為對照，轉化包含單獨的pUC18載體的細胞并且在草甘膦平板上進行劃線培養。生長2天后，檢查這些平板的生長(表l)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>這個結果證實，表達gr^J以產生GRG23-0RF2在大腸桿菌中賦予了針對至少100mM的草甘膦抗性。此外，包含pAX1927的大腸桿菌的生長在草甘膦存在下強于在草甘膦不存在的情況下。實施例6:GRG23與其他蛋白質的同源性GRG23的推導的氨基酸序列與EPSPS酶具有同源性，這表明grg^7編碼EPSPS。對GRG-0RF2的推導的氨基酸序列(SEQIDNO:4)的檢查揭示出，它不包含II類EPSPS酶典型的4個結構域。因此，它是新型的、非II類的、草甘膦抗性的EPSPS。對公眾可獲得的蛋白質數據庫例如SWISSPROT進行的搜索揭示出，GRG23與廣泛類別的EPSPS酶具有氨基酸相似性。然而，任何數據庫中均沒有蛋白質與GRG23氨基酸序列具有超過50%的同一性。GRG23與其他EPSPS酶的代表性比對顯示于圖1中。實施例7:GRG23的純化在用IPTG誘導后，在大腸桿菌中表達pRSFlb-gr^J構建體(pAX1926)，并使用鈷層析柱進行單步純化，如本領域中已知的。在柱洗脫后，使純化的GRG23針對50mMHEPES/100mMKC1(pH7.0)進行透析。如通過PAGE所評估的，該蛋白質的純度超過95%。使用Bradford法來定量GRG23的量，如本領域中眾所周知的(Bradford(1976)J/33/,5/oc力e邁.72:248-254)。實施例8:GRG23活性的動力學測定使用涉及于pH7.0在包含氯化鉀和HEPES的緩沖液中溫育PEP(Sigma,St.Louis,MO)和S3P的動力學測定法，就EPSPS活性來測定純化的蛋白質的樣品。如本領域眾所周知的(Vazquez等人(2003)J加A"/oc力e邁.320:292-298)，使用偶聯測定法來檢測磷酸釋放，所述偶聯測定法用于基于AmplexRed的產生來進行磷酸的熒光檢測。公開的測定條件在其中磷酸非常快速釋放的實驗中可以導致測定法的飽和。這種飽和在一定程度上限制了該測定法的動態范圍，并且要求限定的酶濃度范圍。已確定，對熒光磷酸測定法的動力學限制顯然是由于因素的組合，包括肌苷和PNP的限制。在本發明中，已開發出了測定法條件，其產生本質上改善的動態范圍并允許使用更廣泛范圍的酶和底物濃度。已明顯改變的測定法條件包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、AMPLEXRed和肌苷的濃度，這些中的每一個在該測定法中在濃度方面增加以適應更高速率的磷酸周轉。將這種測定法調整適合于用于測量96孔形式中的EPSPS活性，其具有下述改善表2.改善的熒光測定法<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>酶促測定法在96孔平板中以50uL的總體積來進行。反應在室溫下于pH7.0進行。將除PEP、EPSPS和S3P外的所有測定法組分合并到MasterMix中，并使用多道移液器等分到96孔平板中。然后，向每個孔中加入合適的PEP濃度。制備EPSPS的新鮮稀釋物并加入合適的孔中。通過添加S3P來起始每種測定法。將速率數據進行繪圖，并且通過應用米-曼等式并使用非線性曲線擬合程序(KALEIDAGRAPH,SynergySofware)來測定L和K。"動力學參數。Ki數據通過下述方式來進行測定測量在多個草甘膦濃度下的lL(app)，并且作為抑制劑濃度的函數來對Km(app)進行繪圖。表3.草甘膦對于GRG23的Kn(app)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>通過作為草甘膦濃度的函數對L(app)進行繪圖，可以獲得GRG23的草甘膦抗性的線性表示。所得到的直線的X截距表示-Ki。用表3中所示的數據繪制這條線產生了下述數據表4.GRG23的動力學值<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>GRG23對于草甘膦是具有高度抗性的，其具有超過9mM的Ki和超過800的KJL比。實施例9:ATX21313的分離對于菌林ATX21313,將約1克土壤懸浮于10ml水中，并且將100y1用于接種1ml具有礦物鹽培養基A(MSMA)但不含草甘膦的培養物。