本發明涉及生物技術(shu)領域，尤其(qi)是涉及一種高效誘導多能干細胞向視網(wang)膜色素上(shang)皮細胞分化的方法(fa)。

背景技術：

視(shi)(shi)網膜(mo)變性(xing)疾(ji)病(bing)是全球首(shou)要的(de)(de)(de)致(zhi)盲(mang)原因。在該疾(ji)病(bing)中，視(shi)(shi)網膜(mo)色(se)素上皮細胞(retina pigmented epithelium,RPE)的(de)(de)(de)損傷和功能異常導(dao)致(zhi)光(guang)感(gan)受器細胞(photoreceptor)變性(xing)，最終影響(xiang)病(bing)人視(shi)(shi)力(li)直至失明。由于RPE和光(guang)感(gan)受器細胞的(de)(de)(de)不(bu)可再生，至今(jin)在臨床上缺乏對(dui)這類疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)有效治療措(cuo)施(shi)。相較于其(qi)他治療方法，細胞治療對(dui)視(shi)(shi)網膜(mo)退行性(xing)疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)治療有更大的(de)(de)(de)前(qian)景。

由于(yu)多能(neng)干細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)具有(you)無限增(zeng)殖(zhi)和分(fen)化為(wei)各種細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)能(neng)力，因(yin)此可(ke)以(yi)作為(wei)理想的(de)(de)移植細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)來(lai)源。已有(you)報道(dao)證實胚(pei)胎干細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(ESCs)來(lai)源的(de)(de)RPE應用(yong)于(yu)人(ren)類視(shi)網膜(mo)退(tui)行性(xing)疾病(bing)臨床研(yan)究(jiu)的(de)(de)可(ke)行性(xing)與(yu)安全性(xing)，盡(jin)管病(bing)人(ren)術后視(shi)力與(yu)正常生活的(de)(de)要(yao)求還有(you)很(hen)大(da)差距(ju)。那(nei)么，一套(tao)穩(wen)定有(you)效的(de)(de)體外多能(neng)干細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)向(xiang)RPE細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)化的(de)(de)方法對視(shi)網膜(mo)退(tui)行性(xing)疾病(bing)的(de)(de)治療和制藥(yao)研(yan)究(jiu)顯(xian)得尤(you)為(wei)重要(yao)。

在過去的十幾年間(jian)，多種方法被報道(dao)可以(yi)控制多能干細(xi)胞向RPE細(xi)胞分化，并(bing)且在多種動(dong)物(wu)病變模型中發(fa)揮保護作用(yong)。但是這(zhe)些方法仍存在若干缺點如耗時長，方法繁(fan)瑣(suo)，批次(ci)間(jian)差異(yi)大(da)和(he)細(xi)胞得率低等。

因此，需(xu)要一種誘(you)導多能(neng)干細胞(bao)(bao)向RPE細胞(bao)(bao)分化的方(fang)法。

技術實現要素：

本發(fa)明的(de)(de)目(mu)的(de)(de)就是為(wei)了克(ke)服上述現有技(ji)術存(cun)在的(de)(de)缺(que)陷而(er)提供一(yi)種高效誘導多(duo)能干(gan)細(xi)胞向視網(wang)膜(mo)色(se)素上皮細(xi)胞分化(hua)的(de)(de)方法(fa)，本發(fa)明的(de)(de)方法(fa)不僅可(ke)以(yi)得(de)(de)到成熟的(de)(de)有功能的(de)(de)視網(wang)膜(mo)色(se)素上皮細(xi)胞，而(er)且方法(fa)簡單、耗時短、可(ke)重(zhong)復性強且細(xi)胞得(de)(de)率高。

