檢測熱帶念珠菌的試劑盒、引物和方法
【專利摘要】本發明提供了一種實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒、引物以及方法，所述檢測試劑盒包括有序列組成為SEQID NO.1和SEQID NO.2的內引物，序列組成為SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列組成為SEQID NO.5的環引物。本發明所述的試劑盒和檢測方法特異性強，與非目標菌不存在交叉反應；靈敏度高，可達1.28pg/ul；重復性好，陽性樣品三個重復管都幾乎同時出峰，實驗結果穩定可靠。
【專利說明】
檢測熱帶念珠菌的試劑盒、引物和方法
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物的檢測方法，特別是涉及檢測熱帶念珠菌的試劑盒、引物和方 法。
【背景技術】
[0002] 熱帶念珠菌(Candida tropicalis)為條件致病菌，在自然界廣泛存在，也可寄居 在人體皮膚、陰道、口腔、消化道等部位。當人體抵抗力下降或皮膚局部環境發生變化時，熱 帶念珠菌即可大量繁殖，引起相應部位的感染乃至系統性感染。其致病因子包括其生物膜、 菌絲等，因而其感染率高。
[0003] 目前，多使用顯色法從眾多種念珠菌中區分熱帶念珠菌，但是，顯色法耗時長，其 中，某些顯色法中，熱帶念珠菌的檢測易與光滑念珠菌混淆，不能準確地對熱帶念珠菌進行 快速的檢測。因此，建立快速、有效的檢測熱帶念珠菌的方法尤為重要。
[0004] 環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 學者Notomi等提出一種全新的核酸擴增技術，該技術具有特異性強、靈敏度高、檢測成本低 和操作步驟簡便等優點。近年來，越來越多的研究人員將該方法運用于細菌、病毒等微生物 的檢測或對該方法進行改進。而實時熒光檢測技術采用完全閉管操作，排除了其他干擾因 素，因而具有高靈敏性的優點。目前，已有關于將兩種技術相結合的新技術一一實時熒光環 介導恒溫擴增（Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification, ReaLamp)檢測方法的相關研究，但在國內尚未有將此新技術應用于熱帶念珠菌的檢測方面 的發明。
[0005] 本發明擬建立熱帶念珠菌的ReaLamp檢測試劑盒、引物和方法，并從其特異性、靈 敏度、重復性等方面對該方法進行評價，以期將該發明應用于臨床檢測中。

【發明內容】

[0006] 基于此，本發明的目的之一是提供一種實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠 菌的試劑盒。
[0007] 實現上述目的的技術方案如下：
[0008] -種實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒，包括有序列組成為 SEQIDN0.1和SEQIDN0.2的內引物，序列組成為SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列 組成為SEQIDN0.5的環引物。
[0009] 在其中一個實施例中，還包括有熒光染料I。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種檢測熱帶念珠菌的引物。
[0011] 實現上述目的的技術方案如下：
[0012] 一種檢測熱帶念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列組成為SEQID NO. 1和SEQID N0.2的內引物，序列組成為SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列組成為SEQIDN0.5的 環引物。
[0013] 本發明的另一個目的是提供一種檢測熱帶念珠菌的方法。
[0014] 實現上述目的的技術方案如下：
[0015] 采用實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒，包括以下步驟：
[0016] 1)提取待檢測樣品的基因組；
[0017] 2)加待檢測樣品、所述內引物、外引物、和環引物，以及加焚光染料I后構成反應體 系，進行環介導恒溫擴增；
[0018] 3)檢測擴增產物。
[0019] 在其中一個實施例中，SEQID N0.1、SEQID N0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID 從).5的濃度比為8:8:1:1:4。
[0020] 在其中一個實施例中，SEQID N0.1、SEQID N0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID NO. 5 在反應體系中的濃度分別為 1.6ymol/L、1.6ymol/L、0.2ymol/L、0.2ymol/L、0.8ymol/ L〇
[0021] 本發明具有以下優點:本發明針對熱帶念珠菌5.8S和26S rRNA基因之間的ITS2區 序列設計篩選得到特異性的LAMP引物，對熱帶念珠菌的靶標基因具有很好的擴增效率。對 非熱帶念珠菌進行ReaLamp的擴增，均未出現非特異性的擴增，說明該引物對熱帶念珠菌有 較好的擴增能力。而且，本發明所述的實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑 盒靈敏度高，擴增引物對純培養物中的熱帶念珠菌的靈敏度可達到1.28pg/ul。進行重復性 試驗，結果顯示具有很好的重復性。本發明所述的實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念 珠菌的試劑盒即檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好，操作簡單、快捷、便于批量檢 測等特點，為熱帶念珠菌的檢測提供了新的發展方向。此外，本發明采用熒光染料I，可對其 擴增過程進行實時監控;另外本發明采用恒溫擴增，不需熱循環儀，對儀器的要求不高。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例3中環引物加快反應速度驗證實驗的結果示意圖；