MSMA包含(每1升，pH7.0)1gNH4C1、10g蔗糖、0.2gMgS04.7H20、0.01gFeS04.7H20、0.007gMnS04.H20，并補充有磷酸鹽。在過夜溫育后，將該培養物在包含MSMA和50mM草甘膦的固體培養基上進行鋪板，溫育數天，并接種到LuriaBertani瓊脂平板上，以證實單一菌落類型。在50mM草甘膦存在下的生長通過在MSMA，50mM瓊脂平板上再生長來再次證實。這種分離方法產生菌林ATX21313，它能夠在這些條件下良好生長。實施例10:草甘膦抗性EPSP合酶的克隆從菌林ATX21313中提取基因組DNA,并且將所得到的DNA用限制酶Az/Wl進行部分消化，從而產生大小約5千堿基的DNA片段。在瓊脂糖凝膠上按大小選擇這些DNA分子，純化，并連接到用&邊肌預消化的LAMBDAZAP頃載體臂中。然后，將連接的臂包裝到噬菌體顆粒中，并且如本領域已知的測定噬菌體滴度。通過本領域已知的方法來擴增所得到的文庫，從而產生3x10'-3x108PFU/mL的文庫滴度。對于每個獨立的文庫，隨后用來自經擴增的文庫的噬菌體以及M13輔助噬菌體一起共轉染大腸桿菌(XLlBlueMR『)，以允許將該文庫大量切出為感染性環狀ssDNA的形式，如本領域已知的(Short等人(1988)腸/e/cJc油16:7583-7600)。在共轉染的細胞離心后，將包含噬菌體的上清液加熱至65-70C并持續15-20分鐘，以使任何殘留的X噬菌體顆粒喪失能力。將所得到的ssDNA質粒文庫的稀釋物轉染到感受態大腸桿菌XL1BlueMRP細胞以及XL-BlueMRF(Aard)細胞(XL1BlueMRP)的新鮮培養物中。將所得到的經轉染的細胞鋪板在包含卡那霉素、0.1mMIPTG和0mM、20mM或50mM的草甘膦的M63平板上。這種篩選法允許鑒定包含草甘膦耐受性EPSP合酶的克隆，以及攜帶針對草甘膦的耐受性的克隆。在AarW菌林或XL-BlueMRF'中挑取在20mM或50mM草甘膦上生長的菌落，并且通過限制性消化來分析它們的質粒以鑒定具有共享的限制模式的質粒。通過本領域已知的方法對獨個質粒進行測序，優先考慮賦予針對50niM草甘膦的抗性的質粒。使用本領域已知且理解的這種方法，并有時關于每個文庫對該方法進行修飾，鑒定了包含EPSP合酶基因的文庫克隆。在EPSP合酶的區域中測定所得到的克隆的區域的序列。實施例11:EPSP合酶的DNA和蛋白質序列對于pAX1967，通過本領域眾所周知的方法測定草甘膦抗性EPSP合酶的DNA序列。gr^57的DNA序列在本文中以SEQIDNO:5提供。^r^57的預測的翻譯產物(GRG51)在本文中以SEQIDNO:6提供。GRG51顯示出與GRG23(SEQIDNO:2)的97%的氨基酸同一性。包含grgW的質粒pAX1967已于2006年6月26日保藏于農業研究機構保藏中心(NRRL)，并且分配有登記號NRRLB-30949。表5概括了GRG23和GRG51與其他EPSP合酶的同源性。表5.GRG23-0RF1和GRG51與代表性EPSPS酶的氨基酸同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實施例12:將新型草甘膦抗性EPSP合酶克隆到大腸桿菌表達載體中將包含在pAX1967中的gi^5/基因亞克隆到大腸桿菌表達載體pRSFlb(Invitrogen)中。所得到的克隆通過DM測序來證實，并且用于在大腸桿菌中誘導gr^l的表達。然后，如本領域已知的，純化表達的具有His標簽的蛋白質。實施例13:EPSP合酶的草甘膦抗性將包含pAX1967的細胞鋪板在包含抗生素和O血M或20mM草甘膦的M63+平板上。于37C生長2天后對生長進行評分。觀察到GRG51在大腸桿菌細胞中賦予針對20mM草甘膦的抗性(表6)。表6.草甘膦篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實施例14:sy力^r^^的設計和表達i殳計并合成編碼GRG23蛋白(SEQIDNO:2;于2005年12月1日提交的美國專利申請號60/741,166)的新型基因序列。這種序列以SEQIDNO:12提供。通過本領域已知的方法將在本文中命名為"《7/7^^2J"的這個開放讀碼框克隆到表達栽體pRSFlb(Invitrogen)中。將編碼GRG23的^^^rg^基因克隆到pUC19載體中以產生pAX748。