本發明的目的可以(yi)通過以(yi)下(xia)技術(shu)方案來實(shi)現(xian)：

一(yi)種高(gao)效誘導多能干細(xi)胞向視網膜色素上皮細(xi)胞分化的方法，包(bao)括以(yi)下步驟：

a、將多能干(gan)細胞接種到飼養(yang)層細胞中，加入干(gan)細胞完全(quan)培養(yang)基(ji)，放置培養(yang)并定期換液至細胞達到融(rong)合狀態；

b、用(yong)酶處(chu)理多能(neng)干細胞成(cheng)團(tuan)塊并接種到培(pei)(pei)養(yang)皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第(di)一誘導(dao)分化培(pei)(pei)養(yang)基培(pei)(pei)養(yang)兩天，更換無Matrigel添加的第(di)一誘導(dao)分化培(pei)(pei)養(yang)基繼續培(pei)(pei)養(yang)5天；

c、在分化第8天(tian)更換第二誘導(dao)分化培養(yang)基，放置培養(yang)并定期換液至細(xi)胞分化形成大量的色素(su)細(xi)胞；

d、用酶處(chu)理分(fen)化細胞(bao)成(cheng)團塊(kuai)并懸浮培養(yang)，1天后進行挑(tiao)選(xuan)分(fen)離，收集黑色的(de)細胞(bao)懸球(qiu)；

e、將黑色細胞懸球接(jie)種于培養(yang)皿中，加入第(di)二(er)誘(you)導分化培養(yang)基，放置培養(yang)并定期換液便可得(de)到成熟的視網膜色素上(shang)皮(pi)細胞。

優選地，所述多能(neng)干(gan)細胞包括胚胎干(gan)細胞(embryonic stem cells,ESCs)或(huo)誘(you)導性多能(neng)干(gan)細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

優選地，步驟a中所述飼養(yang)層細胞(bao)(bao)(bao)為(wei)(wei)X射(she)線處理的(de)小鼠胚胎成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao)(bao)(bao)，所述干細胞(bao)(bao)(bao)完全培養(yang)基(ji)成(cheng)分為(wei)(wei)：DMEM/F12基(ji)礎培養(yang)基(ji)、血清替(ti)代(dai)物(wu)、非(fei)必(bi)須氨基(ji)酸、青霉素(su)、鏈霉素(su)、谷氨酰胺、β-巰(qiu)(qiu)基(ji)乙醇及成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao)(bao)(bao)生長因子，其(qi)中，血清替(ti)代(dai)物(wu)的(de)體積含量為(wei)(wei)20％，非(fei)必(bi)須氨基(ji)酸的(de)濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)0.01mmol/L，青霉素(su)的(de)濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)100U/ml，鏈霉素(su)的(de)濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)100ug/ml，谷氨酰胺的(de)濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)1mmol/L，β-巰(qiu)(qiu)基(ji)乙醇濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)0.1mmol/L，成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao)(bao)(bao)生長因子濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)4ng/ml，所述達到(dao)融合(he)(he)狀態為(wei)(wei)每天(tian)換液至(zhi)細胞(bao)(bao)(bao)達到(dao)80％～90％的(de)融合(he)(he)。

優選地(di)，步(bu)驟b中所述酶處(chu)理為(wei)(wei)(wei)5mg/ml膠(jiao)原(yuan)酶IV處(chu)理12分(fen)(fen)鐘并用移液(ye)器機械吹打；所述第一誘導分(fen)(fen)化培養基成分(fen)(fen)為(wei)(wei)(wei)：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積(ji)(ji)混(hun)合的基礎(chu)培養基、N2、B27、青(qing)霉素、鏈霉素、谷氨酰胺(an)及β-巰(qiu)基乙醇，其中，N2體積(ji)(ji)含量為(wei)(wei)(wei)1％，B27體積(ji)(ji)含量為(wei)(wei)(wei)1％，青(qing)霉素的濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)(wei)100U/ml，鏈霉素的濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)(wei)100ug/ml，谷氨酰胺(an)的濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)(wei)1mmol/L，β-巰(qiu)基乙醇濃(nong)度(du)(du)為(wei)(wei)(wei)0.1mmol/L。

