誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法、外胚層祖細胞、外胚層祖細胞在制備藥物中的用途、誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基、試劑盒及試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途。所述誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法包括：在抑制干細胞合成前列腺素E2的條件下，對所述干細胞進行誘導培養。由此，本發明的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
【專利說明】
誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物醫學領域。具體地，本發明涉及誘導干細胞分化成外胚層祖細胞 的方法。更具體地，本發明涉及誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法、外胚層祖細胞、外 胚層祖細胞在制備藥物中的用途、誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基、試劑盒及試 劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途。
【背景技術】
[0002] 干細胞(Stem Cell)是一類具有自我更新、高度增殖能力及多向分化潛能的細胞， 是機體內各種組織器官發育及功能維持的種子細胞來源。目前已知干細胞向神經細胞分化 過程基本模擬神經細胞在體內發育的各個時期，即外胚層祖細胞階段、神經干細胞階段，并 最終分化為神經元和膠質細胞等多種類型的成熟神經細胞。因此，誘導干細胞高效分化為 外胚層祖細胞是提高干細胞向成熟神經細胞分化效率的關鍵環節。
[0003] 然而，目前誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法仍有待進一步研究。

【發明內容】

[0004] 本發明是基于發明人的下列發現而完成的：
[0005] 目前由干細胞誘導分化為神經元的誘導方案存在誘導效率低、分化調控機制不 清、誘導細胞體內功能性不完善的缺陷，給該技術的臨床應用前景蒙上了陰影。
[0006] 發明人驚奇地發現，在干細胞早期分化命運決定過程中，前列腺素 E2發揮關鍵的 調控作用。在誘導體系中，通過抑制干細胞合成前列腺素 E2，能夠促進干細胞向外胚層祖細 胞分化，并促進外胚層祖細胞的形成。
[0007] 進而，在本發明的第一方面，本發明提出了一種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞 的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括:在抑制干細胞合成前列腺素 E2的條件下，對 所述干細胞進行誘導培養。由此，能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率 尚。
[0008] 在本發明的第二方面，本發明提出了一種外胚層祖細胞。根據本發明的實施例，所 述外胚層祖細胞是由前面所描述的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法得到的。由此， 根據本發明實施例的外胚層祖細胞誘導分化效率高，并具有較強的分化為神經干細胞的潛 力。
[0009] 在本發明的第三方面，本發明提出一種前面所描述的外胚層祖細胞在制備藥物中 的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用于治療中樞神經系統退行性疾病。由此，根據本 發明實施例的外胚層祖細胞在制備藥物中的用途具有極佳的應用前景。
[0010] 在本發明的第四方面，本發明提出了一種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養 基。根據本發明的實施例，所述培養基包括:基礎培養基，以及前列腺素 E2合成抑制劑。由 此，利用根據本發明實施例的培養基能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導 效率高。
[0011] 在本發明的第五方面，本發明提出了一種試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑 盒包括前列腺素 E2合成抑制劑。由此，利用根據本發明實施例的試劑盒能夠有效地誘導干 細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0012] 在本發明的第六方面，本發明提出了一種試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細 胞中的用途。由此，能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0013] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0014] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0015]圖1顯示了根據本發明一個實施例的基因表達分析圖；以及
[0016] 圖2顯示了根據本發明一個實施例的細胞表面標志蛋白表達分析統計圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發 明，而不能理解為對本發明的限制。