將在這個載體中位于^F/7^rg2J側翼的PCR引物用于從pAX748中擴增s"^^Z，其中使用MUTAZYMEII系統(Stratagene)以將隨機突變引入i^/^W"編碼區中。該模板在易錯PCR反應體系中以l:50稀釋，并且擴增進行30個循環。將所得到的PCR產物用限制酶&范肌和5^yl進行消化，凝膠純化，并連接到栽體pRSFlb中，以產生經^秀變的s/i7gr^^文庫。將經誘變的sj7^r^J文庫轉化到大腸桿菌菌林BL21*DE3star(Invitrogen)中。在轉化后，將獨個的菌落鋪板在包含150mM草甘膦的lxM63培養基上，以選擇已保留酶活性和生長耐受性的克隆。實施例15:在平板上就草甘膦抗性進行篩選將文庫連接產物轉化到BL21*DE3感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen)中。轉化根據制造商的說明來進行，并具有下述修飾。于37。C在SOC培養基中溫育1小時后，細胞通過離心(5分鐘，1000xg，4C)進行沉淀。細胞用1mlM63+進行洗滌，再次離心，并傾析出上清液。細胞用1mlM63+進行第二次洗滌，并重懸浮于200ulM63+中。對于選擇在大腸桿菌中賦予草甘膦抗性的突變型GRG23酶，將細胞鋪板在包含150mM草甘膦、0.05mMIPTG(異丙基-p-D-硫代吡喃半乳糖苷)和50ug/ml卡那霉素的M63+瓊脂培養基平板上。M63+培養基包含100mMKH2P04、15mM(NH4)2S04、50jLiMCaCl2、l|iMFeS04、50jnMMgCl2、55mM葡萄糖、25mg/LL-脯氨酸、10mg/L硫胺素HC1、足夠的NaOH(以將pH調整至7.0)和15g/L瓊脂。平板于37"溫育36小時。挑取獨個菌落并且排列在384孔平板上。以這種方式制備2塊384孔平板。從在缺乏草甘膦的平板上生長的菌落中挑取具有384個克隆的第3塊平板。實施例16:草甘膦抗性GRG23變體的分離和分析通過在草甘膦平板上生長來鑒定用經誘變的S7/7^^Z和/或r^J變體轉化的BL21*DE3細胞。制備經誘變的^7^rg"和/或^rg"變體的提取物并且就改善的酶活性進行測定。將在草甘膦平板上鑒定的菌落點樣到包含LB培養基的96孔模塊中，并且生長至約0.6的0.D.。然后添加IPTG(0.5mM)并且使模塊于20t:溫育過夜以誘導蛋白質表達。4吏用POP培養試劑(Novagen)和Lysonase(Novagen)從細胞粒狀沉淀中制備蛋白質提取物，并且在使提取物于37C加熱30分鐘后測量粗制裂解物中的酶活性。選擇其活性比包含合適的對照蛋白質(例如GRG23)的一組提取物的平均值高2個標準差的提取物以用于進一步的分析。將在作為粗提取物進行溫育后顯示出增加的活性的克隆在250mLLB培養基中進行生長，并且用IPTG誘導蛋白質表達。在溫育后，使用鈷樹脂(Novagen)，通過親和層析法從每種培養物中純化突變型GRG23蛋白。然后，于371C加熱0、2、4和約16小時后，就酶活性來測試純化的蛋白質。實施例17:改善的GRG23變體從經誘變的^r/7^r^7的DNA文庫中鑒定了具有改善的活性的幾個克隆。測定了相應于這些提取物的克隆的DNA序列。表7顯示了在保留草甘膦抗性的6個GRG23變體中鑒定的氨基酸變化編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.B20)(SEQIDNO:27)的grg》JW。,(SEQIDNO:26);編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.B3)(SEQIDNO:29)的grg^(^J戶/.(SEQIDNO:28);編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.F18)(SEQIDNO:31)的^rg"尸7《J(SEQIDNO:30);和編碼氨基酸序列GRG23(L3P1.023)(SEQIDNO:32)的^rg^(^J/77.(SEQIDNO:31)。表7.在草甘膦抗性GRG23變體中鑒定的突變<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>將克隆在250mLLB培養基中進行生長，并且蛋白質表達如上所述進行誘導和分離。然后，于371C加熱0、2、4和約16小時后，就酶活性來測試純化的蛋白質。發現稱為"M5"的一個克隆于37n進行延長的溫育后保留了比例增加的其酶活性(表8)。