優(you)選地，步驟c中所(suo)述第二誘導分(fen)化培(pei)(pei)養(yang)基(ji)成分(fen)為(wei)：DMEM/F12基(ji)礎培(pei)(pei)養(yang)基(ji)、血清替代物(wu)、非必(bi)須氨(an)基(ji)酸、青霉素(su)、鏈霉素(su)、谷(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)及β-巰(qiu)基(ji)乙醇，其中，血清替代物(wu)的(de)(de)(de)(de)體(ti)積(ji)分(fen)數為(wei)20％，非必(bi)須氨(an)基(ji)酸的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度為(wei)0.01mmol/L，青霉素(su)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度為(wei)100U/ml，鏈霉素(su)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度為(wei)100ug/ml，谷(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度為(wei)1mmol/L，β-巰(qiu)基(ji) 乙醇濃(nong)度為(wei)0.1mmol/L；所(suo)述形(xing)成大(da)量的(de)(de)(de)(de)色(se)素(su)細(xi)胞為(wei)隔(ge)天換液至(zhi)分(fen)化40天，培(pei)(pei)養(yang)皿中出現(xian)大(da)量單層(ceng)的(de)(de)(de)(de)色(se)素(su)細(xi)胞。

優選(xuan)地，步驟d中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理20分(fen)(fen)鐘并(bing)用(yong)移液(ye)器機械(xie)吹打；所述懸(xuan)浮培養為將細胞(bao)團(tuan)塊接種到(dao)不貼(tie)壁(bi)的細胞(bao)培養皿中培養；所述挑(tiao)選(xuan)分(fen)(fen)離為：由于細胞(bao)懸(xuan)球主要包括(kuo)黑色(se)與(yu)白色(se)兩(liang)種，根據(ju)顏色(se)進行分(fen)(fen)離挑(tiao)選(xuan)。

優選地，各步驟中所述培養是在37℃和5％CO₂培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)進行。步驟b或(huo)/和步驟e中(zhong)所述培(pei)養(yang)皿為有100ug/ml Matrigel包被的細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)皿。步驟c或(huo)/和步驟e中(zhong)所述定期(qi)換(huan)液為隔天換(huan)液。步驟e中(zhong)所述成熟的色素上皮細(xi)(xi)胞為具有鵝卵石(shi)樣形態，色素積累(lei)的單(dan)層細(xi)(xi)胞。

目前文獻報道的(de)體外誘導(dao)hESCs向RPE分(fen)化的(de)方法不(bu)僅耗時長(8周到(dao)數月不(bu)等)，而(er)且獲得(de)的(de)RPE細(xi)胞往往有(you)(you)其(qi)它分(fen)化細(xi)胞混合，需(xu)要人工(gong)挑取含有(you)(you)色素的(de)RPE細(xi)胞進行(xing)RPE的(de)純(chun)化。與現(xian)有(you)(you)技術相比，本發明具有(you)(you)以(yi)下(xia)優點及有(you)(you)益效果：

1、本發明方法未添加任何分(fen)子(zi)刺激誘導(dao)分(fen)化，避免外源添加分(fen)子(zi)可能引(yin)入污染的風險，減少批次之間的差(cha)異(yi)，提(ti)高實驗(yan)的重復性。

2、本發明在體(ti)外(wai)嚴格模擬體(ti)內眼球(qiu)發育的過程，自發的分化(hua)為RPE細胞。

3、本發(fa)(fa)明(ming)通過采用培養方(fang)法(fa)以及胞(bao)(bao)外基(ji)質的(de)(de)改變實現定(ding)向(xiang)自發(fa)(fa)分化(hua)，而傳(chuan)統自發(fa)(fa)分化(hua)的(de)(de)方(fang)法(fa)，因(yin)非定(ding)向(xiang)分化(hua)則得(de)到的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)種(zhong)類多樣，分化(hua)時(shi)間(jian)長且目的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)少，因(yin)此(ci)本發(fa)(fa)明(ming)方(fang)法(fa)簡單、快捷，并且由于本發(fa)(fa)明(ming)后期可根(gen)據(ju)顏色(se)簡單富集黑色(se)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸球，無雜細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)污染，最終得(de)到百(bai)分百(bai)色(se)素上皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，因(yin)而細(xi)(xi)胞(bao)(bao)得(de)率高。通過該方(fang)法(fa)可獲得(de)高純度(du)和(he)大量的(de)(de)成熟且有功能的(de)(de)RPE細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。