[0018] 需要說明的是，術語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以 明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。
[0019] 本發明提出了誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法、外胚層祖細胞、外胚層祖 細胞在制備藥物中的用途、誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基、試劑盒及試劑盒在 誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途，下面將分別對其進行詳細描述。
[0020] 誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法
[0021] 在本發明的第一方面，本發明提出了一種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方 法。根據本發明的實施例，所述方法包括:在抑制干細胞合成前列腺素 E2的條件下，對干細 胞進行誘導培養。在干細胞的正常分化過程中，可以分化成外胚層祖細胞、內胚層祖細胞及 中胚層祖細胞。發明人驚奇地發現，通過抑制前列腺素 E2的合成，能夠有效地誘導干細胞定 向分化成外胚層祖細胞，進而向成熟的神經細胞分化，且誘導效率高。
[0022] 根據本發明的實施例，上述誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法還可以具有下 列附加技術特征：
[0023] 根據本發明的實施例，誘導培養采用誘導培養基，并且誘導培養基包括:基礎培養 基，以及前列腺素 E2合成抑制劑。發明人發現，在誘導培養過程中，基礎培養基能夠使干細 胞進行生長及分化，前列腺素 E2合成抑制劑將抑制前列腺素 E2的合成，從而促進干細胞誘 導分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0024] 本發明所使用的術語"前列腺素 E2"為本領域技術人員所公知，是人體內廣泛存在 的一種重要生長和調節因子。它是一類含有20個碳原子的不飽和脂肪酸，其基本骨架為一 個五碳環和兩條側鏈，在體內由花生四稀酸(arachidonic acid，AA)經過氧化途徑而生成。 當機體細胞受到某些機械、物理或者化學刺激時，細胞的磷脂酶A2 (phospholipase，PLA2) 被激活，使與膜結合的AA游離，然后通過環氧合酶（C0X-1或C0X-2)作用轉換為PGH2 (prostaglandin H2)，PGH2經細胞特異性酶作用迅速生成具有生物活性的前列腺素類介 質。
[0025]根據本發明的實施例，前列腺素 E2合成抑制劑為吲哚美辛。前列腺素 E2的合成依 賴于其關鍵性的合成限速酶一環氧合酶。發明人發現，通過抑制環氧合酶的酶活性，能夠抑 制細胞內前列腺素 E2的合成。進而，發明人經過深入研究發現，吲哚美辛抑制環氧合酶的酶 活性效果最佳，進而能夠導致前列腺素 E2合成受阻，使得干細胞誘導分化為外胚層祖細胞 的分化效率顯著提高。由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法 能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0026]根據本發明的實施例，前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~ΙΟμΜ。發明人經過深入 研究發現，在此最優濃度下，能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率進一 步提高。濃度過大或者過小都將影響干細胞的生長或分化。
[0027]根據本發明的實施例，基礎培養基包括:95體積％的混合培養基，該混合培養基是 將頂DM培養基與F12培養基按照3:1的體積比混合得到的；1體積的％谷氨酰胺；1體積％的 胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物；1體積％的非必需氨基酸；〇. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的 SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及1體積％的鏈霉素。發明人發現，在此最 優基礎培養基中，干細胞生長良好，并能夠有效地分化成為外胚層祖細胞，且誘導效率高。 [0028]需要說明的是，本發明所使用的術語"IMDM培養基"、"F12培養基"、"非必需氨基 酸"、"SB431542"及"bFGF"為本領域技術人員所公知，對獲得來源不做嚴格限定，既可通過 市售獲得，也可自行制備。根據本發明的具體實施例，IMDM培養基可以購自ThermoFisher公 司，貨號為12440053 ;F12培養基可以購自ThermoFisher公司，貨號為11765054;非必需氨基 酸可以購自ThermoFisher公司，貨號為11140050; SB431542可以購自Stemgent，貨號為04-0010;bFGF可以購自P印rotech公司，貨號為100-18b。
