一種白色念珠菌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種白色念珠菌（CA-DNA）檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應液中包含用于CA-DNA檢測的引物和探針序列如下，CA-DNA上游引物：CTCGTAGTTGAACCTTGG，CA-DNA下游引物：GCCTGCTTTGAACACTCT，CA-DNA探針：TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。使用本發明的試劑盒檢測白色念珠菌的靈敏度高，定量線性范圍寬；應用該試劑盒可以對血液、痰液、肺泡灌洗液等培養物中的CA-DNA進行快速準確的檢測，為診斷白色念珠菌感染提供可靠的實驗依據。
【專利說明】一種白色念珠菌檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明提供一種白色念珠菌檢測試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的CA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]白色念珠菌(Canidia Albicans，CA)是寄居在正常人體消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜上的菌群，也是念珠菌屬中最常見的一種條件致病菌。近年來，由于免疫抑制劑的大量應用，腫瘤放療、化療，侵入性治療和器官移植的開展，以及大量廣譜抗生素的廣泛應用導致正常菌群失調，白色念珠菌的感染率和發病率較以往有明顯的增加。
[0003]白色念珠菌感染作為一種常見的侵襲性真菌感染，具有危害大，病程進展快，預后差，給感染者的身體健康甚至生命帶來嚴重威脅等特點，臨床上主要通過直接涂片鏡檢、組織病理學方法、影像學方法、血清學方法等檢測白色念珠菌的感染，傳統的培養鑒定方法和組織病理學方法是診斷侵襲性真菌感染的金標準。但血培養和涂片直接鏡檢陽性率較低；組織病理學方法為確診的重要手段，但需要進行有創操作，對于白血病化療、粒細胞極低甚至缺乏的患者無疑會提高感染的風險，臨床應用具有局限性；高分辨率CT對侵襲性真菌感染特別是肺部真菌感染的診斷具有一定的臨床價值，但影像學表現較臨床表現有延遲，而且特異性差、無法作為真菌感染確診證據。
[0004]近年來以DNA為基礎的PCR分子生物學檢測方法因快速、準確而倍受關注，成為探索的熱點，主要包括巢式PCR (nest PCR)、實時突光定量PCR (real-time fluorescencequantify PCR)等。由于實時熒光定量PCR在速度、操作、特異性等多方面存在眾多優勢，因此臨床上其中白色念珠菌感染早期診斷領域的應用愈加廣泛，給臨床診斷和治療帶來了重要的指導意義。
[0005]運用熒光PCR技術檢測白色念珠菌DNA主要包括白色念珠菌核酸提取和核酸PCR擴增兩方面。
[0006]目前國內臨床上主要采用機械破碎法對白色念珠菌核酸進行提取:先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，反復高速震蕩和高速離心，再取上清為模板。該方法優點在于對于樣本中的PCR抑制物去除較徹底，但存在步驟繁瑣，操作時間長，對于操作人員技術水平要求高和需添置專門的設備等不足之處。
[0007]臨床上檢測CA-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進，實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發出的熒光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉移效應，熒光報告基團發出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。
[0008]目前國外已有基于實時熒光定量PCR技術檢測CA-DNA的試劑盒，但這些試劑盒的核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低。且其檢測靈敏度不高，某些弱陽性樣本經常無法擴增。這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系，還需要進一步完善和提高技術水平，使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。另外，受限于現有技術中針對CA-DNA檢測的引物探針序列，本領域還需要開發出一種檢測CA-DNA特異性好且綜合性能優良的PCR檢測試劑盒。

【發明內容】

[0009]本發明提供一種核酸釋放劑在白色念珠菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
[0010]在本發明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩沖液。本發明首次披露在CA檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。
[0011]本發明提供一種白色念珠菌(CA-DNA)檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用于CA-DNA檢測的引物和探針序列如下，
[0012]CA-DNA 上游引物:CTCGTAGITGAACCTTGG，
[0013]CA-DNA 下游引物:GCCTGCITTGAACACTCT，
[0014]CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
[0015]使用本發明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而本發明中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發明試劑盒檢測CA的靈敏度高，定量線性范圍寬。另外，本發明的試劑盒因采用用于檢測靶多核苷酸的上述引物和探針序列，具 有很好的特異性。
[0016]本發明中，優選所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用于檢測內標的引物和探針序列，
[0017]內標:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG ；
[0018]內標上游引物:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC，[0019]內標下游引物:GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG，
[0020]內標探針:TGCGTTAACAATITITTCCACAAAA。
[0021]本發明中所述內標為插入pUC18T載體的一段長為93堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性。
[0022]優選本發明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物污染的作用，從而防止樣本檢測假陽性。 [0023]在一個【具體實施方式】中，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CA定量參考品、CA陽性對照、CA陰性對照和CA濃縮液。
[0024]本發明還提供一種白色念珠菌CA-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用于CA-DNA檢測的引物和探針序列如下，
[0025]CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG，
[0026]CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
[0027]CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
[0028]本發明提供的白色念珠菌熒光定量PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬，應用該試劑盒可以對血液、痰液、肺泡灌洗液等培養物中的CA-DNA進行快速準確的檢測，為診斷白色念珠菌感染提供可靠的實驗依據。
【具體實施方式】
[0029]以下僅為本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不局限于此，任何本領域的技術人員在本發明公開的技術范圍內，可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以權利要求書的保護范圍為準。