測定這個克隆的DNA序列，并且該基因在本文中命名為gr《i^(SEQIDNO:14)。從gi^Z"ce/乂表達的蛋白質被命名為GRG23(ACE1)(SEQIDNO:15)。表8.在升高的溫度時GRG23(ACE1)對GRG23的半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>GRG23(ACE1)相對于野生型GRG23蛋白來說包含2個氨基酸置換A49—T和S276—T。包含這種基因的pRSFlb載體被命名為pAX3801。圖1顯示了在升高的溫度時GRG23(ACE1)對GRG23的相對穩定性。實例18:GRG-23變體的EPSPS活性的測定如于2005年12月1日提交的美國專利申請號60/741，166中所描述的，就EPSP合酶活性來測定包含GRG23變體蛋白質的提取物，所述專利通過提及而整體合并入本文。根據制造商的說明，在5Gul總體積中進行測定法，所述總體積包含0.5mM莽草酸-3-磷酸、200uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1U/ml黃噤呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、1U/ml辣根過氧化物酶、0-2mM草甘膦、50mMHEPES/K0HpH7.Q、1QQmMKC1和AMPLEXRed(Invitrogen)。將提取物與除莽草酸-3-磷酸外的所有測定法組分一起在室溫下溫育5分鐘，并且通過添加莽草酸-3-磷酸來開始測定法。使用SpectramaxGeminiXPS熒光分光計(MolecularDy訓ics，激發555mn;發射590nm)來測量EPSP合酶活性。在如前所述(于2005年12月1日提交的美國專利申請號60/741,166)對純化的蛋白質進行動力學參數的完全測定后，對于通過本領域已知的Bradford測定法測定的蛋白質的量進行調整。對于任何一種草甘膦濃度，作為廣泛范圍的PEP濃度的函數，測量EPSP合酶活性。<吏用KALEIDAGRAPH⑧軟件(SynergySoftware)將所述數據擬合至米-曼等式，并用于測定在那種草甘膦濃度下EPSP合酶的Km(表觀L)。表觀L值在不少于4個草甘膦濃度下進行測定，并且由表觀Km對草甘膦濃度的圖來計算關于草甘膦的EPSPS的Ki，使用本領域已知的等式(ml*x/(m2+x);ml=1;m2=1)。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例19:grg23(ace2)的鑒定GRG23(ACE1)相對于GRG23而言包含2個氨基酸變化。為了確定這些位置上的另外置換是否能夠進一步改善活性，產生了導致獲得表達蛋白質的克隆的DNA文庫，所述蛋白質在GRG23的第49和276位上本質上進行了突變。賦予草甘膦抗性的克隆通過在草甘膦平板上的生長進行選擇，并且如所描迷的進行生長和就動力學性質進行測定。令人驚訝的是，編碼GRG23(ACE2)蛋白質(SEQIDNO:17)的在本文中命名為(^cW,(SEQIDNO:16)的1個克隆被鑒定為具有改善的熱穩定性。^^^^ace2j的DNA序列顯示，GRG23(ACE2)包含單個氨基酸變化(GRG23的殘基276變成精氨酸)。實施例20:GRG23和GRG51的比較，和不同殘基的誘變產生2個文庫以評估來自GRG23和GRG51的氨基酸序列比較的可能的氨基酸序列的變換。第一個文庫將來自GRG51氨基酸序列的變異引入^^^7^ce^J編碼區中。第二個文庫將來自GRG23(ACE2)的氨基酸序列的變異引入^^57編碼區中。就下述方面來評估所得到的文庫的克隆(1)將草甘膦抗性賦予細胞的能力，和(2)于37C進行延長的溫育后的活性。對總共10個克隆進行測序并更詳細地進行分析。相對于GRG23(ACE2)和GRG51，編碼蛋白質GRG51，4(SEQIDNO:19)的在本文中命名為gr^57.SEQIDNO:18)的1個特定克隆包含幾個氨基酸變化。隨后將相對于GRG23(ACE2)而言在GRG51.4中存在的氨基酸變化引入^r^J"cWJ基因中，以產生(SEQIDNO:20)，其編碼GRG23(ACE3)蛋白(SEQIDNO:21)。相對于GRG23和GRG23(ACE2)而言，GRG23(ACE3)顯示出更優的活性和熱穩定性。