一種脂肪干細胞的純化方法及干細胞在成骨誘導及成軟骨誘導上的應用
【專利摘要】本發明提供一種脂肪干細胞的純化方法，該方法包括：原代脂肪干細胞培養和CD90+細胞群純化。本發明還提供純化后的脂肪干細胞在成骨誘導和成軟骨誘導方面的應用。通過本發明得到的ADSCs中CD90+細胞群，具有更高的干細胞分化潛能，可以提高ADSCs在組織工程中的使用效率和修復效果，在相同誘導條件下，成骨率和成軟骨率分別提高了3?5倍和5?7倍。
【專利說明】
一種脂肪干細胞的純化方法及干細胞在成骨誘導及成軟骨誘導上的應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種干細胞的純化方法，特別涉及一種兔來源脂肪干細胞的純化方法。
【背景技術】
[0002]脂肪組織是最富有、最容易獲取的間充質干細胞來源。脂肪干細胞(ADSCs)SPmsc來源于脂肪組織，是一個重要的再生應用的細胞來源。ADSCs從脂肪組織的基質血管部分(SVF)分離得到，它包含多種類型的細胞，如平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞等。最近的研究顯示，ADSCs有能力分化成多種細胞類型(脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞)，刺激血管生成，減少炎癥和細胞凋亡。但原代培養未經純化的ADSCs做為組織工程的種子細胞存在分化能力弱，修復效果不理想等問題。目前大部分都是分離細胞后原代培養直接用，沒有進行純化，造成的缺陷是同樣的方法，不同批次培養，由于血管基質成分含量不同，培養出的ADSCs中干細胞含量不同，分化為目的細胞的效率不同，用于組織工程修復效果參差不齊。目前用于純化的方法主要有微孔過濾膜法(聚氨酯(PU)膜、PLGA/蠶絲膜)、磁珠富集法和流式分選法，用于純化脂肪細胞的多為微孔過濾膜法，缺陷在于膜的孔徑比較難掌握。
【發明內容】
[0003]本發明首先要解決的技術問題是目的是提供一種脂肪干細胞的純化方法，該方法采用流式細胞術的方法從原代培養的ADSCs中分選純化出具有更強干細胞分化潛能的CD90+細胞群，能夠做為組織工程的種子細胞，改善組織工程中受損組織的修復效果。
[0004]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是:
一種脂肪干細胞的純化方法，
按如下步驟進行:
(1)原代脂肪干細胞培養:取兔源腹股溝處脂肪塊置于含100U/ml青霉素-鏈霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加膠原酶11剪碎，37 0C消化2小時，離心，沉淀用含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基重懸，37°C，5%C02孵箱培養，每3天換液一次，待細胞長至80%時傳代，傳代1_5次，獲得原代脂肪基質細胞的培養液；
(2)CD90+細胞群純化:棄掉步驟(I)原代脂肪基質細胞的培養液，用步驟(I)中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用細胞刮刀將細胞刮下，收集于離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，加入4 °C預冷的PBA溶液，1500rpm，3min離心，棄上清，加入鼠抗兔CD90—抗PBA溶液，4°C孵育2小時，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC標記的熒光二抗的PBA溶液，4°C孵育30min，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次后用PBS重懸，采用流式細胞儀收集CD90+細胞群，獲得純化后的脂肪干細胞。進一步地，所述PBA溶液為含體積濃度
0.5%胎牛血清的?83。
[0005]進一步地，所述CD90—抗PBA溶液中CD90—抗與PBA體積比為1:100。
[0006]進一步地，所述抗兔的FITC標記的熒光二抗PBA溶液中FITC標記的熒光二抗與PBA體積比為1:200。
[0007]本發明還提供一種上述純化后的脂肪干細胞在成骨誘導和成軟骨誘導方面的應用。
[0008]所述的骨細胞誘導具體是指:細胞長至80%時，0.25%胰酶37°C消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度5 X 15細胞/ml種于24孔板中，貼壁后24小時后用骨誘導液進行誘導，每3天換液一次，共誘導2周，用茜素紅檢測。