[0029] 根據本發明的實施例，方法包括：（1)將干細胞在MEF飼養層共培養體系中進行第 一培養；（2)將步驟（1)所得到的細胞在無飼養層培養體系中進行傳代培養；（3)將步驟(2) 所得到的細胞進行消化，并將得到的消化產物進行離心，收集離心產物；（4)將離心產物進 行重懸，并將得到的重懸細胞接種至基質膠培養基中進行第二培養；以及(5)將步驟(4)所 得到的細胞轉至誘導培養基中進行誘導培養，從而得到外胚層祖細胞。發明人發現，將第一 培養所得到的細胞在無飼養層培養體系中進行傳代培養，細胞生長迅速，狀態均一，且無異 源細胞引入，對誘導造成干擾。由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞 的方法能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率較高。
[0030] 需要說明的是，"MEF飼養層共培養體系"及"無飼養層培養體系"為本領域技術人 員所公知。"MEF飼養層共培養體系"主要是指以胎鼠成纖維細胞為飼養層的干細胞培養體 系，"無飼養層培養體系"主要是指以基質膠為培養基質的干細胞培養體系。
[0031] 根據本發明的實施例，傳代培養進行至少5代。發明人發現，隨著培養時間延長，細 胞分裂增殖進入活躍期并成克隆化生長，細胞數量顯著增多，并逐漸在培養基底壁形成匯 合的細胞層，細胞之間因接觸性抑制作用而增殖減緩，故需要進行傳代培養。傳代至少5代， 得到的細胞純度較好，生長狀態較為穩定。由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外 胚層祖細胞的方法能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率較高。
[0032]本發明所使用的術語"傳代培養"為本領域技術人員所公知的，是指通過模擬體內 生理環境等特定的體外培養條件下，對細胞進行孵育培養，使之生存并增殖。根據本發明的 具體實施例，將第一培養所得到的細胞進行消化，得到第1代細胞，該過程稱為傳代培養1 代。然后，取第1代細胞轉接至基質膠上進行培養，得到第2代細胞，該過程稱為傳代培養2 代，依次類推，當傳代培養至少5代時，所得到的細胞生長活性較好，適用于誘導培養，且誘 導效率較高。
[0033]根據本發明的實施例，消化是將步驟(2)所得到的細胞置于消化酶中，37攝氏度下 孵育5~7分鐘。發明人經過深入研究發現，在此消化條件下能夠使細胞脫離培養基質，得到 細胞團塊。根據本發明的具體實施例，待克隆邊緣卷起時，加入mTeSR培養基終止消化反應。 由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法能夠有效地誘導干細胞 分化成外胚層祖細胞，且誘導效率較高。
[0034]根據本發明的實施例，第二培養至克隆貼附并開始進入擴增期時，進行誘導培養。 [0035]根據本發明的實施例，離心是在900~1200rpm的轉速下進行3~5分鐘，優選是在 900rpm的轉速下進行5分鐘。由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的 方法能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率較高。
[0036]根據本發明的實施例，誘導培養是在37攝氏度下進行36~120小時，優選48小時。 發明人經過深入研究發現，在此條件下進行誘導培養，能夠使干細胞有效地分化得到外胚 層祖細胞。
[0037] 外胚層祖細胞
[0038]在本發明的第二方面，本發明提出了一種外胚層祖細胞。根據本發明的實施例，外 胚層祖細胞是由前面所描述的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法得到的。由此，根據 本發明實施例的外胚層祖細胞誘導分化效率高，并具有較強的分化為神經干細胞的潛力。
[0039] 本領域技術人員能夠理解的是，前面針對誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法 所描述的特征和優點，同樣適用于該外胚層祖細胞，在此不再贅述。
[0040] 外胚層祖細胞在制備藥物中的用途
[0041] 在本發明的第三方面，本發明提出一種前面所描述的外胚層祖細胞在制備藥物中 的用途。根據本發明的實施例，藥物用于治療中樞神經系統退行性疾病。由此，根據本發明 實施例的外胚層祖細胞在制備藥物中的用途具有極佳的應用前景。
[0042] 根據本發明的實施例，藥物用于治療阿爾茨海默癥。由此，根據本發明實施例的外 胚層祖細胞在制備藥物中的用途具有極佳的應用前景。
[0043]術語"治療"用于指獲得期望的藥理學和/或生理學效果。所述效果就完全或部分 預防疾病或其癥狀而言可以是預防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導致的不 良作用而言可以是治療性的。本文使用的"治療"涵蓋哺乳動物、特別是人的疾病，包括：（a) 在容易患病但是尚未確診得病的個體中預防疾病(例如預防中樞神經系統退行性疾病)或 病癥發生；（b)抑制疾病，例如阻滯疾病發展;或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關的癥狀。 [0044]本領域技術人員能夠理解的是，前面針對外胚層祖細胞所描述的特征和優點，同 樣適用于該外胚層祖細胞在制備藥物中的用途。
[0045] 誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基