[0023] 圖2為實施例4中熱帶念珠菌特異性檢測實驗結果示意圖；
[0024] 圖3為實施例5中熱帶念珠菌靈敏度檢測實驗結果示意圖；
[0025] 圖4為實施例6中熱帶念珠菌重復性檢測實驗結果示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 本發明針對熱帶念珠菌5.8S和26S rRNA基因之間的ITS2區序列設計引物，從中篩 選到5條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下恒溫反應60min， 通過對熒光信號的實時監測來判斷熱帶念珠菌基因是否有擴增。
[0027]應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例 中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室 手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0028]菌株來源:菌株由廣州醫科大學附屬第三醫院檢驗科微生物室分離、VITEK 2全自 動微生物鑒定儀鑒定并于_70°C保存。
[0029]實驗用菌株如下：白色念珠菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌、糞腸球菌、金黃色 葡萄球菌、無乳鏈球菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、馬爾尼非青霉菌、克柔念珠菌。
[0030] 主要儀器與試劑：
[0031 ]儀器：實時焚光恒溫擴增儀（Applied Biosystems 7500)，Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度計，VITEK 2全自動微生物鑒定儀，超凈工作臺，EP管，微型離 心機，加樣槍，振蕩器，水浴鍋。
[0032]試劑:細菌基因組DNA提取試劑盒，真菌基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技 有限公司），DNA擴增試劑盒(購自廣州迪澳生物科技有限公司），超純水等。
[0033] 實施例1
[0034] 本發明的實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒中的引物如表1所 示。該引物根據熱帶念珠菌5.8S和26S rRNA基因之間的ITS2區序列，利用Primer Explorer V4軟件設計。引物序列由英濰捷基上海貿易有限公司合成提供。
[0035] 表1熱帶念珠菌ReaLamp檢測體系引物
[0036]
)
[0037]該檢測試劑盒中還包括鏈置換DNA聚合酶，常規PCR反應液等。
[0038]本實施例選擇的熒光染料為熒光染料I。
[0039] 實施例2
[0040]本發明采用環介導恒溫擴增技術擴增熱帶念珠菌5.8S和26S rRNA基因之間的 ITS2區序列，實時熒光檢測結果。其中，熒光染料I在反應前加入，避免反應后開蓋加染料引 起氣溶膠污染造成假陽性。
[0041 ]具體操作步驟如下：
[0042] 2.1基因組DNA提取：
[0043] 1)將熱帶念珠菌接種于血平板上，在37°C溫箱中培養18-24小時；
[0044] 2)用棉簽挑取平板上適量單菌落與無菌生理鹽水混合，使其麥氏濁度在3.0-4.0 之間，取所得菌液lml，按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行后續操作；
[0045] 3)同理，其他實驗用菌株按以上操作方法進行基因組DNA的提取。
[0046] 2.2、環介導恒溫擴增：
[0047] 1)分別將實施例1中所述的？1?、81?、？3、83、1^按照8:8:1 :1:4濃度比混合，加入適 量的超純水，形成總體積為70μ1的含環引物的引物工作液S1;同理，以相同濃度比，不加入 LF，配置成不含環引物的引物工作液S2,使上述引物加入LAMP反應體系后濃度分別達到1.6 ymol/L、1·6ymol/L、0·2ymol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L;
[0048] 2)利用步驟1)中配好的引物工作液，按照表2配制LAMP反應體系（在加入超純水、 反應液、Bst聚合酶、引物工作液、DNA模板后，先加入20μ1密封液，最后再加入熒光染料I)。 反應過程在實時熒光恒溫擴增儀中進行，反應溫度為63°C，反應時間為60min;
[0049] 表2:ReaLamp的反應體系
[0050]
[0051] 3)從儀器導出數據后，作歸一化處理，使曲線經過4min時的最低點，但不改變曲線 形狀和趨勢，再用GraphPad Prism 5軟件制作曲線圖。每次試驗均設置ddH20為陰性對照； [0052] 4)反應結束后，觀察擴增曲線，若出峰，則為陽性。
[0053] 實施例3
[0054] 根據實施例1的引物(SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5)構成的試劑盒，按照實施例2中 的反應條件進行擴增，分析檢測信號，進行環引物加快反應速度的驗證：
[0055] 1)根據實施例2中基因組DNA提取方法提取熱帶念珠菌DNA，作為DNA模板；