[0009]進一步地，所述骨誘導液購自GIBC0，其成分組成為:dexamethasone 10-7M，β-glycerol phosphate 1mM,ascorbic acid 50ug/mlo
[0010]所述的軟骨細胞誘導具體是指:細胞長至80%時，0.25%胰酶37°C消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度1x107細胞/ml分裝于15ml離心管中，每管Iml，1500rpm，3分鐘離心，棄上清，沿管壁緩慢加入含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，置于37° C，5%C02培養箱中培養24小時，形成細胞球加入軟骨誘導液誘導3周，細胞球經固定、脫水、透明、浸蠟后包埋成蠟塊，切片3um，S.0染色檢測軟骨細胞生成情況。
[0011]進一步地，所述的軟骨誘導液購自GIBC0，其成分組成為:TGF-f3-310ng/ul，dexamethasone 1mM,ascorbic acid 5mg/ml，sodium pryruvate 10nm0
[0012]與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在:
通過本發明得到的ADSCs中CD90+細胞群，具有更高的干細胞分化潛能，可以提高ADSCs在組織工程中的使用效率和修復效果。本發明成功用流式分選法純化脂肪來源的干細胞，從四方面證實了用流式分選法純化得到的干細胞特性得以明顯提高，(I)形成克隆的能力；
(2)干細胞表面標記物的表達量；(3)三系分化的能力；(4)干細胞相關基因表達量上調，月旨肪相關基因的表達量下調。通過本發明的方法得到的CD90+細胞，細胞增殖率為未純化細胞的1.5倍，干細胞相關基因表達上調2倍，脂肪相關基因表達下調2-10倍，干細胞表面抗原表達量提高2.5-3.9倍，在相同誘導條件下，成骨率和成軟骨率分別提高了 3-5倍和5-7倍。
【附圖說明】
[0013]圖1為流式分選圖片43、(:、04均為未標記0)90+的空白對照組，？、1、!1、1、1為標記⑶90+的實驗組，J中P4為收集的目的細胞。
[0014]圖2為分選前后細胞培養圖片，A為原代脂肪基質細胞，B為CD90+細胞成克隆增殖，C為甲苯胺藍染色后的細胞克隆。
[0015]圖3為分選前后細胞的三系分化圖片，A為原代脂肪基質細胞向脂肪分化圖，B為CD90+細胞向脂肪分化圖，油紅O染色，C為原代脂肪基質細胞向骨分化圖；D為CD90+細胞向骨分化圖，茜素紅染色;E為原代脂肪基質細胞向軟骨分化圖;F為CD90+細胞向軟骨分化圖，S.0染色；圖3G表示分選后細胞向骨分化中生成的鈣鹽總量是未分選細胞的7倍，圖3H表示向軟骨分化中，誘導相同數量的細胞，誘導后形成的細胞球，面積為3-4倍，圖31表示顏色面積4-5倍。
[0016]圖4為分選前后細胞的干細胞表面標記檢測圖片，A-D為原代脂肪基質細胞的空白對照、⑶14、⑶105和⑶90 ;E-H是分選后細胞⑶90+細胞的空白對照、⑶14、⑶105和⑶90。
[0017]圖5為分選前后細胞的脂肪和干細胞相關基因檢測結果圖片。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1
(I )ADSCs原代細胞培養:取新西蘭大白兔一只，雄性，3-4周，靜脈注射空氣針處死后取腹股溝處脂肪塊(帶筋膜)置于含100U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的PBS(PH7.2-7.4)中，去掉筋膜和血管，加Co 11 agenase II剪碎，37 °C消化2小時，離心，沉淀用含體積濃度10%血清的低糖培養基培養(DMEM-L，GIBC0)重懸，37°C，5%C02孵箱培養。每3天換液一次，待細胞長至80%時傳代，P5之前的細胞用于分選，獲得原代脂肪基質細胞的培養液。