附圖說明

圖1為本(ben)發明人(ren)ESCs分化2天形(xing)成(cheng)類似神(shen)經(jing)上皮及(ji)熒(ying)光鑒定的示意(yi)圖；

圖(tu)2為本發明人(ren)ESCs分化7天形成類似眼區及熒光鑒定的示意圖(tu)；

圖3為本發明人ESCs分化14天形成類似(si)視囊及(ji)熒(ying)光鑒(jian)定的示意(yi)圖；

圖(tu)4為本發明人ESCs分化(hua)40天出現大量色素細胞的示(shi)意圖(tu)；

圖5為本發(fa)明黑色(se)細胞懸(xuan)球在(zai)懸(xuan)浮培養分(fen)離前后的示意圖；

圖(tu)6為本(ben)發(fa)明黑色細(xi)胞懸球貼壁后生長(chang)及形成(cheng)成(cheng)熟RPE的示(shi)意(yi)圖(tu)；

圖(tu)7為本發明的多能干細胞(bao)來(lai)源的RPE細胞(bao)染(ran)色及功能鑒定的示意圖(tu)。

具體實施方式

下面(mian)結合附圖和具體實施例對本(ben)發(fa)明進(jin)行詳細說明。

實施例

本實施例為(wei)高效誘導多能(neng)干(gan)細胞(bao)向視網(wang)膜色素上皮細胞(bao)的方法。

本實(shi)施(shi)例(li)中，所述多(duo)能干(gan)細胞為人胚胎干(gan)細胞或(huo)誘(you)導(dao)多(duo)能干(gan)細胞，均(jun)能利用本方法實(shi)現發明目的。

本(ben)實施例中，所(suo)述誘導分化包括(kuo)如下步驟：

a.將多(duo)能干(gan)細(xi)胞接種到飼養(yang)(yang)層(ceng)細(xi)胞中，加入干(gan)細(xi)胞完全培養(yang)(yang)基(ji)，放置(zhi)培養(yang)(yang)并定期換液至細(xi)胞達到融合狀(zhuang)態；

本步驟中所述多能干細胞為第50代人胚胎干細胞；所述飼養層細胞為X射線處理小鼠胚胎成纖維細胞；所述干細胞完全培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/ml；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所(suo)(suo)述定期換液為每天換液；所(suo)(suo)述達(da)到融合狀態為每天換液至(zhi)細胞達(da)到80％～90％的融合。

b.用(yong)酶處理干細胞成團(tuan)塊(kuai)并接種到培養(yang)皿中，加(jia)(jia)入添加(jia)(jia)有200ug/ml Matrigel的第一(yi)誘(you)導(dao)分化(hua)培養(yang)基培養(yang)兩天，更換無Matrigel添加(jia)(jia)的第一(yi)誘(you)導(dao)分化(hua)培養(yang)基繼續培養(yang)5天；

本步驟中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述培養皿為100ug/ml Matrigel包被的細胞培養皿；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所述第(di)一(yi)誘導(dao)分化(hua)培養基(ji)成分為：Neurobasal medium和(he)DMEM/F12等(deng)體(ti)積(ji)混(hun)合的(de)(de)基(ji)礎培養基(ji)、N2、B27、青(qing)霉(mei)素、鏈(lian)霉(mei)素、谷氨酰胺及β-巰基(ji)乙醇，其中，N2體(ti)積(ji)含(han)(han)量為1％，B27體(ti)積(ji)含(han)(han)量為1％，青(qing)霉(mei)素的(de)(de)濃度(du)為100U/ml，鏈(lian)霉(mei)素的(de)(de)濃度(du)為100ug/ml，谷氨酰胺的(de)(de)濃度(du)為1mmol/L，β-巰基(ji)乙醇濃度(du)為0.1mmol/L。該(gai)誘導(dao)分化(hua)方(fang)法在添加200ug/ml Matrigel的(de)(de)第(di)一(yi)誘導(dao)分化(hua)培養基(ji)中分化(hua)兩天可得到(dao)囊泡樣的(de)(de)極性神經(jing)上皮樣結構，通(tong)過(guo)免疫組化(hua)鑒定表達ZO-1，N-cadherin和(he)Sox-2，如圖(tu)1；繼續培養5天細胞開始表達眼區相關(guan)基(ji)因Pax6和(he)Rax，如圖(tu)2。

c.在分(fen)化第(di)8天(tian)更換(huan)第(di)二(er)誘導(dao)分(fen)化培養基，放置培養并定期換(huan)液至(zhi)細胞分(fen)化形成大量的(de)色素(su)細胞；