[0046] 在本發明的第四方面，本發明提出了一種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養 基。根據本發明的實施例，培養基包括:基礎培養基，以及前列腺素 E2合成抑制劑。由此，利 用根據本發明實施例的培養基能夠有效地使干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。 [0047]根據本發明的實施例，前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~ΙΟμΜ。發明人經過深入 研究發現，在此最優濃度下，能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率進一 步提高。濃度過大或者過小都將影響干細胞的生長或分化。
[0048]根據本發明的實施例，前列腺素 Ε2合成抑制劑為吲哚美辛。前列腺素 Ε2的合成依 賴于其關鍵性的合成限速酶一環氧合酶。發明人發現，通過抑制環氧合酶的酶活性，能夠抑 制細胞內前列腺素 Ε2的合成。進而，發明人經過深入研究發現，吲哚美辛抑制環氧合酶的酶 活性效果最佳，從而導致前列腺素 Ε2合成受阻，使得干細胞誘導分化為外胚層祖細胞的分 化效率顯著提高。由此，根據本發明實施例的誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基能 夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0049] 根據本發明的實施例，基礎培養基包括:95體積％的混合培養基，該混合培養基是 將頂DM培養基與F12培養基按照3:1的體積比混合得到的；1體積的％谷氨酰胺；1體積％的 胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物；1體積％的非必需氨基酸；〇. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的 SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及1體積％的鏈霉素。發明人發現，在此最 優基礎培養基中，干細胞生長良好，并能夠有效地分化成為外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0050] 需要說明的是，本發明所使用的術語"IMDM培養基"、"F12培養基"、"非必需氨基 酸"、"SB431542"及"bFGF"為本領域技術人員所公知，對獲得來源不做嚴格限定，既可通過 市售獲得，也可自行制備。根據本發明的具體實施例，IMDM培養基可以購自ThermoFisher公 司，貨號為12440053 ;F12培養基可以購自ThermoFisher公司，貨號為11765054;非必需氨基 酸可以購自ThermoFisher公司，貨號為11140050; SB431542可以購自Stemgent，貨號為04-0010;bFGF可以購自P印rotech公司，貨號為100-18b。
[0051 ]試劑盒
[0052]在本發明的第五方面，本發明提出了一種試劑盒。根據本發明的實施例，試劑盒包 括前列腺素 E2合成抑制劑。由此，利用根據本發明實施例的試劑盒能夠有效地使干細胞分 化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0053]根據本發明的實施例，前列腺素 E2合成抑制劑為吲哚美辛。前列腺素 E2的合成依 賴于其關鍵性的合成限速酶一環氧合酶。發明人發現，通過抑制環氧合酶的酶活性，能夠抑 制前列腺素 E2的合成。進而，發明人經過深入研究發現，吲哚美辛抑制環氧合酶的酶活性效 果最佳，從而導致前列腺素 E2合成受阻，使得干細胞誘導分化為外胚層祖細胞的分化效率 顯著提高。由此，根據本發明實施例的試劑盒能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞， 且誘導效率高。
[0054]根據本發明的實施例，包括基礎培養基，基礎培養基包括:95體積％的混合培養 基，該混合培養基是將MDM培養基與F12培養基按照3:1的體積比混合得到的；1體積的％谷 氨酰胺；1體積％的胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物；1體積％的非必需氨基酸;〇. 〇5g/L的牛血 清白蛋白；1 〇μΜ的SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及1體積％的鏈霉素。發 明人發現，在此最優基礎培養基中，干細胞生長良好，并能夠有效地分化成為外胚層祖細 胞，且誘導效率高。
[0055]根據本發明的實施例，前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~10uM。發明人經過深入 研究發現，在此最優濃度下，能夠有效地誘導干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率進一 步提高。濃度過大或者過小都將影響干細胞的生長或分化。
[0056] 試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途
[0057] 在本發明的第六方面，本發明提出了一種試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細 胞中的用途。由此，能夠有效地使干細胞分化成外胚層祖細胞，且誘導效率高。
[0058]本領域技術人員能夠理解的是，前面針對試劑盒所描述的特征和優點，同樣適用 于該試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途，在此不再贅述。
[0059] 下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條 件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀 器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0060] 干細胞:來源于美國Wicell研究中心建立國際公認的人胚胎干細胞系H1和H9。