[0019](2)⑶90+細胞群分選純化:棄掉原代脂肪基質細胞的培養液，PBS清洗一次后再加入I3BS,然后用細胞刮刀將細胞刮下，收集于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，加入2ml 4°C預冷的I3BA溶液(含體積濃度0.5%胎牛血清的I3BS)，1500rpm，3min離心，棄上清，加入200UL的CD90—抗PBA溶液(CD90—抗與PBA體積比為1: 100，購自華安生物有限公司)，4 °C孵育2小時，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次，加入200仙抗兔的FITC標記的熒光二抗(Molecular probes Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG(H+L) )PBA溶液(invitrogen，二抗與PBA體積比為1: 200)，4°C孵育30min，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次后，加入3ml PBS使細胞濃度不低于17個/ml，轉入無菌流式管，采用流式細胞分析儀進行上機檢測。用488nm激光激發，分選出細胞中CD90+的細胞群。結果如圖1所示，經兩步法標記后，用流式細胞分析儀分選得到CD90+細胞比例為1.5%，共收集細胞約5萬個細胞，J中P4框中的細胞為收集的目的細胞，即為CD90+細胞。
[0020]分選獲得的細胞群，繼續培養I周后，發現細胞生長成克隆式增殖，并且擴增效率較快，如圖2所示，取細胞后用PBS沖洗，然后4%甲醛固定10分鐘，棄固定液，PBS沖洗后，1%甲苯胺蘭染色10分鐘，棄染色液，PBS沖洗后，倒置顯微鏡觀察拍照，放大倍率為10倍。
[0021]實施例2
干細胞表面標記檢測:為比較分選前后細胞群中干細胞表面標記陽性細胞的含量，用細胞刮刀獲得細胞(步驟I培養的原代脂肪基質細胞及步驟2篩選的CD90+細胞)，離心后，分別用CD14、CD105、CD34標記原代脂肪基質細胞和CD90+細胞，4°C孵育1-2小時，PBS清洗后，焚光二抗(Molecular probes Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG(H+L))孵育30分鐘，PBS清洗，然后經流式細胞分析儀檢測。
[0022]干細胞表面標記抗體的表達量也代表了干細胞特性之一，分選前和分選后細胞干細胞表面標記抗體CD14、CD105的表達量也發生了較大的變化，如圖4所示。分選前CD14和CD105的表達量為20.7%和22.2%;分選后CD90+細胞CD14和CD105的表達量為57.8%和56.1%，表明分選后細胞的干細胞特性至少提高了 2.5倍。
[0023]實施例3
三系分化潛能檢測:為比較細胞分選前后的三系分化能力，將步驟I制備的原代脂肪基質細胞和步驟2獲得的CD90+細胞以同樣細胞濃度5 X 15細胞/ml種于24孔板中，(I)骨細胞誘導:細胞長至80%時，0.25%胰酶37 °C消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度5 X 15細胞/ml種于24孔板中，貼壁后24小時后用骨誘導液(購自GIBCO)進行誘導，每3天換液一次，共誘導2周，用茜素紅檢測。骨誘導液的成分組成:dexamethasone( 10-7M)，β-glycerol phosphateC1mM),ascorbic acid(50ug/ml)。
[0024](2)軟骨細胞誘導:細胞長至80%時，0.25%胰酶37 V消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度1x107細胞/ml分裝于15ml離心管中，每管Iml，1500rpm，3分鐘離心，棄上清，沿管壁緩慢加入含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，置于37° C，5%C02培養箱中培養24小時，形成細胞球加入軟骨誘導液誘導3周，細胞球經固定、脫水、透明、浸蠟后包埋成蠟塊，切片3um，S.0染色檢測軟骨細胞生成情況。軟骨誘導液(購自GIBC0)，軟骨誘導液的成分組成:TGF_0_3( 10ng/ul)，dexamethasoneC 1mM) ,ascorbic acid(5mg/ml)，sodiumpryruvate(10nm)。
[0025]本文中所用到的正置顯微鏡為OLYMPUS D61，倒置顯微鏡為ZESSI Ti_U。體外三系分化的能力是干細胞特性之一，分選前和分選后細胞體外三系分化結果，如圖3所示，結果顯示分選后的CD90+細胞群在相同的分化時間內，向骨和軟骨分化能力明顯強于未分選細胞，分選后細胞向骨分化中生成的鈣鹽總量是未分選細胞的7倍(圖3G)，向軟骨分化中，誘導相同數量的細胞，誘導后形成的細胞球，面積為3-4倍(圖3H)，顏色面積4-5倍(圖31)。脂肪誘導和骨誘導為10倍，軟骨誘導為40倍。
[0026]實施例5