[0030]另外，如未做特殊交待，則本發明中的百分含量指質量百分含量。
[0031]實施例1
[0032]本實施例提供一種具體的白色念珠菌檢測試劑盒，它包括如下組分:
[0033]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.lmmol/L,氯化鉀100mmol/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%，0.1%的乙醇和溶劑TE緩沖液。
[0034]②內標(陽性內對照):為插入PUC18T載體的一段長為93堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，濃度為2.00E+05copies/ml,93堿基對的序列為:
[0035]5， -GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG-3’ ；
[0036]③PCR反應液:包括10XPCR反應緩沖液5 μ 1，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物均為0.3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測的探針為0.3 μ mol/L,用于內標片段擴增的上下游引物均為0.lymol/L，用于檢測內標的探針為0.lymol/L。其中，所述10XPCR反應緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP ;所述用于靶多核苷酸擴增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測的探針是源于白色念珠菌核酸的保守區域的引物和探針，其堿基序列分別為:
[0037]CA-DNA 上游引物:5 ’ -CTCGTAGTTGAACCTTGG-3 ’，
[0038]CA-DNA 下游引物:5，-GCCTGCTTTGAACACTCT-3，，
[0039]CA-DNA 探針:5，-TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT-3，；
[0040]所述的用于檢測內標的引物探針序列分別為:
[0041 ]內標上游引物:5 ’ -GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC-3，，
[0042]內標下游引物:5’ -GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG-3，，
[0043]內標探針:5’-TGCGTTAACAATITITTCCACAAAA-3’。
[0044]④酶混合液:包含5U/ Ul的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.1U/ Ul的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0045]⑤CA定量參考品:來源于使用CA企業定量線性參考品LI~L5定值后的CA強陽性質粒，該定量參考品包括A、B、C、D四個濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為1.00~
5.00E+06CFU/ml (A)、1.00 ~5.00E+05CFU/ml (B)、1.00 ~5.00E+04CFU/ml (C)、1.00 ~5.00E+03CFU/ml (D)。
[0046]⑥CA陽性對照:為臨床醫院收集的CA強陽性樣本，其濃度為1.00~5.00E+05CFU/ml。
[0047]⑦CA陰性對照:為滅菌生理鹽水。
[0048]⑧CA濃縮液:聚乙二醇6000 (PEG_6000)10~100mmol/L (質量/體積)，氯化鈉50~500mmol/L (質量/體積)。
[0049]實施例2
[0050]本實施例提供上述實施例1所述試劑盒用于檢測血液、痰液、肺泡灌洗液培養物等未知樣本中CA-DNA的操作步驟:
[0051]一、試劑準備
[0052]根據待測樣本、CA陰性對照、CA陽性對照以及CA定量參考品A~D的數量，按比例取相應量的PCR反應液(38 Ul/人份)、酶混合液(2 Ul/人份)及內標1 Ul/人份，充分混勻成PCR-mix ;瞬時離心后備用。
[0053]二、核酸提取
[0054]1.待測樣本:取100 U I待測樣本，加入CA濃縮液100 U 1，振蕩混勻后12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉淀中加入50 U l核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，100°C處理IOmin, 12000r/min離心3min,作為待測樣本備用。
[0055]2.CA陰性對照、CA陽性對照、CA定量參考品:CA陰性對照、CA陽性對照、CA定量參考品A~D分別取10 Ul與10 Ul核酸釋放劑混勻待用。
[0056]三、向PCR反應管中加樣
[0057]每個PCR反應管中加入上述第二步驟中處理后的待測樣本、CA陰性對照、CA陽性對照以及CA定量參考品A~D各10 Ul ;靜置10分鐘后，每管加入步驟一中的PCR-mix40 u 1，吸打混勻2-3次，去除氣泡后蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0058]四、熒光PCR反應與結果分析(在熒光定量PCR擴增儀上進行)
[0059]1)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度。
[0060]2)突光檢測通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測CA ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測內標；參比突光(PassiveReference)設置為 none。
[0061]3)熒光定量PCR反應條件見表1:
[0062]表1
[0063]
【權利要求】
1.一種核酸釋放劑在白色念珠菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2% 和乙醇 0.05 ~1%。
2.一種白色念珠菌CA-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.Smmol /I,,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用于CA-DNA檢測的引物和探針序列如下， CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG， CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用于檢測內標的引物和探針序列，
內標:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG ； 內標上游引物:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC， 內標下游引物:GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG， 內標探針:TGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAA。
4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。
5.根據權利要求2~4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CA定量參考品、CA陽性對照、CA陰性對照和CA濃縮液。
6.一種白色念珠菌CA-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用于CA-DNA檢測的引物和探針序列如下， CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG， CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
【文檔編號】C12Q1/04GK103740834SQ201410017428
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】戴立忠, 張操昊, 鄧中平 申請人:湖南圣維爾醫學檢驗所有限公司