[0061] 共培養培養體系：由E13.5天ICR品系小鼠胚胎分離獲取的成纖維細胞作為飼養 層。
[0062] 無飼養層培養體系:Matrigel基質膠和mTeSR培養基。
[0063] mTeSR培養基：購自Stemcell公司。
[0064]基質膠:購自BD公司。
[0065] IMDM 培養基：購自 ThermoFisher公司。
[0066] F12培養基：購自 ThermoF i sher 公司。
[0067] 非必需氨基酸:購自ThermoFisher公司。
[0068] SB431542:購自 Stemgent 公司。
[0069] bFGF:購自Peprotech公司。
[0070] 實施例1
[0071 ]誘導干細胞分化成外胚層祖細胞
[0072]按照下列方法誘導干細胞分化成外胚層祖細胞：
[0073] 1、誘導培養基：
[0074] 95體積％的混合培養基，混合培養基是將頂DM培養基與F12培養基按照3:1的體積 比混合得到的；1體積的％谷氨酰胺；1體積％的胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物；1體積％的非 必需氨基酸；0. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉 素；以及1體積％的鏈霉素。
[0075] 2、步驟：
[0076] (1)在傳代前一天復蘇MEF細胞，并將其接種到0.1 %明膠溶液預包被的孔板中。24 小時后，吸棄干細胞培養基，并用DF12培養基潤洗細胞1次，加入lmg/ml四型膠原酶溶液對 細胞進行消化。約10-20分鐘后，細胞克隆邊緣開始卷曲，吸棄四型膠原酶，并加入培養基進 行中和潤洗，將細胞輕柔吹下來，900rpm離心4分鐘，并將細胞沉淀用新鮮的干細胞培養基 進行重懸，并接種到含有MEF飼養層細胞的培養孔中繼續培養5~7天。
[0077] (2)將細胞轉移至無飼養層培養體系中，每天更換mTeSR培養基，待細胞克隆達到 90%以上的匯合度后，吸棄培養基后加入分散酶，37°C孵育消化7分鐘，用mTeSR培養基終止 消化反應，將克隆吹打成小細胞團塊后離心，900rpm離心5分鐘，吸棄上清后用mTeSR培養基 重懸細胞，將得到的細胞轉移至新的無飼養層培養體系中，進行培養，如此傳代培養5代。 [0078] (3)吸棄培養基后加入分散酶，37°C孵育消化7分鐘，用mTeSR培養基終止消化反 應，將克隆吹打成小細胞團塊后離心，900rpm離心5分鐘，吸棄上清后用mTeSR培養基重懸細 胞，將細胞接種到基質膠預包被的孔板中過夜培養，克隆貼附并開始進入擴增期時換入誘 導培養基，誘導48小時后收集細胞。
[0079] 實施例2
[0080]外胚層祖細胞的鑒定
[00811 將實施例1所得到的細胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTANaW^消化液處理1~ 3分鐘，使細胞脫離培養基質并成為單細胞，加入含10 %胎牛血清的培養基進行中和消化， 1200rpm離心5分鐘，用冷roS緩沖液潤洗細胞，將細胞沉淀收集于1.5ml EP管中，使用細胞 總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN 74104)，按其使用說明裂解細胞并提取細胞 內總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度后，使用反轉錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，T0Y0B0 FSQ-201)將lyg總RNA反轉錄為cDNA。將cDNA、引物同qPCR反 應預混試劑（THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix,T0Y0B0QPS-201)混合，通過Bio-Rad公司的 opticon 2熒光實時定量PCR儀對目的基因進行擴增，以人GATOH基因表達量為參照。PCR反 應體系為：
[0083]每個樣本反應獨立重復三次以消除系統誤差。
[0084] 用上述方法對誘導細胞基因 mRNA表達水平進行鑒定，鑒定基因包括外胚層祖細胞 分化基因 GBX2、HoxAl、S0Xl及ZIC1，以及神經干細胞標志基因 PAX6,檢測基因的引物序列如 下表所示，結果如圖1所示。
[0085] 表1引物序列
[0086]
[0087] 結果表明，在誘導培養基中添加關鍵的誘導組分一吲哚美辛后，細胞向外胚層祖 細胞的分化效率顯著提高，其表現在添加吲哚美辛后，外胚層祖細胞分化基因及神經干細 胞標志基因的表達水平較未添加組顯著提高。
[0088] 實施例3
[0089] 流式細胞術對細胞表面標志蛋白檢測鑒定
[0090] 利用流式細胞術對細胞表面標志蛋白檢測鑒定，具體操作如下：
[0091] 樣品組：
[0092] 將1 X 106個實施例1所得到的細胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTANa^消化液 處理1-3分鐘，使細胞脫離培養基質并成為單細胞，加入含10%胎牛血清的培養基進行中和 消化作用，1200rpm離心5分鐘，用冷roS緩沖液潤洗細胞，再次離心后將細胞重懸于100μΙ PBS緩沖液中，加入攜帶熒光標記的NCAM抗體并混勻，4°C避光孵育45分鐘。抗體孵育后將細 胞用冷PBS緩沖液潤洗兩遍以除去未結合抗體，而后將細胞重懸入400μ1 PBS緩沖液中，利 用流式細胞分析儀對細胞表面NCAM蛋白的表達率進行檢測。