基因水平檢測:為進一步檢測基因水平發生的變化，分別用RNA抽提試劑盒(購自invitrogen)提取未分選細胞(步驟I制備的原代脂肪基質細胞)和分選后CD90+細胞(步驟2制備的⑶90+細胞)的RNA，利用q-PCR檢測脂肪相關基因PPARr和干細胞相關基因0CT4等基因的變化，以GAPDH做為內參。取模板IlIg逆轉，逆轉體系20μI，稀釋3倍，做qpcr反應。計算2-A AT值。收集未分選和分選后的細胞RNA，檢測脂肪相關基因PPAR-r、C/EBPa和干細胞相關基因sox2，結果見圖5所示。分選出的CD90+細胞群脂肪相關基因表達量較未分選的細胞表達下調，干細胞相關基因表達上調。
【主權項】
1.一種脂肪干細胞的純化方法，其特征在于:所述的純化方法按如下步驟進行: (1)原代脂肪干細胞培養:取兔源腹股溝處脂肪塊置于含100U/ml青霉素-鏈霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加膠原酶11剪碎，37 0C消化2小時，離心，沉淀用含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基重懸，37°C，5%C02孵箱培養，每3天換液一次，待細胞長至80%時傳代，傳代1_5次，獲得原代脂肪基質細胞的培養液； (2)CD90+細胞群純化:棄掉步驟(I)原代脂肪基質細胞的培養液，用步驟(I沖的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用細胞刮刀將細胞刮下，收集于離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，加入4 °C預冷的PBA溶液，1500rpm，3min離心，棄上清，加入鼠抗兔CD90—抗PBA溶液，4°C孵育2小時，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC標記的熒光二抗的PBA溶液，4°C孵育30min，1500rpm，3min離心，棄上清，PBS清洗2次后用PBS重懸，采用流式細胞儀收集CD90+細胞群，獲得純化后的脂肪干細胞。2.如權利要求1所述的一種脂肪干細胞的純化方法，其特征在于:所述PBA溶液為含體積濃度0.5%胎牛血清的PBS。3.如權利要求1所述的一種脂肪干細胞的純化方法，其特征在于:所述鼠抗兔CD90—抗PBA溶液中鼠抗兔⑶90—抗與PBA體積比為1:100。4.如權利要求1所述一種脂肪干細胞的純化方法，其特征在于:所述抗鼠的FITC標記的熒光二抗PBA溶液中FITC標記的熒光二抗與PBA體積比為1:200。5.權利要求1所得的CD90+細胞在成骨誘導方面的應用，其特征在于:所述的骨細胞誘導具體是指:細胞長至80%時，0.25%胰酶37°C消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度5 X 15細胞/ml種于24孔板中，貼壁后24小時后用骨誘導液進行誘導，每3天換液一次，共誘導2周，用茜素紅檢測。6.如權利要求5所述的CD90+細胞在成骨誘導方面的應用，其特征在于:所述骨誘導液購自GIBC0，其成分組成為:dexamethasone(地塞米松)10-7M，β-glycerol phosphate(0-甘油磷酸鈉)10mM，ascorbic acid(抗壞血酸維生素C) 50ug/ml。7.權利要求1所得的CD90+細胞在成軟骨誘導方面的應用，其特征在于:所述的軟骨細胞誘導具體是指:細胞長至80%時，0.25%胰酶37 °C消化3分鐘，血清終止消化后，置于15ml離心管，1500rpm，3min離心，棄上清，細胞重懸后置于含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，以細胞濃度1x107細胞/ml分裝于15ml離心管中，每管lml，1500rpm，3分鐘離心，棄上清，沿管壁緩慢加入含體積濃度10%血清的DMEM-L培養基，置于37° C，5%C02培養箱中培養24小時，形成細胞球加入軟骨誘導液誘導3周，細胞球經固定、脫水、透明、浸蠟后包埋成蠟塊，切片3um，S.0染色檢測軟骨細胞生成情況。8.如權利要求7所述的CD90+細胞在成軟骨誘導方面的應用，其特征在于:所述的軟骨誘導液購自GIBCO，其成分組成為:TGF-0_3(轉化生長因子-β-3) 10ng/ul ,dexamethasone(地塞米松)10mM，ascorbic acid(抗壞血酸維生素C) 5mg/ml，sodium pryruvate(丙酮酸鈉)10nm0
【文檔編號】C12N5/0775GK106047804SQ201610372872
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】宋興輝, 沈婷, 洪朝陽, 李艷偉, 王佳佳, 王琳琳
【申請人】浙江大學