[0056] 2 )將實施例2中所述的含環引物的工作液S1和不含環引物的工作液S 2加入 ReaLamp反應體系中，分別設置以下組別：加入S1但不加 DNA模板;加入S2但不加 DNA模板;加 入S1且加 DNA模板;加入S2且加 DNA模板。觀察各組的起峰與達到頂峰的時間，驗證環引物能 否使反應速率加快。
[0057] 檢測結果：由圖1可看出，在反應進行約18min時，加入DNA模板和含環引物的工作 液S1的反應體系開始出峰，并于30min左右達到最大峰值，而其他對照組別在反應過程中無 明顯變化，因此無假陽性現象出現，從而得出結論:加入環引物可以使反應速度顯著加快。
[0058] 實施例4
[0059]分別根據實施例2中基因組DNA提取方法提取其他常見病原菌（白色念珠菌、化膿 性鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、光滑念珠菌、馬爾尼 非青霉菌、克柔念珠菌）的DNA，根據實施例1中的引物（SEQIDN0.1-SEQIDN0.5)構成的 試劑盒，按照實施例2中的反應條件進行擴增，分析檢測信號，評價該引物的特異性。
[0000] 檢測結果：由圖2結果看，在約15min時，熱帶念珠菌實驗組開始起峰，在約25min時 達到峰值，而其他菌未起峰(雖然在約5min時，奠腸球菌有起峰趨勢，但其最終未能起峰）， 說明該引物不與熱帶念珠菌以外的菌發生交叉反應，其檢測熱帶念珠菌的特異性強。
[0061 ] 實施例5
[0062] 1)用lyL TE溶液對Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度計校準調零 后，對所提取的熱帶念珠菌DNA進行濃度分析，測得其濃度；
[0063] 2)取5yL熱帶念珠菌DNA原液，用超純水進行10倍梯度稀釋6次，得到7份不同濃度 的DNA模板溶液，根據實施例1中的引物(SEQ ID N0.卜SEQ ID N0.5)構成的試劑盒，按照實 施例2的檢測方法，分別將這些DNA模板加入反應體系中進行DNA擴增，觀察各濃度DNA反應 體系的擴增曲線，對其靈敏度進行分析。
[0064]檢測結果：熱帶念珠菌的DNA濃度測量結果為12.8ng/ul，濃度相對較低;稀釋6次 后所得溶液濃度分別為 12 · 8 X 10- (-1 )ng/ul，12 · 8 X ΚΓ (_2)ng/ul，12 · 8 X 1(T (_3)ng/ul， 12.8Xnr(-4)ng/ul，12.8Xl(T(-5)ng/ul，12.8Xl(r(-6)ng/ul;由圖3可看出，各濃度反 應體系所得曲線起峰時間與最大峰值出現的時間大致依照濃度梯度逐一出現，直至第四次 稀釋濃度為止，因此本實驗靈敏度可達1.28pg/ul。
[0065] 實施例6
[0066] 根據實施例1中的引物(SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5)構成的試劑盒，按照實施例2 的檢測方法，對熱帶念珠菌進行3次重復實驗，設置陰性對照，觀察熱帶念珠菌的三次實驗 結果曲線是否重疊。由圖4可看出，在反應進行至約15min時，三份陽性樣品同時出峰，在約 25min時，三份樣品同時達到峰值，三條擴增曲線趨勢相近，可見，熱帶念珠菌ReaLamp實驗 重復性較好。
[0067] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0068] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種實時熒光環介導恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒，其特征在于，包括有序 列組成為SEQIDN0.1和SEQIDN0.2的內引物，序列組成為SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引 物，序列組成為SEQIDN0.5的環引物。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括有熒光染料I。3. -種檢測熱帶念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列組成為SEQID NO. 1和SEQID N0.2的內引物，序列組成為SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列組成為SEQIDN0.5的 環引物。4. 一種檢測熱帶念珠菌的方法，其特征在于，采用權利要求1-2任一項所述的試劑盒， 主要包括以下步驟： 1) 提取待檢測樣品的基因組； 2) 加待檢測樣品、所述內引物、外引物、和環引物，以及加熒光染料I后構成反應體系， 進行環介導恒溫擴增； 3) 檢測擴增產物。5. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQIDN0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID N0.5的濃度比為8:8:1:1:4。6. 根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID 腸.5在反應體系中的濃度分別為1.6以111〇1/1、1.6以111〇1/1、0.24 mol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L〇
【文檔編號】C12R1/74GK105838824SQ201610407728
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】郭旭光, 劉慶鋒, 何淑君, 黃美淦, 吳健健, 夏勇
【申請人】廣州醫科大學附屬第三醫院