[0093] 對照組：
[0094] 同樣品組的操作基本相同，區別在于，在實施例1中的誘導培養基中不含吲哚美 辛。
[0095] 結果如圖2所示，在誘導培養基中添加關鍵的誘導組分一吲哚美辛后，細胞向外胚 層祖細胞的分化效率顯著提高，其表現在添加吲哚美辛后，外胚層祖細胞表面標志蛋白 NCAM-1的表達水平較未添加組顯著提高。
[0096] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任 一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技 術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結 合和組合。
[0097] 盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述 實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1. 一種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法，其特征在于，包括： 在抑制干細胞合成前列腺素 E2的條件下，對所述干細胞進行誘導培養。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述誘導培養采用誘導培養基，并且所述 誘導培養基包括： 基礎培養基，以及 前列腺素 E2合成抑制劑， 任選地，所述前列腺素 E2合成抑制劑為吲哚美辛， 任選地，所述前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~ΙΟμΜ， 任選地，所述基礎培養基包括： 95體積％的混合培養基，所述混合培養基是將IMDM培養基與Fl 2培養基按照3:1的體積 比混合得到的； 1體積的％谷氨酰胺； 1體積％的胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物； 1體積％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及 1體積％的鏈霉素。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括： (1) 將干細胞在MEF飼養層共培養體系中進行第一培養； (2) 將步驟(1)所得到的細胞在無飼養層培養體系中進行傳代培養； (3) 將步驟(2)所得到的細胞進行消化，并將得到的消化產物進行離心，收集離心產物； (4) 將所述離心產物進行重懸，并將得到的重懸細胞接種至基質膠培養基中進行第二 培養；以及 (5) 將步驟(4)所得到的細胞轉至誘導培養基中進行誘導培養，從而得到所述外胚層祖 細胞， 任選地， 所述傳代培養進行至少5代， 所述消化是將步驟(2)所得到的細胞置于消化酶中，37攝氏度下孵育5~7分鐘， 所述離心是在900~1200rpm的轉速下進行3~5分鐘，優選是在900rpm的轉速下進行5 分鐘， 所述誘導培養是在37攝氏度下進行36~120小時，優選48小時。4. 一種外胚層祖細胞，其特征在于，所述外胚層祖細胞是由權利要求1~3任一項所述 誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的方法得到的。5. 權利要求4所述的外胚層祖細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療中樞神經 系統退行性疾病， 優選地，所述藥物用于治療阿爾茨海默癥。6. -種誘導干細胞分化成外胚層祖細胞的培養基，其特征在于，包括： 基礎培養基，以及 前列腺素 E2合成抑制劑， 優選地，所述前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~1 ΟμΜ。7. 根據權利要求6所述的培養基，其特征在于，所述前列腺素 Ε2合成抑制劑為吲哚美 辛。8. 根據權利要求6所述的培養基，其特征在于，所述基礎培養基包括： 95體積％的混合培養基，所述混合培養基是將IMDM培養基與Fl 2培養基按照3:1的體積 比混合得到的； 1體積的％谷氨酰胺； 1體積％的胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物； 1體積％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及 1體積％的鏈霉素。9. 一種試劑盒，其特征在于，包括前列腺素 E2合成抑制劑， 任選地，所述前列腺素 E2合成抑制劑為吲哚美辛， 任選地，所述試劑盒包括基礎培養基， 所述基礎培養基包括： 95體積％的混合培養基，所述混合培養基是將IMDM培養基與Fl 2培養基按照3:1的體積 比混合得到的； 1體積的％谷氨酰胺； 1體積％的胰島素-轉鐵蛋白-硒復合物； 1體積％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1體積％的青霉素；以及 1體積％的鏈霉素， 優選地，所述前列腺素 E2合成抑制劑的濃度為1~1 ΟμΜ。10. -種權利要求9所述的試劑盒在誘導干細胞分化成外胚層祖細胞中的用途。
【文檔編號】A61P25/28GK105886457SQ201610322185
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】裴雪濤, 李艷華, 張博文, 何麗娟, 劉鳴, 劉一鳴, 岳 文
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所