本步驟中所述第二誘導分化培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分數為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行；所(suo)述(shu)定(ding)期換液為(wei)隔天換液；該誘導分化(hua)方法在分化(hua)第(di)14天已經(jing)鑒(jian)定(ding)分化(hua)細(xi)胞表達視囊相關的基因Vsx2和MITF，如圖3；所(suo)述(shu)形(xing)成大量(liang)的色(se)素細(xi)胞為(wei)在分化(hua)40天左右(you)培養皿中已經(jing)出(chu)現大量(liang)單層的色(se)素細(xi)胞如圖4。

d.用酶處理(li)分化(hua)細胞成團塊并懸浮培養，一天后(hou)可進行挑選分離，收集黑色(se)的細胞懸球(qiu)；

本步驟中所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理20分鐘并用移液器機械吹打；所述懸浮培養為將細胞團塊接種到不貼壁的細胞培養皿中培養；所述放置培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行(xing)；所述挑選(xuan)(xuan)分離(li)為由于(yu)細胞懸球主要(yao)包括(kuo)黑色(se)與白色(se)兩種，可以根據顏色(se)進行(xing)分離(li)挑選(xuan)(xuan)，如圖5。

e.將黑色(se)細(xi)胞(bao)懸(xuan)球(qiu)接種于培(pei)養皿中(zhong)，加入第(di)二誘導(dao)分化培(pei)養基(ji)，放(fang)置培(pei)養并(bing)定期換液(ye)便(bian)可得到成熟的色(se)素上皮(pi)細(xi)胞(bao)。

本步驟中所述培養是在37℃和5％CO₂培(pei)養(yang)箱中(zhong)進行；所(suo)述(shu)培(pei)養(yang)皿(min)有100ug/ml Matrigel包被的細胞培(pei)養(yang)皿(min)；所(suo)述(shu)定期換(huan)液(ye)為(wei)隔天換(huan)液(ye)；所(suo)述(shu)成(cheng)熟的色素(su)上(shang)(shang)皮細胞為(wei)具有鵝卵石(shi)樣形態，色素(su)積累的單(dan)層細胞。該誘導(dao)方法(fa)將黑色細胞懸球貼壁培(pei)養(yang)兩周后即可得到(dao)成(cheng)熟的色素(su)上(shang)(shang)皮細胞，如(ru)圖6。

進一(yi)步對人ESCs分化來(lai)源的RPE細(xi)胞進行免疫(yi)組化鑒定(ding)，發現hESC-RPE細(xi)胞表達(da)成熟(shu)的RPE細(xi)胞相關蛋白Bestrophin，ZO-1和RPE65，進一(yi)步檢(jian)測(ce)其功能(neng)(neng)發現分化的細(xi)胞具有吞噬外節的能(neng)(neng)力，如圖7。

上述的(de)對實施例的(de)描述是為便于該技(ji)術(shu)領域(yu)的(de)普通技(ji)術(shu)人(ren)員能理解和使用發明。熟(shu)悉本領域(yu)技(ji)術(shu)的(de)人(ren)員顯然可(ke)以容易(yi)地對這些實施例做(zuo)出各種(zhong)修(xiu)改(gai)，并把在此說明的(de)一般原理應(ying)用到其(qi)他實施例中(zhong)而不(bu)(bu)必經(jing)過創造性的(de)勞動。因此，本發明不(bu)(bu)限于上述實施例，本領域(yu)技(ji)術(shu)人(ren)員根據本發明的(de)揭示，不(bu)(bu)脫離本發明范(fan)疇所做(zuo)出的(de)改(gai)進和修(xiu)改(gai)都應(ying)該在本發明的(de)保護范(fan)圍之內。