對GRG23(acel)進行誘變，并且測試克隆以鑒定表達具有改善的熱穩定性和/或活性的變體的克隆。借助于其改善的動力學性質來鑒定出1個克隆，即編碼GRG23(L5P2.J2)(SEQIDN0:23)的^rg"(^i"尸么/29(SEQIDNO:22)。GRG23(L5P2.J2)相對于GRG23(ACE1)而言包含3個氨基酸變化，如下表10中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>寡核苷酸誘變用于制備這樣的克隆，所述克隆在(^ce"編碼區中包含每一個在GRG23(L5P2.J2)中鑒定的氨基酸變化。l個克隆被鑒定為編碼具有超過GRG23(ACE3)的改善的動力學性質的蛋白質，并命名為V^""ce^(SEQIDN0:24)。由g/^Jf編碼的蛋白質被命名為GRG23(ACE4)(SEQIDNO.25)，其相對于GRG23(ACE3)而言包含單個氨基酸變化(纈氨酸101至苯丙氨酸)。基于這個結果，進行分開的寡核苷酸誘變以測試第101位處的每個可能的氨基酸置換的動力學。與GRG23(ACE4)相比較，沒有一種氨基酸變化導致動力學性質的進一步的改善。表ll.改善的變體的動力學<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實施例21:改造^rg^或^pJ7以用于植物轉化通過PCR從全長cDNA模板擴增gr^J或^r^l開放讀碼框(ORF)。在PCR過程中給ORF的每個末端添加)W/^in限制位點。此外，緊挨該基因的起始密碼子的5'處添加核苷酸序列ACC，以增加翻譯效率(Kozak(1987)腸/e/c力c油7esearc力15:8125-8148;Joshi(1987)jVwc/e/cJc/&ye"arc力15:6643-6653)。克隆PCR產物并使用本領域眾所周知的技術進行測序，以確保在PCR期間沒有引入突變。用消化包含^r^J或f^57PCR產物的質粒，并且分離包含完整ORF的片段。將這個片段克隆到質粒pAX200的III位點內，所述質粒pAX200是包含稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人(1991)231:150-160)和PinII終止子(An等人(1989)戶/a/^Ce//1:115-122)的植物表達載體。將來自這種中間質粒的啟動子-基因-終止子片段亞克隆到質粒pSBll(JapanTobacco,Inc.)中，以形成最終質粒例如pSBllGRG23。如此地組織pSBllGRG23，即使得包含啟動子-^^2>終止子構建體的3.91kbDNA片段可以通過用f/wI和戶邊eI雙消化而切出，并用于通過氣溶膠束注射(aerosolbeaminjection)轉化到植物中。通過限制性消化和凝膠電泳，并通過在各種克隆接頭間進行測序來驗證PSB11GRG23的結構。通過使用本領域眾所周知的三親林交配操作程序并且在包含壯觀霉素的培養基上鋪板，來使該質粒移動到根瘤土壤桿菌菌林LBA4404內，所述菌林LBA4404還具有質粒pSBl(JapanTobacco,Inc.)。質粒pSBllGRG23攜帶壯觀霉素抗性但卻是窄宿主范圍質粒，并且在土壤桿菌中不能復制。當pSBllGRG23通過同源重組而整合到廣宿主范圍質粒pSBl中時，產生壯觀霉素抗性菌落。pSBl和pSBllGRGU的共整合產物通過Southern雜交來進行驗證。具有共整合物的土壤桿菌菌林用于通過Purelntro方法(JapanTobacco)來轉化玉蜀黍。實施例22:將grg^或gr^57轉化到植物細胞中在授粉后8-12天收集玉蜀黍穗。從穗中分離胚胎，并且將大小0.8-1.5mm的那些胚胎用于轉化。將胚胎以盾蓋側向上的方式放置在合適的溫育培養基上，例如DN62A5S培養基(3.98g/LN6鹽；1mL/L(1000x母液)N6維生素；800mg/LL-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(lmg/mL母液)2,—D)。然而，除DN62A5S外的培養基和鹽也是合適的并且是本領域已知的。將胚胎在黑暗中于25X:溫育過夜。將所得到的外植體轉移至網眼方陣(30-40個/平板)，轉移至滲透培養基上并保持30-45分鐘，隨后轉移至束射平板(beamingplate)(參見，例如，PCT發明者B·卡爾,B·梵德博洛,C·L·彼得斯,J·欣森,L·C·斯考滕,P·E·哈默申請人:阿則耐克斯公司